Summary
אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.
Abstract
זיהום של תאים עם B Epstein-Barr וירוס (EBV) מוביל הנצחה התפשטות הבאים, וכתוצאה מכך הקמת שורות תאים lymphoblastoid (LCL) במבחנה. מאז LCL נגועים רדום עם EBV, הם מספקים מערכת מודל לחקור חביון EBV ו מונחה וירוס B תא התפשטות tumorigenesis 1. LCL שימשו להציג אנטיגנים במגוון רחב של מבחני אימונולוגית 2, 3. בנוסף, LCL יכול לשמש כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים אנושיים 4, 5 ו לספק מקור פוטנציאלי בלתי מוגבל כאשר גישה לחומרים ביולוגיים העיקרי הוא מוגבל 6, 7.
מגוון של שיטות תוארו ליצור LCL. שיטות קודמות כללו את השימוש mitogens כגון phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8, 9 ו פיטולקה mitogen כדי להגביר את היעילות של הנצחה EBV בתיווך. לאחרונה, ואחרים השתמשו immunosupprסוכני essive כגון ציקלוספורין לעכב הרג T התא בתיווך של תאים נגועים ב '7, 10-12.
אורך זמן ניכר מזיהום EBV להקמתה של שורות תאים לכוננים את הדרישה שיטות מהיר ואמין יותר EBV מונחה טרנספורמציה תא B צמיחה. באמצעות שילוב של גבוה titer EBV וסוכן מדכאות חיסון, אנו מסוגלים בעקביות להדביק, לשנות, וליצור LCL מתאי B בדם ההיקפי. שיטה זו משתמשת בכמות קטנה של כדוריות דם היקפיים mononuclear נגועים בצברים של תאים במבחנה ניתן להדגים. הנוכחות של CD23 עם EBV בנוכחות FK506, תא T החיסון. באופן מסורתי, תולדה של תאים B מתרבים מנוטר על ידי ויזואליזציה של אשכולות מיקרוסקופי של תאים כשבוע לאחר זיהום EBV. גושים של LCL ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, לאחר מספר שבועות. אנו מתארים assay מוקדם לקבוע אם EBV בתיווך gשינוי rowth מצליח עוד לפני אשכולות מיקרוסקופי של תאים ניתן להדגים. הנוכחות של CD23 היי CD58 + תאים נצפתה כבר שלושה ימים לאחר הפגיעה מצביעה על תוצאה מוצלחת.
Protocol
1. EBV הכנה מניות
- תת גדל באופן אקספוננציאלי B95-8 תאים (CRL ATCC # 1612; 13) ב 3 x 10 5 תאים / מ"ל בקבוקון 75 ס"מ 2 רקמות התרבות באמצעות טכניקה סטרילית. תאים גדלים RPMI להשלים 1640 המכיל חום מומת 10% בסרום שור עוברית (FBS), פניצילין / סטרפטומיצין ב 100U/ml ו -100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, amphotericin B ב 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ב 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2.
- ארבעים ושמונה שעות מאוחר יותר, תאים resuspend ב RPMI שלם טרי ב 1640 1 x 10 6 תאים / מ"ל. כדי לגרום לייצור וירוס, לעורר תאים עם אצטט 20ng/ml phorbol tetradecanoyl (TPA) במשך שעה 1 ב תקן ה-CO 2 באינקובטור. שטפו תאים שלוש פעמים עם RPMI 1640 כדי להסיר TPA.
- Resuspend תאים בהיקף המקורי של RPMI להשלים 1640 (מתוך 1.2) והמקום הבקבוק ב-CO 2 באינקובטור למשך 96 שעות. שיטה זו הוכח לייצר titers גבוהה נקוב וירוס מדבקticles 6.
- צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C להפריד EBV המכילים supernatant התרבות של תאים. Supernatant סינון דרך מסנן 0.45 מיקרון, aliquot, ולאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך למעלה משנה.
חלופה אחת היא כדי להשיג את supernatant מ B95-8 התאים המכילים EBV מן ATCC (VR-1492) ולהשתמש בדילול המומלץ על ידי ATCC.
2. בידוד של כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC)
- צייר 10 מ"ל דם מתורם לתוך מזרק heparinized או צינור דם heparinized. דם מדולל עם 20 מ"ל PBS בטמפרטורת החדר צינור חרוטי 50 מ"ל.
- ביסוד דם מדולל עם 15 מ"ל בינוני Hypaque ההפרדה Ficoll הלימפוציטים. צנטריפוגה ב x 225 גרם ללא הבלם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר את המעיל באפי ולהעביר לתוך צינור חדש 50 מ"ל חרוטי. העלאת נפח 50 מ"ל PBS עם ספין על XG 600 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- פוr את supernatant. שטפו תאים על ידי resuspending גלולה ב 50 מ"ל PBS ו ספינינג ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף פעמיים נוספות באופן דומה.
- Resuspend שטף תאים מ"ל 1 של RPMI להשלים. השתמש 5 μL של תאים להכין דילול 1 / 10 ב Trypan כחול. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer.
- התאם את עוצמת הקול באמצעות RPMI מלא 25 ס"מ 2 בקבוק רקמה תרבות להשיג ריכוז של התא 2 x מ"ל 10 / 6.
3. זיהום EBV
- הוסף FK506 (AG מדעי) על השעיית התא מ 2.6 עד ריכוז סופי של 20 ננומטר. מניחים בקבוק ב-CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
- במהירות להפשיר aliquot של EBV. הסר בקבוק מן החממה ולהוסיף EBV לתאי בדילול 1 / 10. בדרך כלל, דילול זה מספק משרד הפנים של 5-10. מערבולת בבקבוק לערבב ולמקם אותו זקוף CO 2 באינקובטור ב 37 ° C.
הערה הב 4 שלב, ביצע לחזות תוצאה מוצלחת, היא צעד אופציונלי. אם שלב 4 יש לבצעם, תצטרך דגירה בקבוק נוסף של בלתי נגוע PBMC ב 2 x 10 6 תאים / מ"ל כמו שליטה.
4. זיהוי אוכלוסייה של תאים מתרבים (שלב אופציונאלי)
- הכן FACS חיץ: PBS + 5% FBS. חנות ב 4 ° C.
- הפוך את הנוגדנים הבאים מתערבב בנפח 50 μL כל אחד מכתים תאים בשלב 4.6. דילולים נוגדן צריך להיעשות במאגר FACS המכיל 1mg/ml של העכבר IgG (Sigma) לעכב הלא ספציפית מחייב על ידי נוגדנים.
- אחת מוכתמת PE נוגדן אנטי CD23 מצומדות (1 / 50 דילול)
- אחת מוכתמת FITC נוגדן אנטי CD58 מצומדות (1 / 50 דילול)
- אחת מוכתמת PE-Cy5 נוגדן נגד CD19 מצומדות (1 / 50 דילול)
- משולש מוכתם עבור CD23, CD58, CD19 ו - (1 / 50 כל דילול)
- אחת מוכתמת עם שליטה אלוטיפ PE מצומדותנוגדנים מתאימים CD23-PE (בריכוז זהה נוגדן נגד CD23)
- אחת מוכתמת FITC נוגדן לשלוט מצומדות אלוטיפ מתאימים CD58-FITC (בריכוז זהה נוגדן נגד CD58)
- אחת מוכתמת PE-Cy5 נוגדן מצומדות לשלוט אלוטיפ מתאימים CD19-PE-Cy5 (בריכוז זהה נוגדן נגד CD19)
- משולש מוכתמת כל שלושת הנוגדנים לשלוט אלוטיפ.
- בשלושה חשיפה שלאחר יום EBV, בעדינות בקבוק מערבולת לקבל השעיה תא אחיד יותר. הסר 2ml מן הבקבוק לתוך צינור Eppendorf 2ml. ספין הצינורית microcentrifuge ב 3000 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
- לשאוב תאים supernatant ו resuspend במאגר FACS ב 5 x 06-01 אוקטובר 7 x 10 תאים / מ"ל.
- הסר eight aliquots 50μl לתוך צינורות בודדים Eppendorf או 96-V-היטב לתחתית צלחת. ספין צינורות או צלחת ב 1500 x gבמשך 3 דקות.
- בטל צינורות supernatant ו מערבולת / צלחת. תאים Resuspend בצינור אחד / היטב μL 50 של חיץ FACS דילולים המכיל נוגדנים המתאימים שהוכנו 4.2.
- דגירה צינורות / צלחת על הקרח בחושך במשך 30 דקות. תאים צנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 3 דקות, להסיר supernatant, ולהוסיף 200 μL של חיץ FACS. צנטריפוגה תאים שוב להסיר supernatant כדי להשלים את לשטוף. חזור two שוטף יותר.
- תאים Resuspend ב 200 FACS μL חיץ ולרכוש נתונים באמצעות cytometer זרימה, רכישת 20,000 אירועים / צינור.
- ניתוח נתונים באמצעות WinMDI (freeware לניתוח נתונים במחשב FACS). שער על תאים חיים באמצעות פרופילים פיזור קדימה בצד. לאחר מכן, התאים שער לחיות ביטוי CD19 + (B סמן התא) לאחר השוואה עם תאים מוכתם נוגדנים מתאימים כדי לשלוט אלוטיפ נוגדן נגד CD19. מגרש CD19 + B תאים חיים עם עוצמת הקרינה עבור CD23 על ציר X ואת עוצמת הקרינה עבור CD58 על ציר y. קבע CD23 + CD58 + ו תאים על ידי השוואת ל-EBV בתאים שנחשפו מוכתם נוגדנים בקרה מתאימים אלוטיפ. נוכחות של היי CD23 CD58 + תאים בתרבית EBV חשוף (איור 2C) מנבא תוצאה מוצלחת של תאים נגועים הפך EBV צמיחה. לעומת זאת, היי CD23 CD58 + תאים לא מופיעים כאשר תאים אינם חשופים EBV (איור 2 א) או חשופים למתח הלא המנציחה של EBV (תרשים 2B). היי CD23 CD58 + תאים הוכחו בניסוי לעבור התפשטות ובהמשך להקים LCL (14).
5. התרחבות cryopreservation של LCL
- ויזואליזציה של תאים על ידי מיקרוסקופ אור: עד שבוע לאחר זיהום EBV, אשכולות של תאים גלויים על ידי מיקרוסקופ אור. איור 3 מראה דוגמא של אשכולות בתחילת מיקרוסקופיים (איור 3B) בבקבוק.
- ככל שהזמן מתקדם, אשכולות מיקרוסקופיים הופכים גדולים יותר כגון גושים הנראיםmacroscopically בבקבוק. איור 3C מציג אשכולות גדולים של תאים LCL שהוקמה על ידי מיקרוסקופ אור.
- האכלה תאים: פעמיים נפח בינוני תרבות בבקבוק התרבות ביום 12. לאחר מכן, להרחיב את התרבות על ידי הגדלת נפחו פי 2-3 באמצעות RPMI להשלים.
- מחזוריות של תאים האכלה צריך להיקבע על בסיס שיעור צמיחת תאים. כאשר המדיום תרבות הופך צהוב, הוא בדרך כלל הזמן להחליף את התקשורת לעיל. בדרך כלל, זה קורה פעם בשבוע. עם זאת, כמה שורות תאים עשויים צריך להאכיל יותר או בתדירות נמוכה יותר. הרחב את התרבות 75-100 מ"ל בשבועות הקרובים.
- Cryopreservation: כאשר המקפיא למטה תאים, התאים צנטריפוגות ב 600 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תא גלולה supernatant ו resuspend במדיום קפוא המכיל 90% FBS ו dimethylsulfoxide 10% ב 1 7 x 10 תאים / מ"ל. המקום הצינורית חנקן נוזלי.
6. נציג תוצאות:
התוצאה המוצלחת הוא ניבא על ידי נוכחות של היי CD23 CD58 + תאים. כ 2-3% של תאים חיים ביום 3-4 לאחר חשיפה EBV צריך את הפרופיל (איור 2C). אחרים תת אוכלוסיות של CD23 + CD23 - CD58 + CD58 ו - תאים שנצפו לאחר חשיפה EBV להראות התפשטות מינימלי 14. Un תאים הנגועים (איור 2A) ותאים שנחשפו EBV מ HH514-16 תאים (תרשים 2B), מחסה זן שאינו מנציח של EBV, לא להפגין היי CD23 CD58 + תאים.
אתה יכול גם לחזות תאים על ידי מיקרוסקופ אור לפקח התוצאה המוצלחת: כפי שצוין קודם לכן, בתוך שבוע לאחר זיהום EBV, אשכולות קטנים של תאים הבקבוק גלויים על ידי מיקרוסקופ אור (איור 3B). עם התקדמות הזמן, התאים להתפתח LCL, אשכולות מיקרוסקופיים הופכים גדולים יותר (איור 3 ג) כאלה גושים נראים macroscopically בבקבוק.
ss = "jove_content"> 
באיור 1. Workflow עבור הדור cryopreservation של שורות תאים lymphoblastoid. דם היקפיים הוא centrifuged דרך מפל Ficoll. נוכח PBMC במעיל באפי של שיפוע הוקמה נחשפים FK506 ואחריו תוספת של EBV. EBV חשוף התאים גדלים ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5% 2 להקים ובהמשך להרחיב LCL עבור cryopreservation.
באיור 2. זיהוי של האוכלוסייה משנה של תאים B צפוי לעבור שגשוג לאחר חשיפה EBV. Un-נגוע PBMC (א) או PBMC חשופים EBV נגזר HH514-16 תאים (B) או B95-8 תאים (C) בנוכחות FK506 נבצרו ביום 3. תאים הוכתמו fluorochrome-מצומדות נוגדנים כנגד CD19, CD23 ו CD58. לאחר gating על תא חיs, בלתי נגוע (א) ו-EBV חשוף (B ו-C) CD19 + B התאים נבדקו עבור ביטוי CD23 ו - CD58. אוכלוסיית משנה של תאים B להביע רמות גבוהות של CD58 ו CD23 (CD23 היי CD58 +), נצפה רק בתאים שנחשפו טרנספורמציה המוסמכת EBV (הנגזרות B95-8 תאים), מתואר.
באיור 3. ויזואליזציה של אשכולות תא EBV תאים הנגועים. PBMC טופלו FK506 ו נגוע EBV. Un-נגועים (א) ו-EBV חשוף (ב) בתאים שנבדקו שבוע לאחר הפגיעה על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב (בהגדלה 10X). חמישה שבועות הקו הישן תא lymphoblastoid מוצג ג
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה מייצר LCL מדם היקפי התורם עם הנצחה מהירה cryopreservation פעמים. באמצעות שימוש FK506, תא T החיסון, ו titers גבוהה של הנגיף מדבק אנו מסוגלים לקדם הפצת EBV נגועים בתאי B מתאי דם היקפיים mononuclear. התערבויות אלה הופכות את השיטה המתוארת יעיל יותר, וכתוצאה מכך ההתרחבות המהירה של תאים לניסויים הבאים.
באופן מסורתי, שינוי צמיחה נמצא במעקב על ידי ויזואליזציה של אשכולות של תאים על ידי מיקרוסקופ אור כשבוע לאחר החשיפה 6 EBV, 15. עם זאת, אשכולות של תאים אינו אינדיקטור מסוים של שינוי EBV בתיווך צמיחה. הוכחנו בעבר זיהוי עקבי של האוכלוסייה תא מתרבים באמצעות זרימת cytometry 14, מתן שיטה מדויקת ספציפיים כדי לקבוע תוצאה מוצלחת כבר שלושה ימים ומאחוראה חשיפה של תאים B ל-EBV.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקים NIH AI062732 K08, K12 HD001401 ו 1UL1RR024139-02 ו לבריאות הילד מענק מחקר של ה צ'ארלס הוד הקרן ל SB-M. ועל ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק בסטוני ברוק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
