Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

Published: December 6, 2011 doi: 10.3791/3311
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Lausanne, 2Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

في الفئران ، هو أساسا بوساطة القدرة على كشف الفيرومونات بواسطة الجهاز الميكعي (VNO). هنا ، وصفت شريحة الأنسجة الحادة إعداد VNO لأداء التصوير الكالسيوم. يسمح هذا النهج الفسيولوجية ملاحظات المجموعات السكانية الفرعية و / أو الخلايا العصبية الفردية في الأنسجة الحية وغير مناسب لمستقبلات يجند تحديد الهوية.

Abstract

وتستخدم بيتر Karlson Lüscher مارتن فرمون الأجل للمرة الأولى في عام 1959 من 1 إلى وصف المواد الكيميائية المستخدمة في داخل الأنواع الاتصالات. الفيرومونات متقلبة وغير متقلبة قصيرة الأجل جزيئات 2. يفرز و / أو وارد في السوائل البيولوجية 3،4 ، مثل البول وسائل معروفة لتكون المصدر الرئيسي للالفيرومونات 3 متورط Pheromonal الاتصالات في مجموعة متنوعة من طرائق الحيوانية الرئيسية مثل التفاعلات 5،6 القربى ، والمنظمات الهرمية (3) والتفاعل الجنسي 7،8 وبالتالي فهي مرتبطة مباشرة مع بقاء نوع معين 9،10،11. في الفئران ، هو أساسا بوساطة القدرة على كشف الفيرومونات بواسطة الجهاز الميكعي (VNO) 10،12 ، بنية الاقتران يقع في قاعدة تجويف الأنف ، والمغلقة في كبسولة الغضروفية. كل VNO وقد شكل أنبوبي مع تجويف 13،14 السماح للاتصال الخارجيالكيميائية العالم. وتتألف أساسا من الخلايا العصبية الحسية الظهارة العصبية القطبين الميكعي الحسية (VSNs) 15. كل VSN يمد تغصن واحدة لتنتهي في التجويف مقبض شجيري كبيرة تحمل ما يصل الى 100 ​​الزغيبات الصغيرة المتورطين في الكشف عن المواد الكيميائية 16. العديد من المجموعات السكانية الفرعية VSNs موجودة. ومتباينة من قبل مستقبلة كيميائية وبالتالي أنها تعبر ربما عن طريق ليجند (ق) يعترفون 17،18. وتتألف عائلة مستقبلات الرئيسيان الميكعي ، وV1Rs V2Rs 19،20،21،22 ، على التوالي 240 23 و 120 من 24 عضوا ، ويتم التعبير عنها في طبقات منفصلة من الظهارة العصبية. المستقبلات الشمية (ORS) 25 ومستقبلات الببتيد فورميل (FPRs) وأعرب أيضا عن 26،27 في VSNs.

اذا كانت هذه المجموعات السكانية الفرعية العصبية استخدام نفس المسار يشير المتلقين للاستشعار عن الفيرومونات غير معروف. على الرغم من الدور الكبير الذي لعبته قناة الكالسيوم نفاذية - (وقد TRPC2) موجودة في الزغيبات الصغيرة من الخلايا العصبية الناضجة 28 TRPC2 قنوات مستقلة تنبيغ اقترح 6،29. نظرا لارتفاع عدد المجموعات السكانية الفرعية العصبية والتشكل غريبة من الجهاز ، والتحقيقات الدوائية والفيزيولوجية من العناصر الموجودة في إشارة VNO معقدة.

هنا ، نقدم شريحة الأنسجة الحادة إعداد الماوس VNO لإجراء تحقيقات التصوير الكالسيوم. يسمح هذا النهج الفسيولوجية الملاحظات ، في البيئة الطبيعية من الأنسجة الحية ، من المجموعات السكانية الفرعية العامة أو الفردية VSNs تحميلها مسبقا مع Fura ، 02:00 ، صبغة الكالسيوم. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لدراسة أي مستقبلات فرمون GFP الموسومة ويمكن تكييفه لاستخدام المجسات الأخرى الكالسيوم الفلورسنت. كمثال على ذلك ، ونحن نستخدم هنا ماوس VG الخط 30 ، وهو ما يرتبط في ترجمة مستقبلات V1rb2 فرمون إلى التعبير من خلال تبني إستراتيجية GFP متعدد المقارين.

Protocol

1. تشريح الماوس VNO

  1. استخدام الفئران البالغين. كما تورط في الاستشعار عن فرمون multimodalities ، تمييز دقيق بين السلالات ، والمورثات ، الجنسين والأعمار مهم ، وسوف تؤثر على النتائج. هنا ، اخترنا الكبار الفئران VG 30 التي سبق استخدامها لتحديد هوية من زوج فرمون مستقبلات (2 - heptanone - V1rb2) 31 (الشكل 1A).
  2. قبل البدء في التشريح ، وإعداد الباردة اصطناعية جديدة السائل الشوكي الدماغي (ACSF ؛ كلوريد الصوديوم 118 ملم ، 25 ملم NaHCO 3 ، D - الجلوكوز 10 ملم ، 2 ملم بوكل ، MgCl 2 2 مم ، ناه 2 ص 4 1.2 مم ، CaCl 2 2 مم ؛ الرقم الهيدروجيني 7.4) مشبعة oxycarbon (95 ٪ O 2 : 5 ٪ CO 2). لذلك ، مزيج جميع المكونات ما عدا ACSF CaCl 2. تشبع الحل بواسطة محتدما مباشرة مع oxycarbon. في النهاية ، إضافة 2 CaCl وضبط مع DDH 2 0 لحجم المطلوب. يبقي الحل ACSF على الجليد حتى شحد ذاتها.
  3. القتل الرحيم ينبغي القيام به من الفأرة بشكل تفضيلي من قبل خلع عنق الرحم أو عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون 2 قبل التجربة.
  4. قطع رأس الفأر. وضعه تحت مجهر تشريح في ACSF الباردة oxycarbonated باستمرار.
  5. قطع الفك السفلي وموقف رئيس لتصور الحنك (1B الشكل).
  6. إجراء شق أفقيا في الجزء العلوي من الحلق (الشكل 1B) مع المقص الصغير وإزالة غشاء الحنك مع ملقط تشريح الصغرى. هيدرات وتنظيف تجويف يتعرض مع ACSF (الشكل 1C).
  7. قطع العلوي والجزء السفلي من الحاجز الأنفي (الشكل 1C). استخراج بدقة الحاجز الأنفي الذي يحتوي على VNO وضعه مباشرة في ACSF على الجليد (الشكل 1D).
  8. منفصلة رأسيا في جزأين من VNO باستخدام ملقط تشريح الدقيقة بدقة وإزالة الكبسولة الغضروفية من VNO (التين. 1E). تأكد من أن تتم إزالة جميع القطع الغضروفية.

2. VNO إعداد شريحة الأنسجة

شريحة الأنسجة VNO إعداد الموصوفة في هذا المقطع 2) أساسا للتحقيقات التصوير الكالسيوم. ويمكن أيضا أن تستخدم شرائح VNO لimmunohistostainings على شرائح عائمة للتحقق من السلامة الهيكلية للنسيج (انظر القسم 3) من البروتوكول).

  1. تعد منخفضة ذوبان آغار (3 ٪ في برنامج تلفزيوني قياسي) ومكان العمل الخاص بك. ستحتاج ACSF ، مشراح ألف وتدعم الصغرى ، وملقط تشريح ، تضمين القوالب (22 × 22 × 20 ملم) ، وتقضي على الدقة ، وفرش ، وألواح زراعة الأنسجة ، وcyanacrylat الغراء ، والثلج والحرارة ملف.
  2. ملء القالب التضمين مع آغار منخفضة الذوبان 3 ٪. تأكد من أن درجة الحرارة ليست أعلى من 41 درجة مئوية قبل ان يضع عموديا VNO محو قريبا (الشكل 2A) لتكون قادرة على الحصول على شرائح الاكليلية.
  3. مكان القالب التضمين على الجليدل1 دقيقة حتى تجمد ومن ثم فصلها عن كتلة آغار. خفض كتلة أجار في شكل هرمي ووضعه مع الغراء على دعم مشراح (الشكل 2B).
  4. قطع شرائح VNO الاكليلية مع مشراح ، مع سرعة 0.5 مم / ثانية ، وسعة 0.7 مم وسماكة 100 ميكرون في ACSF الباردة وجمع شرائح الأنسجة بفرشاة قبل وضعها في نسيج الثقافة وحة مليئة الباردة ACSF.
  5. إذا كان لديك تحتوي على شرائح مضان الذاتية مثل GFP (الجينات المستهدفة في الخلايا العصبية) يمكن تحديدها بموجب stereomicroscope الفلورسنت (الشكل 2C).

3. المناعية على شرائح VNO العائمة

الهدف من هذا الإجراء هو للتحقق من سلامة شرائح الأنسجة VNO حصل في الفرع 2). الأسيتيل - تويولين هو علامة أنيبيب / الهيكل الخلوي والتشعبات التي أعرب عنها في الزغيبات الصغيرة من الخلايا العصبية الحسية VNO. للتجارب التصوير الكالسيوم ، انتقل directly إلى القسم 4) من البروتوكول. ويمكن تكييف أسلوب immunohistostaining على شرائح VNO عائمة لتقييم التعبير عن أي بروتين من الفائدة. لهذا الغرض ، ونحن ننصح للإصلاح VNO 1H عند 4 في حل تثبيتي درجة مئوية (بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.6) نقطة بعد 1.7) من البروتوكول ، واستخدامها من هذه النقطة في برنامج تلفزيوني الحموضة بدلا من 7.6 ACSF الحل.

  1. في نسيج لوحة الثقافة ، وإصلاح شرائح اهتمامك في حل تثبيتي (بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.6) 1H في 4 درجات مئوية.
  2. كتلة شرائح الأنسجة الخاص بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني NGS (الماعز مصل طبيعي) 10 ٪ ، وتريتون X - 100 بنسبة 0.5 ٪.
  3. احتضان شرائح مع الجسم المضاد الأولي (المضادة للالأسيتيل - تويولين ، الفأر ، 1:2000) ل16H في درجة حرارة الغرفة (RT) في محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني NGS 5 ٪ ، وتريتون X - 100 عند 0.25 ٪.
  4. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني يتضمن حلا NGS 2 ٪.
  5. احتضان في الظلام مع سيكوndary الأضداد (Cy5 ، مترافق عنزة مكافحة الفأر ، 1:200) في محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني NGS 2 ٪ لل1H في RT.
  6. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني يتضمن NGS 2 ٪ ، 1 ٪ PBS NGS وبرنامج تلفزيوني فقط.
  7. جبل الشرائح الخاصة بك في وسائل الاعلام الفلورسنت تركيب (أو لا تحتوي على دابي) عن طريق وضعها في وسط مناطق محددة مسعور (استخدام قلم مسعور) وتغطية شرائح مع coverslips.
  8. إبداء الملاحظات والاستحواذ مع المجهري مبائر وبرامج إعادة البناء السماح 3D (الشكل 2D - F).

4. تصوير الكالسيوم على شرائح VNO

  1. وسوف تتخذ الإجراءات التالية في مكان مظلم. احتضان شرائح VNO عن 1H عند 37 درجة مئوية في محلول مكون من تحميل ACSF الباردة مع Fura ، 02:00 (7 ميكرومتر ؛ محلول المخزون من 1 ملم في DMSO) وpluronic 0.1 ٪ (W / V ؛ حل السهم عند 20 ٪ في DDH 2 O).
  2. الحفاظ على شرائح تحميلها على الجليد مع oxycarbonation حتى الاستخدام. يمكن الاحتفاظ به لشرائح تحميل3 - 4H.
  3. ضع شرائح محملة فرشاة في غرفة تحتوي على نضح ACSF والحفاظ على شرائح بمنديل مرساة شريحة (الشكل 3A).
  4. مكان الغرفة نضح على مرحلة من مراحل التصوير الكالسيوم المجهر (الشكل 3B) ، ويروي باستمرار مع ACSF oxycarbonated في RT. ويمكن تكييف درجة الحرارة مع استخدام وحدة تحكم في درجة الحرارة بين القطبين.
  5. يتم تنفيذ ملاحظات شرائح VNO تحميل (الشكل 3C - E) مع مجهر an مضان مقلوب ، مع الهدف 25x 63x او بارد والكاميرا SNAP - HQ. يتم إنارة بالتسلسل (340 / 380 نانومتر) مع أداة polychromator وسجلت بمعدل 5Hz. يتم تصفيتها الانبعاثات بنحو 510 نانومتر. ويتم رصد التغيرات داخل الخلايا نسبة الكالسيوم (340 = ΔF nm/380 نانومتر) مع البرامج المناسبة.
  6. يجب أن يكون محددا وفقا للغرض Chemostimulation التجريبية الخاصة بك. هنا ، من perfusions ACSF تحتوي على فرمون متاسعا (isobutylamine ، 2 - heptanone ، 4 - heptanone ، 2 heptanol ، pentylacetate ، dimethylpyrazine ، α / β farnesene ، 10 -6 م) ، 2 - heptanone (10 -6 م) حديثا أو التي تم جمعها من الذكور والإناث (1 : 1) يتم تنفيذها البول الماوس (1:100) 32. يستخدم نضح من ATP (125 ميكرون) بمثابة اختبار جدوى في نهاية التجارب (الشكل 3F) ، وينبغي أن تشير إلى وجود نسبة من الخلايا العصبية حوالي 80 ٪ قابلة للحياة. في ظل هذه الظروف ، يمكن استخدام شرائح لتصل إلى 2 ساعة.
  7. هي تصور المجموعات السكانية الفرعية GFP الموسومة من الخلايا العصبية الحسية الإضاءة محددة (هنا V1rb2 معربا عن الخلايا العصبية) ، ويمكن تحليلها بدقة (الشكل 3G - I).

5. ممثل النتائج :

لإنشاء مقايسة وظيفية للتحقيق في مسارات متعددة تنبيغ تجري في VNO الماوس ، أو في تحديد هوية جديدة فرمون مستقبلات أزواج ، وعلينا أن نستفيد من خط الماوس VG (الشكل 1A (الشكل 1E) ، ونحن نستعد الحاد شرائح VNO (الشكل 2C). نحن إصلاح جزء منها ، من أجل التحقق من صحة وسلامة نسيجي إعداد قبل تنفيذ immunohistostainings ضد بروتين الأسيتيل - تويولين (الشكل 2D - F). يستخدم جزء آخر من الشرائح للتجارب التصوير الكالسيوم. لذلك ، يتم تحميل الشرائح مع Fura ، 02:00 (الشكل 3C - E) ويتم مراقبة مستوى الكالسيوم داخل الخلايا العصبية في كل كنسبة ΔF (الشكل 3F). يتم تقييم الجدوى من الخلايا العصبية التي نضح للاعبي التنس المحترفين (125 ميكرون) ، وبعد ذلك يتوقع زيادة سريعة وعابرة لنسبة ΔF (الشكل 3F). البول كونها مصدرا رئيسيا من الفيرومونات ، نضح من الطازجةويستخدم البول لاي الماوس جمعها (1:100) كعنصر تحكم الذاتية. فإنه يتسبب العابرين الكالسيوم في حوالي 50 ٪ من الخلايا العصبية المسجلة (خلية 1 و 2 ، الشكل 3F). تحت إضاءة GFP ، يمكن ملاحظتها V1Rb2 الخلايا العصبية الإيجابية ، ونضح من يجند لها pheromonal المعروفة ، 2 - heptanone ، يبدأ التنشيط الخلوي (الخلية 1 ، الشكل 3I). ومن المثير للاهتمام ، يمكن ملاحظتها أيضا التنشيط العصبية في جزء من الخلايا العصبية التي لا تعبر عن مستقبلات V1Rb2 (العصبونات GFP السلبية) (خلية 2 ، الشكل 3I) ، مما يدل على تعقيد فرمون ترميز في VNO.

الشكل 1
الشكل 1. تشريح الماوس الميكعي الجهاز. (أ) الماوس من خط VG. (ب) بعد القتل الرحيم من الماوس ، يتم وضع الرأس الكامل تحت المجهر مجهر وتتم إزالة الفك السفلي من أجل تصور الحنك. ويتم شق صغير الأفقي(أسود خط متقطع). (C) بعد إزالة الحنك ، هو قطع الحاجز الأنفي واصطف مع VNO في الجزء العلوي والجزء السفلي (أبيض الخطوط المتقطعة) لتسهيل استخراج VNO. (D) ويوضع في محلول VNO ACSF والمنفصلين (إدراج : ارتفاع عرض القوة من جزأين). (E) هو إزالة بدقة الكبسولة الغضروفية من VNO ، ويستخدم VNO دون كبسولة بها الغضروفية لبقية التجارب. أشرطة النطاق هي : BE ، 1 ملم.

الشكل 2
الشكل 2. ماوس الميكعي إعداد شريحة والنزاهة نسيجي حاد. (أ) مضمن عموديا والماوس VNO في محلول الآجار 3 ٪. يجب أن تكون درجة حرارة أقل من أن يكون أجار درجة مئوية 41 (B) هو خفض كتلة أجار في شكل هرمي ، ويتم إنشاء أقسام VNO 100 ميكرون (أسود خط متقطع) في ACSF. يمكن (C) يتم اختيار شرائح VNO تحت stereomicroscope الفلورية من أجل تصور محددالسكان من الخلايا العصبية الحسية المفتاحية. يمكن (مدافع) يتم تقييم سلامة نسيجي بواسطة immunohistostainings ضد بروتين الأسيتيل - تويولين ، وهو رأي أعلى سلطة في الخلايا العصبية التي تستهدف الجين V1rb2 تثبت الحفظ الكمال من الإعداد. ويمكن ملاحظة الخلايا العصبية مع التشعبات الطويلة المدى سطح التجويف (E) ، وكذلك التعبير عن هذا البروتين الهيكلي في المقابض الشجيرية والزغيبات الصغيرة (F). أشرطة النطاق هي : B ، 5 مم و C ، و 60 ميكرون ، D ، و 40 ميكرومتر ؛ EF و 20 ميكرون.

الشكل 3
التصوير الكالسيوم الرقم 3. وكشف فرمون في الميكعي شرائح الأنسجة الحادة. (أ) بعد المرحلة Fura ، 02:00 التحميل ، توضع شرائح VNO نضح في غرفة وتجري مع تكييفها لمستثمر رئيسي (عرض عالية الطاقة). وperfused باستمرار (B) يتم تنفيذ التجارب في الظلام وشرائح VNO مع ACSF على RT مع نظام فراغ. يمكن أن تكون درجة الحرارة chosان استخدام نظام تحكم في درجة الحرارة مكونة من عنصر بللوتيه القطبين وتحقيق الحرارية. وقد أجريت هذه التجربة على وجه الخصوص RT. (م) يمكن ملاحظتها شرائح VNO تحت النقيض المرحلة هوفمان (C ، HV) أو Fura إنارة 380 نانومتر قبل (D) ، وخلال تنشيط الخلايا العصبية (E ، هنا مع ATP). (F) يتم تقييم الجدوى متعلق بالخلايا العصبية مع نضح لاعبي التنس المحترفين (125 ميكرون). هنا ، يتم chemostimulation مع البول (البول ، 1:100) أو مع مزيج من الفيرومونات الماوس (درجة الحموضة مزيج ، 10 -6 م) بمعدل تدفق مستمر من 165 مل / ساعة. يمكن تسجيل مستويات الكالسيوم داخل الخلايا (ΔF) فردي لكل خلية (خلية 1 إلى 3). (ز) عصبون V1Rb2 هو تصور تحت إضاءة GFP (1). (H) ويرد تحميل هذه الخلايا العصبية (1) فضلا عن الخلايا العصبية غير V1rb2 معربا عن (2). (I) والخلايا العصبية V1rb2 غير قادرة على الاستجابة لheptanone - 2 مع زيادة الكالسيوم داخل الخلايا. هذا بصفة خاصة غير V1rb2 معربا عن الخلايا العصبية يستجيب أيضا لheptanone - 2 (الخلية 2). أشرطة النطاق هي : CE ، 20 ميكرومتر ؛ GH ،15 ميكرومتر ؛ ΔF = 340 نانومتر / 380 نانومتر. (F وانا) هو مبين مدة تطبيق التحفيز بالأشرطة تحت كل أثر. مقياس اللون التعسفي يمثل كثافة مضان.

Discussion

أسلوب التصوير الكالسيوم المقدمة هنا يمكن أن تسجل ، في إعداد شريحة الحادة ، ردود pheromonal من الخلايا العصبية الماوس VNO. مع هذا النهج ، من تشريح الحيوانات والخلايا العصبية الميكعي هو ، مع بعض الممارسة ، يمكن تحقيقه بسهولة ويوفر إعداد طويلة الأنسجة الحية. انها تستغرق وقتا طويلا يسمح التجارب الدوائية مثل التحقيقات أو دراسة pheromonal الترميز. مع هذه التقنية الفسيولوجية ، يمكن تحليل عدد كبير من السكان ، فضلا عن المجموعات السكانية الفرعية العصبية دقيقة على وجه التحديد. بالإضافة ، يمكن هذا الأسلوب تتكيف بسهولة مع النهج المناعى أو التجارب القائمة على الأصباغ الكالسيوم الأخرى. سيتم استخدام هذه المنهجيات مجتمعة تسمح بالتأكيد تحديد يغاندس pheromonal جديدة لكثير من المستقبلات الكيميائية اليتيمة التي أعرب عنها في الماوس الميكعي الجهاز.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نريد ان نشكر بشكل خاص مونيك Nenniger Tosato لدعمها فنية ممتازة وكذلك Chatton جان إيف لله النصائح العلمية ومنصة سيف التصوير من UNIL للمعدات المجهر. تم توفير التمويل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) Sigma-Aldrich A6559-25UMO
Agar Sigma-Aldrich A7002-100G Preferentially for immunohistochemistry
Agar (low-melting) Sigma-Aldrich A0701-25G Preferentially for calcium imaging
CL-100 Bipolar Temperature Controller Warner Instruments W64-0352
Confocal Microscope Leica Microsystems SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-175-071 Protect from light
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Merck & Co., Inc. 317275-100ML
Embedding molds, Peel-A-Way Polysciences, Inc. 18646A-1 22 x 22 x 20 mm
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) Rectolab H-1200
FURA-2AM Teflabs 0103 Protect from light
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) Borer Chemie Glisseal N
Large bath recording chamber (RC-26G) Warner Instruments 64-0235
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) Visitron Systems
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody Sigma-Aldrich T6793-.2ML
Normal goat serum (NGS, 10 ml) Interchim UP379030
Platform for chambers (P-1) Warner Instruments 64-0277
Pluronic F-127, 2 g Invitrogen P-6867
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) Carl Roth GmbH 0258.1
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler Warner Instruments W64-0353
Slice anchor (SHD-26GKIT) Warner Instruments 64-0266
Stereofluorescence microscope Leica Microsystems MZ16FA
Super PAP PEN (hydrophobic pen) Pelco International 22309
Triton X-100 Fluka 93420-250ML
Vibrating blade microtome VT 1200S Leica Microsystems 14048142066
VisiChrome high speed polychromator system Visitron Systems
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) Bitplane Scientific Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlson, P., Lüscher, M. "Pheromones" a new term for a class of biologically active substances. Nature. 183, 55-56 (1959).
  2. Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).
  3. Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus. Experientia. 46, 109-113 (1990).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  6. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  7. Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals. Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).
  8. Achiraman, S., Archunan, G. Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds. J. Biosci. 27, 679-686 (2002).
  9. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).
  10. Brennan, P. A., Zufall, F. Pheromonal communication in vertebrates. Nature. 444, 308-315 (2006).
  11. Mondor, E. B., Roitberg, B. D. Inclusive fitness benefits of scent-marking predators. Proc. Biol. Sci. 271, Suppl 5. 341-343 (2004).
  12. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  13. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286, 716-720 (1999).
  14. Weiler, E. Postnatal development of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 30, Suppl 1. 127-128 (2005).
  15. Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).
  16. Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa. Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).
  17. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  18. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  19. Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Cell. 19, 371-379 (1997).
  20. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  21. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  22. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  23. Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. Extreme variability among mammalian V1R gene families. Genome. Res. 20, 10-18 (2009).
  24. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  25. Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).
  26. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  27. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  28. Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).
  29. Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing. Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).
  30. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97, 199-208 (1999).
  31. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).
  32. Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice. Science. 321, 1092-1095 (2008).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 58 ، الميكعي الجهاز ، VNO ، فرمون ، والتصوير الكالسيوم ، وأنسجة إعداد شريحة ، المناعية العائمة ، GFP
التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brechbühl, J., Luyet, G.,… More

Brechbühl, J., Luyet, G., Moine, F., Rodriguez, I., Broillet, M. C. Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation. J. Vis. Exp. (58), e3311, doi:10.3791/3311 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter