Summary
마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.
Abstract
피터 Karlson과 마틴 Lüscher는 내부 종 (species) 통신에 사용되는 화학 물질을 설명하기 위해 1959 1 처음 용어 페로몬를 사용합니다. 페로몬은 휘발성 또는 비휘발성 수명이 짧은 분자이 분비 및 / 또는 소변, 페로몬 3 주 원본으로 알려진 액체로 생물 학적 체액 3,4에 포함되어 있습니다. Pheromonal 통신 등 가족과 상호 작용 5,6, 계층적 조직 3 성적 상호 작용 7,8 등 주요 동물 modalities 다양한 연루되고 결과적으로 직접 주어진 종 9,10,11의 생존과 상관 있습니다. 마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO) 10,12, 비강의 기지에 위치한 이점 구조에 의해 중재되며, 연골 캡슐에 동봉. 각 VNO는 외부와 접촉을 허용 루멘 13,14와 관 모양을 가지고화학의 세계. 감각 neuroepithelium은 주로 vomeronasal 바이폴라 감각 뉴런 (VSNs) 15로 구성되어 있습니다. 각 VSN 화학 감지 16 연루 100 microvilli 최대 베어링 큰 돌기 손잡이로 끝나는 루멘에 하나의 dendrite를 확장합니다. VSNs 수많은 subpopulations이 흐릅니다. 그들은 그들이 17,18을 인식 리간드 (들)에 의해 가능하게함으로써 표현하고 chemoreceptor으로 구분됩니다. 두 가지 주요 vomeronasal 수용체 가족, V1Rs 및 V2Rs 19,20,21,22은 240 23 120 24 회원 각각 구성되어 있으며, neuroepithelium 별도의 레이어에 표현됩니다. 후각 수용체 (ORs) 25 메티오닌 펩타이드 수용체는 (FPRs) 26,27도 VSNs로 표현됩니다.
이들의 연결 subpopulations가 감지 페로몬에 동일한 스트림 신호 경로를 사용 여부에 상관없이 알 수 있습니다. 칼슘 투과 채널 (에 의해 연주 중요한 역할에도 불구하고성숙한 뉴런 28 TRPC2 독립 전달 채널의 microvilli에 존재 TRPC2)는 6,29 제안되었습니다. 의 연결을 subpopulations의 높은 번호와 오르간의 독특한 형태로 인해, VNO에있는 신호 요소의 약리 및 생리 조사가 복잡하고 있습니다.
여기, 우리는 칼슘 이미징 조사를 수행하기위한 마우스 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비를 제시한다. 이것은 생리적 접근은 이전 Fura - 오전 2시, 칼슘 색소를로드 VSNs의 일반 또는 개별 subpopulations의 살아있는 조직의 자연 환경에서 관찰하실 수 있습니다. 이 방법은 GFP - 태그 페로몬 수용체를 공부 또한 편리합니다 그리고 다른 형광 칼슘 프로브의 사용에 대한 적응이다. 예를 들어, 우리는 여기 페로몬 V1rb2 수용체의 번역이 polycistronic 전략에 의한 GFP의 표현에 연결되어있는 VG 마우스 라인 30 사용합니다.
Protocol
1. 마우스 VNO의 해부
- 성인 마우스를 사용합니다. 페로몬 감지가 multimodalities에 연루되어 마찬가지로, 변종, genotypes, 성별과 연령 사이의주의 구별은 중요하고 결과에 영향을 미칠 것이다. 여기, 우리는 이전 페로몬 - 수용체 쌍 (2 heptanone - V1rb2) 31 (그림 1A)의 식별에 사용되는 성인 VG 마우스 30을 선택합니다.
- NaCl 118 MM, NaHCO 3 25 MM, D - 포도당 10 MM, KCl이 MM, MgCl 2 2 MM, 아니 2 PO 4 1.2 MM, CaCl 2 2, 절개를 시작하기 전에 (ACSF 신선한 차가운 인공 세리 브로 - 척골 액을 준비 MM; oxycarbon (95% O 2 포화 산도 7.4) : 5 % CO 2). 그, CaCl 2를 제외한 모든 ACSF 구성 요소를 섞는다. 직접 oxycarbon로 버블링하여 솔루션을 포화. 결국, CaCl 2를 추가하고 원하는 볼륨 ddH 2 0로 조정합니다. U 때까지 얼음 ACSF 솔루션을 유지SE.
- 마우스의 안락사는 우선적으로 막 실험을하기 전에 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입에 의해 수행되어야합니다.
- 마우스 머리를 자르고. 지속 oxycarbonated 추운 ACSF에서 해부 현미경으로 그것을 놓으십시오.
- 아래턱을 잘라 미각 (그림 1B)를 시각화하기 위해 머리를 위치.
- 마이크로 가위로 미각의 위쪽 부분 (그림의 1B)에 수평 절개를 만들고 마이크로 해부 포셉과 미각 막를 제거합니다. 하이드 레이트와 ACSF (그림 1C)로 노출된 구멍을 청소하십시오.
- 상부를 잘라 비강 심장 (그림 1C)의 하단 부분입니다. 정교한 VNO가 들어있는 비강 심장을 추출하고 얼음 (그림의 1D)에 ACSF에 직접 넣습니다.
- 수직으로 미세 해부 집게를 사용하여 VNO의 두 부분을 분리하고 정교한 VNO의 연골 캡슐 (를 제거그림. 1E). 모든 연골 조각이 제거되었는지 확인합니다.
2. VNO 조직 슬라이스 준비
이 섹션 2)에 설명되어있는 VNO 조직 슬라이스 준비는 주로 칼슘 이미징 조사입니다. VNO 슬라이스 또한 조직의 구조적 무결성을 프로토콜 (섹션 3 참조하시기 바랍니다)) 확인 떠있는 조각에 immunohistostainings 사용할 수 있습니다.
- 낮은 용융 한천 (표준 PBS 3 %)하고 작업 장소를 준비합니다. 당신은 금형을 포함, ACSF, 마이크로톰 및 지원, 마이크로 해부 집게가 필요합니다 (22 X 22 X 20mm), 정밀 잎사귀, 붓, 조직 문화 접시, cyanacrylat 접착제, 얼음과 온도계.
- 3퍼센트 낮은 용해 한천로 포함 금형을 입력합니다. 온도가 41 이상되어 있지 않은지 확인합니다 ° C 수직 코로나 조각을 얻을 수 있도록 곧 닦아 VNO (그림 2A)를 배치하기 전에.
- 얼음에 포함 금형을 소다음 1 분 및 응고까지에 대한 한천 블록에서 분리. 피라미드 모양의 한천 블록을 잘라 마이크로톰 지원 (그림 2B)에 접착제로 놓으십시오.
- 0.5 mm / s의, 0.7 mm의 진폭과 차가운 ACSF 100 μm의의 두께의 속도로, 마이크로톰와 코로나 VNO의 조각을 잘라 차가운 가득한 조직 문화 판에서 그들을 배치하기 전에 브러시로 조직 조각을 수집 ACSF.
- 당신의 조각이 GFP 같은 내생 형광을 (유전자 타겟 뉴런에서)이 포함되어있다면 당신은 형광 stereomicroscope (그림 2C)에서 그들을 선택할 수 있습니다.
3. VNO 떠있는 조각에 Immunohistochemistry
이 절차의 목적은 제 2에서 얻어진 VNO 조직 슬라이스)의 무결성을 확인하는 것입니다. Acetylated - tubulin은 VNO 감각 뉴런의 dendrites과 microvilli로 표현 미세 소관 / cytoskeleton 마커입니다. 칼슘 이미징 실험, direc 가지tly에 대한 프로토콜 섹션 4). 부동 VNO 슬라이스에 immunohistostaining 방법은 관심의 단백질의 표현의 평가에 적용할 수 있습니다. 이런 목적을 위해, 우리는 4 1H에 대한 VNO 당신을 고칠 것을 ° C를 정착액 솔루션 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 포인트 1.7 이후)이 시점 PBS에서 프로토콜과 사용 산도 7.6에서보다는 좋습니다 ACSF 솔루션입니다.
- 조직 문화 판에서는 정착액 솔루션에 대한 관심의 조각 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 4 1H ° C. 문제를 해결
- 0.5 %에서 NGS (혈청 정상 염소) 10 % 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 용액에 4 박 귀하의 조직 조각 ° C를 차단합니다.
- 0.25 %에서 NGS 5% 그리고 Triton X - 100을 포함하는 PBS 용액에 실온 (RT)에서 16h에 대한 기본 항체와 조각 (안티 acetylated - tubulin, 마우스, 1:2000) 품다.
- NGS 2 % 포함하는 PBS 용액 5 분 동안 3 번 씻으십시오.
- seco와 함께 어둠 속에 품어RT에서 1 시간을위한 NGS에게 2 % 포함하는 PBS 용액에 ndary 항체 (Cy5 - 복합 염소 안티 - 마우스, 1:200).
- NGS에게 2 % 포함하는 PBS로 5 분 3 번 씻어, PBS가 1 %만을 PBS를 NGS.
- 소수성 구분된 지역 (소수성 펜을 사용)의 중심에서 그들을 배치하여 형광등 설치 미디어 (DAPI을 포함하거나하지 않음)에 슬라이스를 마운트하고 coverslips로 조각 커버.
- 공촛점 현미경 및 3D reconstructions (그림 2D - F)를 허용하는 소프트웨어와 함께 관찰과 인수를 확인하십시오.
4. VNO 슬라이스에 칼슘 이미징
- 다음 절차는 어둠 속에서 자리를 취할 것입니다. 37 상반기 대한 품어 VNO 슬라이스 ° Fura - 오전 2시 (7 μm의, DMSO 1 mm의 재고 솔루션)와 추위 ACSF 구성된로드 솔루션에 C와 pluronic 0.1 % (W / V, ddH 2에서 20 %의 재고 솔루션 O).
- 사용까지 oxycarbonation와 얼음로드 슬라이스 보관하십시오. 로드된 조각은 보관 수 있습니다3 4h.
- ACSF을 포함하는 재관류 챔버에서 브러쉬와 함께 로드된 조각 장소 및 조직 슬라이스 앵커 (그림 3A)과 슬라이스를 유지합니다.
- 칼슘 이미징 현미경 (그림 3B)의 무대에서 재관류 챔버를 놓고 지속적으로 RT에서 oxycarbonated ACSF와 perfuse. 온도는 바이폴라 온도 컨트롤러의 사용으로 적용할 수 있습니다.
- 로드 VNO의 조각 (그림 3C - E)의 관측은 25x 63x 또는 객관적이고 시원한 SNAP - HQ 카메라로, 거꾸로 형광 현미경으로 수행됩니다. 조명 polychromator 악기와 함께 (380분의 340 NM) 순차적으로 행해지며 5Hz의 속도로 기록됩니다. 필터링 방출은 510 nm의에서 이루어집니다. 세포 내 칼슘 비율 변경 (ΔF = 340 nm/380 NM)는 적절한 소프트웨어를 모니터링하고 있습니다.
- Chemostimulation는 자신의 실험 목적에 따라 선택해야합니다. 여기 ACSF의 perfusions는 페로몬 m을 포함하는IX (isobutylamine, 2 heptanone, 4 heptanone, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β - farnesene, 10 -6 M), 2 heptanone (10 -6 M) 또는 갓 (남성과 여성의 1 수집 : 1) 마우스 소변 (1:100)는 32 수행됩니다. ATP (125 μm의)의 재관류는 실험의 끝에 생존 능력 테스트로 사용됩니다 (그림 3 층) 및 약 80 % 가능한 뉴런의 비율을 나타내는 것입니다. 이러한 조건에서 조각 2 시간까지 사용할 수 있습니다.
- 감각 뉴런의 GFP - 태그 subpopulations는 특정 조명 (여기서 V1rb2 표현 뉴런)에 의해 시각 있으며 (그림 3G - I) 정확하게 분석할 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
다중 형질 도입 마우스 VNO에서 일어나고, 또는 새 페로몬 - 수용체 쌍을 식별하는 경로를 조사하기 위해 기능 분석을 설정하려면, 우리는 VG 마우스 라인 (그림 1A의 활용 (그림 1E)의 추출 및 해부 후, 우리는 급성 VNO의 조각 (그림 2C)를 준비합니다. 우리는 acetylated - tubulin 단백질 (그림 2D - F)에 대한 immunohistostainings를 수행하여 준비 tissular 무결성을 확인하고 검증하기 위해, 그들의 일부를 수정. 조각의 다른 분수는 칼슘 이미징 실험에 사용됩니다. 그 내용은 슬라이스는 Fura - 오전 2시 (그림 3C - E)와로드하고 각 신경 세포의 세포 내 칼슘 수준은 ΔF 비율 (그림 3 층)로 모니터합니다. 뉴런의 생존은 ΔF 비율의 신속하고 일시적 증가 (그림 3 층) 예상되는 이후 ATP (125 μm의)의 재관류에 의해 평가됩니다. 페로몬의 주요 원천되고 소변, 신선한의 재관류니 수집 마우스 소변 (1:100)는 내생 컨트롤로 사용됩니다. 그것은 기록된 뉴런 (세포 1과 2, 그림. 층)의 약 50 %의 칼슘 과도를 트리거합니다. GFP 조명 아래 V1Rb2 긍정적인 뉴런이 관찰하며, 알려진 pheromonal 리간드, 2 heptanone의 재관류는 세포 활성화 (셀 1, 그림. 3I)을 시작하고 있습니다. 흥미롭게도, 정품 인증의 연결도 VNO에 페로몬 코딩의 복잡성을 보여주는, V1Rb2 수용체 (GFP 부정적인 뉴런) (세포 2, 그림. 3I)를 표현하지 뉴런의 일부에서 관찰됩니다.
그림 1. 마우스 vomeronasal 기관의 해부. VG 라인에서 (A) 마우스. (B) 마우스 안락사 후, 미각을 시각화하기 위해 전체 머리가 쌍안경 현미경으로 배치하고 아래턱이 제거됩니다. 작은 가로 절개가 이루어집니다(검은 점선). (C) 미각의 제거 후, VNO 줄지어 비강 심장은 위쪽에서 절단하고 아래쪽 부분 (흰색 점선 라인) VNO 추출을 촉진하기. (D) VNO는 ACSF 솔루션에 위치하고 (삽입 : 두 부품의 높은 전력보기) 구분합니다. (E) VNO의 연골이 캡슐은 정교한 제거하며, 연골 캡슐없이 VNO는 실험의 나머지 부분에 사용됩니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 BE, 1mm.
그림 2. 마우스 vomeronasal 급성 슬라이스 준비와 tissular 무결성. (A) 마우스 VNO는 수직으로 한천 3 % 용액에 모두 담겨있다. 한천의 온도가 41 ° C.보다 낮은되어야합니다 (B) 한천 블록은 피라미드 모양으로 절단과 100 μm의 VNO 섹션이 (검은 점선) ACSF에서 생성됩니다. (C) VNO의 조각은 특정을 시각화하기 위해 형광 stereomicroscope에 따라 선택하실 수 있습니다태그 감각 뉴런의 인구. (DF) Tissular 무결성 acetylated - tubulin 단백질, 준비의 완벽한 보존을 보여주 V1rb2 유전자 타겟 뉴런의 높은 전력보기에 대한 immunohistostainings로 평가할 수 있습니다. 오랜 dendrites는 루멘 (E)뿐만 아니라 돌기 손잡이와 microvilli의 구조 단백질의 표현의 표면에 도달과 함께 뉴런은 (F) 볼 수 있습니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 B, 5mm, C, 60 μm의, D, 40 μm의, EF, 20 μm의.
그림 3. 칼슘 이미징 및 vomeronasal 급성 조직 조각에서 페로몬 탐지. (A) Fura - 오전 2시 로딩 단계 후, VNO 슬라이스는 재관류 챔버에 배치하고 적응 앵커 (고전력보기)로 유지됩니다. (B) 실험이 어둡고 VNO 조각으로 수행하는가 지속적으로 진공 시스템과 RT에서 ACSF와 perfused 있습니다. 온도가 chos 수 있습니다양극성 Pelletier 요소와 열 프로브로 구성된 온도 컨트롤러 시스템을 사용 ko 페이지를 참조하십시오. 이 특별한 실험 RT에서 수행되었다. (CE) VNO 슬라이스는 (D)와의 연결을 활성화 (E, 여기서 ATP)를하는 동안 전에 호프만 위상 콘트라스트 (C, HV) 또는 Fura 380 NM 조명 아래에서 관찰할 수 있습니다. (F)의 연결 가능성은 ATP (125 μm의)의 재관류로 평가됩니다. 여기 chemostimulation는 소변 (소변, 1:100) 또는 165 ML / H.의 일정한 흐름 속도로 마우스 페로몬을 혼합 (믹스 산도., 10 -6 M)로 이루어집니다 세포 내 칼슘 수준 (ΔF)은 (셀 1-3) 각 셀에 대해 개별적으로 녹음하실 수 있습니다. (G) V1Rb2의 신경 세포가 GFP 조명 (1) 아래에서 시각입니다. (H)이 신경 세포 (1)뿐만 아니라 비 V1rb2 표현 뉴런 (2)의로드가 표시됩니다. (I) V1rb2의 뉴런은 세포 내 칼슘 증가와 함께 2 heptanone에 응답할 수 있습니다. 이 특정되지 않은 V1rb2 표현 신경 세포는 또한 2 heptanone (셀 2)에 응답합니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 CE, 20 μm의, GH,15 μm의; ΔF = 340 NM / NM 380. (F와 I) 자극 응용 프로그램의 기간은 각 추적 아래에 막대로 표시됩니다. 임의의 색상 규모는 형광 강도를 나타냅니다.
Discussion
여기에 제시 칼슘 이미징 방법은, 급성 슬라이스 준비, 마우스 VNO의 뉴런의 반응을 기록 pheromonal 수 있습니다. 이 방법으로 vomeronasal 뉴런에 대한 동물의 해부는 연습과 함께, 쉽게 달성되고 오랫동안 살아있는 조직 준비를 제공합니다. 그것은 약리 조사 또는 pheromonal 코딩의 연구와 같은 시간이 많이 소요 실험을 수 있습니다. 이 생리적 기법으로, 큰 인구뿐만 아니라 정확 subpopulations의 연결은 특히 분석하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 쉽게 다른 칼슘 염료에 따라 immunohistochemical 접근이나 실험에 적용할 수 있습니다. 이러한 조합 방법의 사용은 반드시 마우스 vomeronasal 기관 표현 수많은 고아 chemoreceptors에 대한 새로운 pheromonal 리간드의 신분을하실 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그의 과학적인 조언과 현미경 장비에 UNIL의 이미징 CIF 플랫폼에 특히 모니크 Nenniger 그녀의 뛰어난 기술 지원 Tosato뿐만 아니라 장 - 이브 Chatton 감사드립니다. 자금은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
References
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