Summary
Vi beskriver en metode til at generere transformeret B-cellelinjer med Epstein-Barr virus. Vi har også illustrere en roman assay, der kan identificere B-celler bestemt til at undergå transformation så tidligt som tre dage efter smitte.
Abstract
Infektion af B-celler med Epstein-Barr virus (EBV) fører til spredning og efterfølgende immortalization, hvilket resulterer i etableringen af lymfoblastoide cellelinier (LCL) in vitro. Siden LCL latent er inficeret med EBV, giver de et model system til at undersøge EBV latency og virus-drevet B celledeling og tumorigenesis 1. LCL er blevet bruges til at præsentere antigener i en række forskellige immunologiske assays 2, 3. Desuden kan LCL bruges til at generere humane monoklonale antistoffer 4, 5 og giver et potentielt ubegrænset kilde, når adgangen til primære biologiske materialer er begrænset 6, 7.
En række metoder er blevet beskrevet til at generere LCL. Tidligere metoder har inkluderet brugen af mitogener såsom phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8 og pokeweed mitogen 9 for at øge effektiviteten af EBV-medieret immortalization. På det seneste har andre brugt immunosuppressive stoffer såsom cyclosporin A til at hæmme T-celle-medieret drab på inficerede B-celler 7, 10-12.
Det tager lang tid fra EBV infektion til etablering af cellelinier drev kravet om hurtigere og mere pålidelige metoder til EBV-drevet B-celle vækst transformation. Ved hjælp af en kombination af høj titer EBV og et immundæmpende middel, vi er i stand til konsekvent at inficere, transformere, og generere LCL fra B-celler i perifert blod. Denne metode bruger en lille mængde af perifere mononukleære blodceller, der er inficeret in vitro klynger af celler kan påvises. Tilstedeværelsen af CD23 med EBV i overværelse af FK506, en T-celle immundæmpende. Traditionelt er udvækst af prolifererende B-celler overvåget af visualisering af mikroskopiske klynger af celler omkring en uge efter infektion med EBV. Klumper af LCL kan ses med det blotte øje efter flere uger. Vi beskriver en analyse for at bestemme tidligt, hvis EBV-medieret gVÆKST transformation er en succes allerede inden mikroskopiske klynger af celler kan påvises. Tilstedeværelsen af CD23 hi CD58 + celler observeret så tidligt som tre dage efter infektion tegn på en vellykket resultat.
Protocol
1. EBV stamopløsningen
- Subkultur eksponentielt voksende B95-8 celler (ATCC # CRL 1612, 13) på 3 x 10 5 celler / ml i en 75cm 2 vævskultur kolbe med sterile teknik. Cellerne dyrkes i fuldstændig RPMI 1640 med 10% varmeinaktiveres føtalt bovint serum (FBS), penicillin / Streptomycin på 100U/ml og 100 mikrogram / ml, og amphotericin B på 0,5 mg / ml ved 37 ° C ved tilstedeværelsen 5% CO 2.
- Otteogfyrre timer senere, resuspender cellerne i frisk komplet RPMI 1640 ved 1 x 10 6 celler / ml. At fremkalde virus produktionen, stimulerer celler med 20ng/ml tetradecanoyl phorbol acetat (TPA) i 1 time i en standard CO 2 inkubator. Vask cellerne tre gange med RPMI 1640 at fjerne TPA.
- Resuspender cellerne i den oprindelige volumen af komplette RPMI 1640 (fra 1,2), og kolben anbringes i CO 2 inkubator i 96 timer. Denne metode har vist sig at producere høje titre af smitsomme virus parpartiklerne 6.
- Centrifugér ved 600 x g i 10 min ved 4 ° C for at adskille EBV-holdige kultur supernatant fra celler. Filtrer flydelaget gennem et 0,45-mikron filter, alikvot, og opbevares ved -70 ° C i over et år.
Et alternativ er at opnå supernatanten fra B95-8 celler, der indeholder EBV fra ATCC (VR-1492), og brug på fortynding anbefales af ATCC.
2. Isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Træk 10 ml blod fra donor til en hepariniseret sprøjte eller en hepariniseret blod rør. Fortynd blodet med 20 ml PBS ved stuetemperatur i en 50 ml konisk rør.
- Underlag fortyndet blod med 15 ml Ficoll Hypaque lymfocyt adskillelse medium. Centrifugér ved 225 x g uden bremse ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Fjern buffy coat og overføres til en ny 50 ml koniske rør. Hæv volumen til 50 ml med PBS og spin ved 600 xg ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Pour off supernatant. Vask celler ved opblanding pellet i 50 ml PBS og spinding på 600 x g ved stuetemperatur i 10 minutter. Vask to gange mere på samme måde.
- Resuspender vaskes cellerne i 1 ml af komplette RPMI. Brug 5 mikroliter af celler til at forberede en 1 / 10 fortynding i Trypan blå. Tæl levende celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Justere lydstyrken ved hjælp komplet RPMI i et 25 cm 2 vævskultur kolbe for at opnå en celle koncentration af 2 x 10 6 / ml.
3. Infektion med EBV
- Tilføj FK506 (AG Videnskabelig) til cellesuspension fra 2,6 til en endelig koncentration på 20 nM. Anbring kolben i CO 2 inkubator ved 37 ° C i en time.
- Hurtigt tø en portion af EBV. Fjern kolben fra rugemaskinen, og tilføjer EBV til cellerne til 1 / 10 fortynding. Typisk er denne fortynding giver en MOI på 50-100. Swirl kolbe at blande, og anbring den i CO 2 inkubator ved 37 ° C.
Bemærk thpå Trin 4, udføres for at forudsige vellykket resultat, er et valgfrit trin. Hvis Trin 4 skal udføres, bliver du nødt til at udruge en ekstra kolbe af un-inficerede PBMC på 2 x 10 6 celler / ml som kontrol.
4. Identificering prolifererende population af celler (valgfrit trin)
- Forbered FACS buffer: PBS + 5% FBS. Opbevares ved 4 ° C.
- Gør følgende antistof blander i 50 μL volumen hver til farvning af celler i trin 4.6. Antistof fortyndinger bør foretages i FACS buffer indeholdende 1mg/ml af muse IgG (Sigma) at hæmme uspecifik binding af antistoffer.
- single-farvet med PE-konjugeret anti-CD23 antistof (1 / 50 fortynding)
- single-farvet med FITC konjugeret anti-CD58 antistof (1 / 50 fortynding)
- single-farvet med PE-Cy5 konjugeret anti-CD19-antistof (1 / 50 fortynding)
- triple-farvede for CD23, CD58 og CD19 (1 / 50 fortynding hver)
- single-farvet med PE-konjugeret isotype kontrolantistof passer til CD23-PE (i samme koncentration som anti-CD23 antistof)
- single-farvet med FITC konjugeret isotype kontrol antistof matches til CD58-FITC (i samme koncentration som anti-CD58 antistof)
- single-farvet med PE-Cy5 konjugeret isotype kontrol antistof matches til CD19-PE-Cy5 (i samme koncentration som anti-CD19 antistof)
- triple-farvet med alle tre isotype kontrol antistoffer.
- På dag tre efter udsættelse for EBV, hvirvel kolbe forsigtigt for at opnå en mere ensartet cellesuspension. Fjern 2ml fra kolbe ind i et 2ml eppendorfrør. Spin rør i en mikrocentrifuge ved 3000 omdrejninger i minuttet ved stuetemperatur i 3 minutter.
- Aspirér supernatanten og resuspender celler i FACS buffer ved 5 x 10 6 til 1 x 10 7 celler / ml.
- Fjern otte 50μl aliquoter i individuelle Eppendorf rør eller en 96-brønds V-bundplade. Spin rør eller pladen ved 1500 x gi 3 minutter.
- Kassér supernatanten og vortexrør / plade. Resuspender cellerne i hvert rør / brønd i 50 μL af FACS buffer indeholdende relevante antistof fortyndinger udarbejdet i 4.2.
- Inkuber rør / plade på is i mørke i 30 minutter. Centrifugér celler ved 3000 rpm i 3 minutter, fjern supernatanten, og der tilsættes 200 μL af FACS buffer. Centrifuge celler igen og fjerne supernatant at fuldføre vask. Gentag to vaske.
- Resuspender cellerne i 200 μL FACS buffer og erhverve data ved hjælp af et flowcytometer, at erhverve 20.000 hændelser / tube.
- Analyser af data ved hjælp WinMDI (freeware til FACS dataanalyse på PC). Gate på levende celler ved hjælp af frem og side scatter profiler. Så gate levende celler for udtryk for CD19 + (B-celle markør) efter sammenligning med celler farvet med isotype kontrol antistof matchet til anti-CD19 antistof. Plot CD19 + levende B-celler med fluorescensintensitet til CD23 på x-aksen og fluorescensintensitet til CD58 på y-aksen. Bestem CD23 + og CD58 + celler ved at sammenligne med EBV-eksponerede celler farvet med matchede isotype kontrol antistoffer. Tilstedeværelse af CD23 hi CD58 + celler i EBV-eksponerede kultur (Figur 2C) forudsiger succesfulde udvækst af EBV-inficerede vækst transformerede celler. I modsætning hertil CD23 hi CD58 + celler ikke opstår, når cellerne ikke udsættes for EBV (Figur 2A) eller udsættes for en ikke-immortalizing stamme af EBV (Figur 2B). CD23 hi CD58 + celler er blevet eksperimentelt påvist, at underkaste sig spredning og efterfølgende etablere LCL (14).
5. Udvidelse og frysekonservering af LCL
- Visualisering af celler ved lysmikroskopi: Ved en uge efter EBV infektion, er klynger af celler synlige ved lysmikroskopi. Figur 3 viser et eksempel på tidlig mikroskopiske klynger (figur 3B) i en kolbe.
- Som tiden skrider frem, mikroskopiske klynger bliver større, således at klumper er synligemakroskopisk i kolben. Figur 3C viser større klynger af celler i etablerede LCL ved lysmikroskopi.
- Fodring celler: Dobbelt mængden af naeringssubstratet i kulturen kolben på dag 12. Efterfølgende udvide kultur ved at øge sin volumen 2-3 gange ved hjælp af komplet RPMI.
- Hyppigheden af fodring celler bør bestemmes ud fra antallet af cellevækst. Når substratet bliver gult, er det normalt tid til at udskifte medierne som ovenfor. Typisk, det sker en gang om ugen. Dog kan nogle cellelinier skal fodres mere eller mindre hyppigt. Udvid kultur til 75-100 ml i løbet af de næste par uger.
- Kryopræservering: Når frysning ned celler, centrifugeres cellerne ved 600 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i koldt frysning medium, der indeholder 90% FBS og 10% dimethylsulfoxid ved 1 x 10 7 celler / ml. Anbring røret i flydende kvælstof.
6. Repræsentative resultater:
Positivt resultat er forudsagt af tilstedeværelsen af CD23 hi CD58 + celler. Omkring 2-3% af levende celler på dag 3-4 efter udsættelse for EBV skal have denne profil (Figur 2C). Andre sub-populationer af CD23 +, CD23 -, CD58 + og CD58 - celler observeret efter udsættelse for EBV vise minimal spredning 14. Un-inficerede celler (Figur 2A) og celler, der udsættes for EBV fra HH514-16 celler (Figur 2B) og husly til en ikke-immortalizing stamme af EBV, viser ikke CD23 hi CD58 + celler.
Du kan også visualisere celler ved lysmikroskopi til at overvåge vellykket resultat: Som tidligere nævnt, inden for en uge efter EBV infektion, er små klynger af celler i kolben synlige ved lysmikroskopi (figur 3B). Som tiden skrider frem, og cellerne udvikle sig til LCL, mikroskopiske klynger bliver større (figur 3C), således at klumper er synlige makroskopisk i kolben.
Figur 1. Workflow til generering og nedfrysning af lymfoblastoide cellelinjer. Perifert blod centrifugeres gennem en Ficoll gradient. PBMC stede i buffy coat en etableret gradient er udsat for FK506 efterfulgt af tilsætning af EBV. EBV-eksponerede celler dyrkes ved 37 ° C under tilstedeværelse af 5% CO 2 for at etablere sig og efterfølgende udvide LCL til nedfrysning.
Figur 2. Identifikation af en sub-population af B-celler forventes at gennemgå spredning efter udsættelse for EBV. Un-inficerede PBMC (A) eller PBMC udsat for EBV stammer fra HH514-16 celler (B) eller fra B95-8 celler (C) i overværelse af FK506 blev høstet på dag 3. Cellerne blev farvet med fluorokromkonjugerede antistoffer rettet mod CD19, CD23 og CD58. Efter gating på levende celles, un-smittede (A) og EBV-eksponerede (B og C) CD19 + B-celler blev undersøgt for ekspression af CD23 og CD58. En sub-population af B-celler, der udtrykker CD58 og et højt niveau af CD23 (CD23 hi CD58 +), kun observeret i cellerne udsættes for transformation kompetente EBV (afledt af B95-8 celler), er afbildet.
Figur 3. Visualisering af celle klynger i EBV-inficerede celler. PBMC blev behandlet med FK506 og inficeret med EBV. Un-smittede (A) og EBV-eksponerede (B) celler blev undersøgt en uge efter infektion med fasekontrast mikroskopi (10x forstørrelse). Fem uger gamle lymfoblastoide cellelinie er vist i C.
Discussion
Metoden er beskrevet i dette papir genererer LCL fra donor perifert blod med hurtig immortalization og nedfrysning gange. Gennem brug af FK506, vi en T-celle immunsupprimerende, og høje titre af smitsomme virus er i stand til at fremme udbredelsen af EBV-inficerede B-celler fra perifert blod mononukleære celler. Disse tiltag gør den beskrevne metode mere effektiv, hvilket resulterer i en hurtig ekspansion af celler for efterfølgende eksperimenter.
Traditionelt har væksten transformation blevet overvåget af visualisering af klynger af celler ved lysmikroskopi omkring en uge efter udsættelse for EBV 6, 15. Men clustering af celler er ikke en specifik indikator for EBV-medierede vækst transformation. Vi har tidligere demonstreret konsekvent identifikation af den stadig cellepopulationen via flowcytometri 14, giver en præcis og specifik metode til at bestemme vellykket resultat så tidligt som tre dage agtenis eksponering af B-celler til EBV.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af NIH tilskud K08 AI062732, K12 HD001401, og 1UL1RR024139-02 og en Child Health Research Grant fra Charles H. Hood Foundation til SB-M. og af Research Foundation ved State University of New York at Stony Brook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
