Summary
Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall'organo vomeronasale (VNO). Qui, un acuto preparazione fetta di tessuto VNO per eseguire l'imaging calcio è descritto. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche di sottopopolazioni e / o di singoli neuroni in un tessuto vivente ed è comodo per l'identificazione del recettore-ligando.
Abstract
Peter Karlson e Martin Lüscher feromone usato il termine per la prima volta nel 1959 da 1 a descrivere prodotti chimici usati per la comunicazione intra-specie. I feromoni sono volatili e non volatili di breve durata 2 molecole secrete e / o contenuti nei fluidi biologici 3,4, come ad esempio urina, un liquido noto per essere la principale fonte di feromoni 3. Comunicazione feromonali è implicata in una varietà di modalità di animali fondamentali quali le interazioni 5,6 parenti, organizzazioni gerarchiche 3 e le interazioni sessuali 7,8 e sono quindi direttamente correlata con la sopravvivenza di una data specie 9,10,11. Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall'organo vomeronasale (VNO) 10,12, una struttura abbinato situato alla base della cavità nasale, e racchiusi in una capsula cartilaginea. Ogni VNO ha una forma tubolare con un lume 13,14 che permette il contatto con l'esternomondo della chimica. Il neuroepitelio sensoriale è composta principalmente da vomeronasale neuroni sensoriali bipolari (VSNs) 15. Ogni VSN estende un singolo dendrite al lume che termina con una manopola dendritiche grande cuscinetto fino a 100 microvilli implicati nella individuazione di prodotti chimici 16. Sottopopolazioni numerose VSNs sono presenti. Essi si differenziano per il chemocettrice essi esprimono e quindi probabilmente dal ligando (s) riconoscono 17,18. Due famiglie principali recettori vomeronasale, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, sono composti rispettivamente da 23 e 240 120 24 soci e sono espressi in livelli separati del neuroepitelio. Recettori olfattivi (OR) 25 e recettori formil peptide (FPRs) 26,27 sono anche espressi in VSNs.
Se tali sottopopolazioni neuronali utilizzare lo stesso percorso a valle di segnalazione per i feromoni di rilevamento è sconosciuta. Nonostante un ruolo di primo piano svolto da un calcio-permeabile canale (TRPC2) presente nel microvilli di neuroni maturi 28 TRPC2 canali di trasduzione indipendenti sono stati suggeriti 6,29. A causa dell'elevato numero di sottopopolazioni neuronali e la particolare morfologia dell'organo, le indagini farmacologiche e fisiologiche degli elementi di segnalazione presenti nel VNO sono complessi.
Qui, presentiamo un acuto preparazione fetta di tessuto del VNO del mouse per l'esecuzione di indagini di imaging di calcio. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche, in un ambiente naturale di un tessuto vivente, di sottopopolazioni generale o individuale di VSNs già caricati con Fura-02:00, un colorante calcio. Questo metodo è anche utile a studiare i GFP-tagged recettore feromone ed è adattabile per l'uso di altre sonde fluorescenti calcio. Come esempio, si usa il mouse: ecco un VG linea 30, in cui è legata la traduzione del recettore feromone V1rb2 l'espressione di GFP da una strategia policistronica.
Protocol
1. Dissezione del VNO del mouse
- Utilizzare topi adulti. Come feromone di rilevamento è implicato in multimodalità, attenta distinzione tra ceppi, genotipi, sessi ed età è importante e influenzerà i risultati. Qui, abbiamo scelto i topi adulti VG 30 precedentemente utilizzati per l'identificazione di un feromone-recettore coppia (2-eptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A).
- Prima di iniziare la dissezione, preparare fresco freddo artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF; 118 mM NaCl, NaHCO 3 25 mM, D-glucosio 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturo di oxycarbon (95% O 2: 5% di CO 2). Per questo, mescolare tutti i componenti tranne ACSF CaCl 2. Saturare la soluzione direttamente spumeggiante con oxycarbon. Alla fine, aggiungere i 2 CaCl e regolare con DDH 2 0 al volume desiderato. Tenere la soluzione ACSF sul ghiaccio fino use.
- L'eutanasia del mouse dovrebbe essere preferenzialmente fatto da dislocazione cervicale o da CO 2 inalazione poco prima l'esperimento.
- Tagliare la testa del mouse. Posto sotto un microscopio da dissezione a freddo ACSF continuamente oxycarbonated.
- Tagliare la mandibola e la posizione della testa in modo da visualizzare il palato (Fig. 1B).
- Fare un'incisione in senso orizzontale nella parte superiore del palato (Fig. 1B) con le forbici micro e rimuovere la membrana palato con micro dissettore. Idratare e pulire la cavità esposta con ACSF (Fig. 1C).
- Tagliare la parte superiore e la parte inferiore del setto nasale (Fig. 1C). Delicatamente estrarre il setto nasale contenente il VNO e metterla direttamente in ACSF su ghiaccio (fig. 1D).
- Separare verticalmente le due parti del VNO utilizzando micro dissettore e delicatamente rimuovere la capsula cartilaginea del VNO (Fig. 1E). Assicurarsi che tutti i pezzi cartilaginei vengono rimossi.
2. VNO tessuto preparazione fetta
La preparazione dei tessuti VNO fetta descritto in questa sezione 2) è principalmente per le indagini di imaging di calcio. Fette VNO può essere utilizzato anche per immunohistostainings su fette galleggianti per verificare l'integrità strutturale del tessuto (vedi sezione 3) del protocollo).
- Preparare basso punto di fusione agar (3% in standard PBS) e il vostro posto di lavoro. Avrete bisogno di ACSF, un microtomo e supporta, micro dissettore, incorporando stampi (22 x 22 x 20 mm), salviette di precisione, spazzole, piastre di coltura dei tessuti, cyanacrylat colla, ghiaccio e un termometro.
- Riempire lo stampo con il 3% embedding basso punto di fusione agar. Assicurarsi che la temperatura non è superiore a 41 ° C prima di mettere in verticale il poco cancellato VNO (Fig. 2A) per essere in grado di ottenere fette coronali.
- Mettere lo stampo embedding su ghiaccioper 1 minuto fino a solidificazione e quindi separato dal blocco di agar. Tagliare il blocco agar in una forma piramidale e posizionarlo con la colla sul supporto microtomo (Fig. 2B).
- Tagliate le fette coronali VNO con il microtomo, con una velocità di 0,5 mm / s, un'ampiezza di 0,7 mm e uno spessore di 100 micron a freddo ACSF e raccogliere le fette di tessuto con una spazzola prima di inserirle in una piastra di coltura dei tessuti pieni di freddo ACSF.
- Se le sezioni contengono fluorescenza endogena come GFP (in gene-mirati neuroni) è possibile selezionare sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza (Fig. 2C).
3. Immunoistochimica su fette VNO galleggiante
L'obiettivo di questa procedura è quello di verificare l'integrità del tessuto fette del VNO ottenuto in sezione 2). Acetilati-tubulina è un microtubulo / citoscheletro marcatore espresso in dendriti e microvilli dei neuroni sensoriali VNO. Per gli esperimenti di imaging di calcio, andare direzionetemente alla sezione 4) del protocollo. Il metodo immunohistostaining mobile a fette VNO può essere adattato alla valutazione dell'espressione di una proteina di interesse. A tal fine, si consiglia di fissare il VNO per 1h a 4 ° C in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7.6) dopo il punto 1.7) del protocollo e l'utilizzo da questo punto di PBS a pH 7,6, piuttosto che ACSF soluzione.
- Nella piastra di coltura tissutale, fette di riparare il vostro interesse in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C.
- Blocca il tuo fette di tessuto notte a 4 ° C in una soluzione PBS contenente NGS (siero normale di capra) 10% e Triton X-100 allo 0,5%.
- Incubare fette con l'anticorpo primario (anti-acetilati-tubulina, Mouse, 1:2000) per 16h a temperatura ambiente (RT) in una soluzione PBS contenente NGS 5% e Triton X-100 allo 0,25%.
- Lavare 3 volte per 5 minuti con una soluzione di PBS contenente NGS 2%.
- Incubare al buio con il secoanticorpi ndary (Cy5-coniugato capra anti-topo, 1:200) in una soluzione PBS contenente NGS 2% per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS contenente NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS solo.
- Montare le sezioni in un supporto di montaggio a fluorescenza (contenenti o meno DAPI) mettendoli al centro delle zone delimitate idrofobica (usare una penna idrofobico) e coprire le fette con coprioggetto.
- Fare osservazioni e acquisizioni con la microscopia confocale e di un software che consente ricostruzioni 3D (Fig. 2D-F).
4. Immagini di calcio su fette VNO
- Le seguenti procedure si svolgeranno al buio. Incubare fette VNO per 1h a 37 ° C in una soluzione di carico composto da freddo ACSF con Fura-02:00 (7 mM, soluzione madre di 1 mM in DMSO) e Pluronic 0,1% (w / v; soluzione madre al 20% in DDH 2 O).
- Tenere le fette caricato su ghiaccio con oxycarbonation fino al momento dell'uso. Fette caricate possono essere conservati per3-4h.
- Mettere le fette caricato con un pennello in una camera di perfusione contenente ACSF e mantenere le fette con una fetta di ancoraggio dei tessuti (Fig. 3A).
- Posizionare la camera di perfusione sul palco di un microscopio di imaging di calcio (Fig. 3B) e continuamente profumato con oxycarbonated ACSF a temperatura ambiente. Temperatura può essere adattato con l'utilizzo di un regolatore di temperatura bipolare.
- Osservazioni delle fette caricato VNO (Fig. 3C-E) sono eseguiti con un microscopio invertito a fluorescenza, con un obiettivo 25x o 63x e un luogo fresco SNAP-HQ telecamera. L'illuminazione è fatta in modo sequenziale (340/380 nm) con uno strumento policromatore e registrati a una velocità di 5Hz. Emissione filtrata viene effettuata a 510 nm. Cambia il rapporto di calcio intracellulare (ΔF = 340 nm/380 nm) sono monitorati con un apposito software.
- Chemostimulation devono essere selezionati secondo il vostro scopo sperimentale. Qui, perfusione di ACSF contenente un feromone mix (isobutylamine, 2-eptanone, 4-eptanone, 2-eptanolo, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-eptanone (10 -6 M) o raccolto di recente maschili e femminili (1: 1) urina topo (1:100) vengono eseguite 32. Perfusione di ATP (125 mM) è usato come un test di vitalità economica alla fine degli esperimenti (Fig. 3F) e dovrebbe indicare una percentuale di circa l'80% dei neuroni vitali. In queste condizioni, le fette possono essere utilizzati fino a 2 ore.
- GFP-tagged sottopopolazioni di neuroni sensoriali sono visualizzati con illuminazione specifica (qui i neuroni che esprimono V1rb2) e possono essere analizzati con precisione (Fig. 3G-I).
5. Rappresentante dei risultati:
Per stabilire un dosaggio funzionale per indagare i percorsi di trasduzione più in atto nel VNO mouse, o per individuare nuove feromoni-recettori coppie, approfittiamo del mouse VG linea (Fig. 1A (Fig. 1E), ci prepariamo acuta fette VNO (Fig. 2C). Fissiamo una frazione di loro, al fine di verificare e validare l'integrità tissutale della preparazione eseguendo immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina (Fig. 2D-F). L'altra frazione delle fette viene utilizzato per esperimenti di imaging di calcio. Per questo, le fette sono caricati con Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e il livello di calcio intracellulare di ogni neurone è monitorato come un rapporto ΔF (Fig. 3F). La vitalità dei neuroni viene valutata da perfusione di ATP (125 micron), dopo di che rapido aumento e transitoria del rapporto ΔF è atteso (Fig. 3F). L'urina è una delle principali fonti di feromoni, perfusione di frescal'urina del mouse Ly raccolti (1:100) viene utilizzato come controllo endogeno. Si innesca transienti di calcio in circa il 50% dei neuroni registrati (cella 1 e 2, fig. 3F). Sotto GFP illuminazione, V1Rb2 neuroni positivi sono osservabili, e perfusione di suo ligando noto feromonali, 2-eptanone, avvia l'attivazione cellulare (cella 1, fig. 3I). È interessante notare che attivazioni neuronali sono osservabili in una frazione di neuroni che non esprimono il recettore V1Rb2 (neuroni negativo GFP) (cella 2, fig. 3I), a dimostrazione della complessità del feromone di codifica nel VNO.
Figura 1. Dissezione dell'organo vomeronasale del mouse. (A) Un mouse dalla linea VG. (B) Dopo l'eutanasia del mouse, la testa piena è posta sotto un microscopio binoculare e la mascella inferiore viene rimosso in modo da visualizzare il palato. Una piccola incisione orizzontale è fatto(Linea nera tratteggiata). (C) Dopo la rimozione del palato, il setto nasale allineato con il VNO è tagliato in alto e la parte inferiore (bianco linee tratteggiate) per facilitare l'estrazione VNO. (D) Il VNO si trova in soluzione ACSF e separati (inserire: vista di potenza superiore delle due parti). (E) La capsula cartilaginea del VNO è delicatamente rimosso, e il VNO senza la sua capsula cartilaginea viene utilizzato per il resto degli esperimenti. Barre di scala sono: BE, 1 mm.
Figura 2. Mouse vomeronasale preparazione fetta acuta e dell'integrità tissutale. (A) La VNO mouse è verticalmente integrata in una soluzione agar 3%. La temperatura del agar deve essere inferiore a 41 ° C. (B) Il blocco di agar è tagliato in una forma piramidale e 100 micron sezioni VNO (linea nera tratteggiata) sono generati in ACSF. (C) fette VNO può essere selezionato sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per visualizzare uno specificopopolazione di tag neuroni sensoriali. (DF) integrità tissutale può essere valutato immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina, una visione di potenza superiore del V1rb2 gene mirati neuroni dimostrare la perfetta conservazione della preparazione. I neuroni con i loro dendriti che raggiunge la superficie del lume (E) così come l'espressione della proteina strutturale nel manopole dendritiche e microvilli può essere osservato (F). Barre di scala sono: B, 5 mm; C, 60 micron; D, a 40 micron, EF, 20 micron.
Figura 3. Immagini di calcio e la rilevazione di feromoni in vomeronasale fette di tessuto acuta. (A) Dopo un Fura-02:00 fase di carico, fette VNO sono posti in una camera di perfusione e sono mantenuti con un ancoraggio adeguato (vedere ad alta potenza). (B) Gli esperimenti sono eseguiti nel buio e fette VNO sono continuamente perfuso con ACSF a temperatura ambiente con un sistema di vuoto. La temperatura può essere chosit con un sistema di controllo della temperatura composto da un elemento bipolare Pelletier e una sonda termica. Questo particolare esperimento è stato eseguito a temperatura ambiente. (CE) fette VNO sono osservabili in contrasto di fase Hoffman (C, Hv) o Fura 380 nm prima di illuminazione (D) e durante l'attivazione neuronale (E, qui con ATP). (F) vitalità neuronale è valutata con perfusione di ATP (125 mM). Qui, chemostimulation avviene con le urine (urina, 1:100) o con un mix di feromoni del mouse (ph mix., 10 -6 M) ad un flusso costante di 165 ml / h. I livelli di calcio intracellulare (ΔF) può essere registrato individualmente per ogni cella (Cella 1 a 3). (G) Un neurone V1Rb2 viene visualizzato sotto GFP illuminazione (1). (H) Il carico di questo neurone (1) così come un non-V1rb2 neuroni che esprimono (2) viene visualizzato. (I) Il neurone V1rb2 è in grado di rispondere a 2-eptanone con un aumento del calcio intracellulare. Questo particolare non V1rb2 neuroni che esprimono risponde anche a 2-eptanone (cella 2). Barre di scala sono: CE, 20 micron; GH,15 micron; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Durata di applicazione stimolo è indicata dalle barre sotto ogni traccia. La scala cromatica arbitraria rappresenta l'intensità di fluorescenza.
Discussion
Il metodo di imaging di calcio qui presentata permette di registrare, in una preparazione fetta acuta, le risposte feromonali di topo neuroni VNO. Con questo approccio, dissezione dall'animale ai neuroni vomeronasale è, con po 'di pratica, facilmente raggiungibile e offre una lunga vita di preparazione dei tessuti. Esso consente in termini di tempo esperimenti come indagini farmacologiche o lo studio di codifica feromonale. Con questa tecnica fisiologica, le popolazioni di grandi dimensioni così come precisa sottopopolazioni neuronali possono essere analizzati nello specifico. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato ad approcci immunoistochimica o esperimenti a base di coloranti altri calcio. L'utilizzo di queste metodologie combinate sicuramente permettere l'identificazione di nuovi leganti feromonale per il chemocettori orfano molti espressi nel topo organo vomeronasale.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vogliamo ringraziare particolarmente Monique Nenniger Tosato per il suo eccellente supporto tecnico e Jean-Yves Chatton per i suoi pareri scientifici e la piattaforma di imaging CIF della UNIL per le apparecchiature microscopio. Il finanziamento è stato fornito dal Fondo nazionale svizzero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
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