Summary
We beschrijven een methode voor het genereren van getransformeerde B cellijnen met behulp van Epstein-Barr virus. We hebben ook illustreren een nieuwe test die kan identificeren B-cellen die zijn bestemd om de transformatie te ondergaan al drie dagen na de infectie.
Abstract
Infectie van B-cellen met Epstein-Barr virus (EBV) leidt tot proliferatie en de daaropvolgende immortalisatie, wat resulteert in oprichting van lymfoblastoïde cellijnen (LCL) in vitro. Aangezien LCL zijn latent besmet met EBV, bieden ze een model systeem om EBV latency en virus-gedreven B-cel proliferatie en tumorigenese 1 te onderzoeken. LCL zijn gebruikt om antigenen presenteren in een verscheidenheid van immunologische testen 2, 3. Daarnaast kan LCL worden gebruikt om menselijke monoklonale antilichamen 4, 5 genereren en bieden een potentieel onuitputtelijke bron wanneer de toegang tot primaire biologische materialen is 6, 7 beperkt.
Een verscheidenheid van werkwijzen zijn beschreven aan LCL te genereren. Eerder methoden zijn opgenomen het gebruik van mitogenen zoals fytohemagglutinine, lipopolysaccharide 8 en karmozijnbes mitogeen 9 tot en met de efficiëntie van de EBV-gemedieerde immortalisatie te verhogen. Meer recent, hebben anderen gebruikt immunosuppressive middelen zoals cyclosporine A naar T-cel-gemedieerde doden van geïnfecteerde B-cellen 7, 10-12 remmen.
De aanzienlijke lengte van de tijd van EBV-infectie voor de vestiging van cellijnen drijft de behoefte aan snellere en meer betrouwbare methoden voor het EBV-gedreven B-cel groei van transformatie. Met behulp van een combinatie van hoge titer EBV en een immunosuppressivum, zijn we in staat om consequent te infecteren, te transformeren, en LCL genereren van B-cellen in het perifere bloed. Deze methode maakt gebruik van een kleine hoeveelheid van perifere bloed mononucleaire cellen die geïnfecteerd zijn in vitro clusters van cellen kan worden aangetoond. De aanwezigheid van CD23 met EBV in aanwezigheid van FK506, een T-cel afweeronderdrukkende. Traditioneel, is uitvloeisel van prolifererende B-cellen gecontroleerd door visualisatie van microscopische clusters van cellen ongeveer een week na infectie met EBV. Klonten van LCL kan worden gezien met het blote oog na enkele weken. Beschrijven we een test om te bepalen vroeg als EBV-gemedieerde gROEI transformatie succesvol is, zelfs voor de microscopische clusters van cellen kunnen worden aangetoond. De aanwezigheid van CD23 CD58 + cellen hi waargenomen vanaf drie dagen na de besmetting wijst op een succesvolle afloop.
Protocol
1. EBV voorraad voorbereiding
- Subcultuur groeit exponentieel B95-8 cellen (ATCC CRL # 1612, 13) op 3 x 10 5 cellen / ml in een 75cm 2 weefselkweek fles met steriele techniek. Cellen worden gekweekt in volledige RPMI 1640 met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal bovine serum (FBS), penicilline / streptomycine bij 100U/ml en 100 ug / ml, respectievelijk, en amfotericine B op 0,5 ug / ml bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2.
- Achtenveertig uur later, opnieuw in suspensie cellen in verse volledige RPMI 1640 op 1 x 10 6 cellen / ml. Voor het induceren van virus productie, het stimuleren van cellen met 20ng/ml tetradecanoyl forbol acetaat (TPA) gedurende 1 uur in een standaard CO 2 incubator. Was de cellen drie keer met RPMI 1640 tot TPA te verwijderen.
- Resuspendeer cellen in het oorspronkelijke volume van de volledige RPMI 1640 (vanaf 1.2) en plaats de kolf in CO 2 incubator voor 96 uur. Deze methode is aangetoond dat hoge titers van infectieus virus par te producerentjes 6.
- Centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 min bij 4 ° C om EBV-bevattende kweeksupernatant scheiden van cellen. Filter supernatans door een 0,45-micron filter, aliquoot, en bewaar bij -70 ° C voor meer dan een jaar.
Een alternatief is om de supernatant te verkrijgen van B95-8 cellen met EBV van de ATCC (VR-1492) en bij de verdunning wordt aanbevolen door de ATCC te gebruiken.
2. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC)
- Trek 10 ml bloed van de donor in een gehepariniseerd spuit of een gehepariniseerd bloed buis. Verdunnen het bloed met 20 ml PBS bij kamertemperatuur in een 50 ml conische buis.
- Onderlaag verdund bloed met 15 ml Ficoll Hypaque lymfocyten scheiden medium. Centrifugeer bij 225 x g zonder rem bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder de buffy coat en breng in een nieuwe 50 ml conische buis. Verhoog het volume op 50 ml met PBS en draaien op 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Pour uit supernatant. Was cellen door resuspenderen pellet in 50 ml PBS en spinnen van 600 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was twee keer meer op een vergelijkbare manier.
- Resuspendeer gewassen cellen in 1 ml van complete RPMI. Gebruik 5 pi van cellen om een 1 / 10 verdunning te bereiden in trypan blauw. Count levende cellen met behulp van een hemocytometer.
- Het volume aanpassen met volledige RPMI in een 25 cm 2 weefselkweek kolf met een cel concentratie van 2 x 10 6 / ml te verkrijgen.
3. Infectie met EBV
- Voeg FK506 (AG Scientific) om de celsuspensie van 2,6 tot een uiteindelijke concentratie van 20 nM. Plaats kolf in CO 2 incubator bij 37 ° C gedurende een uur.
- Snel dooi een hoeveelheid van EBV. Verwijder de kolf van incubator en voeg EBV naar de cellen op 1 / 10 verdunning. Typisch, deze verdunning geeft een MOI van 50-100. Swirl fles te mengen en rechtop plaats deze in CO 2 incubator bij 37 ° C.
Opmerking ebij stap 4, uitgevoerd voor een succesvolle uitkomst te voorspellen, is een optionele stap. Als stap 4 moet worden uitgevoerd, moet u een extra flesje van niet-geïnfecteerde PBMC incuberen bij 2 x 10 6 cellen / ml als controle.
4. Het identificeren van prolifererende populatie van cellen (optioneel stap)
- Bereid FACS buffer: PBS + 5% FBS. Bewaren bij 4 ° C.
- Maak de volgende antilichaam mengt in 50 ul volume elk voor kleuren van cellen in stap 4.6. Antilichaam verdunningen moeten worden gemaakt in FACS buffer met 1mg/ml van de muis IgG (Sigma) om niet-specifieke binding remmen door antilichamen.
- single-gekleurd met PE-geconjugeerd anti-CD23 antilichaam (1 / 50 verdunning)
- single-gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-CD58 antilichaam (1 / 50 verdunning)
- single-gekleurd met PE-Cy5 geconjugeerd anti-CD19 antilichaam (1 / 50 verdunning)
- triple-gekleurd CD23, CD58 en CD19 (1 / 50 verdunning elk)
- single-gekleurd met PE-geconjugeerd isotype controleantilichaam gekoppeld aan CD23-PE (bij dezelfde concentratie als anti-CD23 antilichaam)
- single-gekleurd met FITC-geconjugeerd isotype controle antilichaam gekoppeld aan CD58-FITC (bij dezelfde concentratie als anti-CD58 antilichaam)
- single-gekleurd met PE-Cy5 geconjugeerd isotype controle antilichaam gekoppeld aan CD19-PE-Cy5 (bij dezelfde concentratie als anti-CD19 antilichaam)
- triple-gekleurd met alle drie de isotype controle antilichamen.
- In drie dagen na de blootstelling aan EBV, zachtjes swirl kolf met een meer gelijkmatige celsuspensie te verkrijgen. Verwijder 2ml uit kolf in een 2ml eppendorfbuisje. Spin buis in een microcentrifuge bij 3000 rpm bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Aspireren supernatant en resuspendeer cellen in FACS buffer bij 5 x 10 6 tot 1 x 10 7 cellen / ml.
- Verwijder de acht 50μl aliquots in individuele Eppendorf buizen of een 96-wells V-bodemplaat. Spin buizen of de plaat bij 1500 x ggedurende 3 minuten.
- Gooi supernatant en vortexbuizen / plaat. Resuspendeer cellen in elke buis / putje in 50 ul FACS buffer met daarin passende antilichaam verdunningen bereid in 4.2.
- Incubeer de buizen / plaat op het ijs in het donker gedurende 30 minuten. Centrifugeer cellen bij 3000 rpm gedurende 3 minuten, verwijder supernatant, en voeg 200 pi van FACS buffer. Weer centrifuge cellen en verwijder supernatant om de was te voltooien. Herhaal dit nog twee wasbeurten.
- Resuspendeer cellen in 200 pi FACS-buffer en het verwerven van gegevens met behulp van een flow cytometer, het verwerven van 20.000 events / buis.
- Analyseren van gegevens met behulp van WinMDI (freeware voor FACS data-analyse op de PC). Gate op levende cellen met voor-en zijwaartse verstrooiing profielen. Dan gate levende cellen voor expressie van CD19 + (B-cel marker) na vergelijking met cellen gekleurd met isotype controle antilichaam gekoppeld aan anti-CD19 antilichaam. Perceel CD19 + live B-cellen met fluorescentie-intensiteit voor CD23 op de x-as en fluorescentie-intensiteit voor de CD58 op y-as. Bepaal CD23 + en CD58 + cellen door te vergelijken met EBV-blootgestelde cellen gekleurd met afgestemd isotype controle antilichamen. De aanwezigheid van CD23 CD58 + cellen hi in EBV-blootgestelde cultuur (figuur 2C) voorspelt succesvolle uitgroei van EBV-geïnfecteerde groei getransformeerde cellen. In tegenstelling, doe hi CD23 CD58 + cellen niet ontstaan wanneer de cellen niet worden blootgesteld aan EBV (figuur 2A) of worden blootgesteld aan een niet-vereeuwigen stam van EBV (figuur 2B). CD23 CD58 + cellen hi is experimenteel aangetoond dat verspreiding ondergaan en vervolgens tot stand LCL (14).
5. Uitbreiding en cryopreservatie van LCL
- Visualisatie van de cellen door lichtmicroscopie: Door een week na het EBV-infectie, clusters van cellen zichtbaar zijn door het licht microscopie. Figuur 3 toont een voorbeeld van vroege microscopische clusters (figuur 3B) in een kolf.
- Naarmate de tijd vordert, microscopisch kleine clusters groter worden, zodat klonten zichtbaar zijnmacroscopisch in de kolf. Figuur 3C toont grotere clusters van cellen in de gevestigde LCL met lichtmicroscopie.
- Feeding cellen: Verdubbel de volume van de cultuur medium in de cultuur fles op dag 12. Vervolgens, uit te breiden cultuur door het verhogen van het volume 2-3 maal met complete RPMI.
- Periodiciteit van het voeden van cellen moet worden bepaald op basis van snelheid van de celgroei. Wanneer het kweekmedium geel wordt, is het meestal tijd om de media te vervangen als hierboven. Normaal gesproken gebeurt dit een keer per week. Echter, sommige cellijnen nodig hebt om meer of minder vaak worden gevoed. Uit te breiden naar 75 tot 100 ml cultuur in de komende paar weken.
- Cryopreservatie: Bij het invriezen van cellen naar beneden, centrifuge-cellen van 600 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in koude bevriezing medium met 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide bij 1 x 10 7 cellen / ml. Plaats buis in vloeibare stikstof.
6. Representatieve resultaten:
Succesvolle uitkomst wordt voorspeld door de aanwezigheid van CD23 CD58 + cellen hi. Ongeveer 2-3% van levende cellen op dag 3-4 na blootstelling aan EBV moeten hebben dit profiel (figuur 2C). Andere sub-populaties van CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 en - cellen waargenomen na blootstelling aan EBV tonen minimale proliferatie 14. Un-geïnfecteerde cellen (Figuur 2A) en de cellen blootgesteld aan EBV van HH514-16 cellen (figuur 2B), drager zijn van een niet-vereeuwigen stam van EBV, niet aan te tonen CD23 hi CD58 + cellen.
U kunt ook visualiseren cellen met lichtmicroscopie tot succesvol resultaat te controleren: Zoals reeds eerder vermeld, binnen een week na het EBV-infectie, kleine clusters van cellen in de kolf zichtbaar zijn door het licht microscopie (Figuur 3B). Naarmate de tijd vordert en cellen zich ontwikkelen tot LCL, microscopisch kleine clusters worden groter (Figuur 3C) zodanig dat klonten zijn macroscopisch zichtbaar in de kolf.
Figuur 1. Workflow voor het genereren en cryopreservatie van lymfoblastoïde cellijnen. Perifeer bloed wordt gecentrifugeerd door middel van een Ficoll gradiënt. PBMC aanwezig in de buffy coat van een gevestigde gradiënt worden blootgesteld aan FK506 gevolgd door toevoeging van EBV. EBV-blootgestelde cellen worden gekweekt bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2 vast te stellen en vervolgens uit te breiden LCL voor cryopreservatie.
Figuur 2. Identificatie van een subpopulatie van B-cellen zal naar verwachting proliferatie na blootstelling aan EBV ondergaan. Un-geïnfecteerde PBMC (A) of PBMC blootgesteld aan EBV afgeleid van HH514-16 cellen (B) of van B95-8 cellen (C) in de aanwezigheid van FK506 werden geoogst op dag 3. Cellen werden gekleurd met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gericht tegen CD19, CD23 en CD58. Na gating op levende cellens, niet-geïnfecteerde (A) en EBV-blootgestelde (B en C) CD19 + B-cellen werden onderzocht op expressie van CD23 en CD58. Een sub-populatie van B-cellen die CD58 en hoge niveaus van CD23 (CD23 hi CD58 +), alleen waargenomen in de cellen blootgesteld aan de transformatie bevoegde EBV (afgeleid van B95-8 cellen), is afgebeeld.
Figuur 3. Visualisatie van de cel clusters in EBV-geïnfecteerde cellen. PBMC werden behandeld met FK506 en geïnfecteerd met EBV. Un-geïnfecteerde (A) en EBV-blootgestelde (B) cellen werden onderzocht een week na infectie door de fase-contrast-microscopie (10x vergroting). Vijf weken oude lymfoblastoïde cellijn is te zien in C.
Discussion
De methode beschreven in dit document genereert LCL van donor perifeer bloed met snelle immortalisatie en cryopreservatie tijden. Door het gebruik van FK506, een T-cel immunosuppressivum, en de hoge titers van infectieus virus we in staat zijn om proliferatie van EBV-geïnfecteerde B-cellen uit perifeer bloed mononucleaire cellen te bevorderen. Deze interventies maken de beschreven werkwijze efficiënter, wat resulteert in een snelle expansie van cellen voor latere experimenten.
Traditioneel is de groei transformatie werd gecontroleerd door visualisatie van clusters van cellen door lichtmicroscopie ongeveer een week na blootstelling aan EBV 6, 15. Echter, clustering van de cellen is niet een specifieke indicator van de EBV-gemedieerde groei van transformatie. We hebben eerder aangetoond consistente identificatie van de prolifererende cellen bevolking via flowcytometrie 14, die een nauwkeurige en specifieke methode om succesvol resultaat te bepalen, zoals al in drie dagen achterER blootstelling van B-cellen aan EBV.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de NIH subsidie K08 AI062732, K12 HD001401, en 1UL1RR024139-02 en een Child Health Research Grant van de Charles H. Hood Foundation voor de SB-M. en door de Research Foundation aan de State University van New York bij Stony Brook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
