Summary
Descriviamo un metodo per generare linee cellulari B trasformate con virus di Epstein-Barr virus. Abbiamo anche illustrare un nuovo metodo di analisi in grado di identificare le cellule B destinato a subire trasformazioni già tre giorni dopo l'infezione.
Abstract
L'infezione delle cellule B con virus Epstein-Barr (EBV) porta alla proliferazione e immortalizzazione successive, con conseguente creazione di linee cellulari linfoblastoidi (LCL) in vitro. Dal LCL sono latentemente infettate con EBV, forniscono un sistema modello per studiare la latenza del virus EBV e-driven proliferazione delle cellule B e tumorigenesi 1. LCL sono stati utilizzati per presentare antigeni in una varietà di test immunologici 2, 3. Inoltre, LCL può essere utilizzato per generare anticorpi monoclonali umani 4, 5 e fornire una fonte potenzialmente illimitata quando l'accesso al materiale biologico primario è limitata 6, 7.
Una varietà di metodi sono stati descritti per generare LCL. Metodi precedenti hanno incluso l'uso di mitogeni come fitoemoagglutinina, lipopolisaccaride 8 e 9 pokeweed mitogeno per aumentare l'efficienza di EBV-mediata immortalizzazione. Più recentemente, altri ricercatori hanno utilizzato immunosuppragenti essive come la ciclosporina A per inibire T cellulo-mediata uccisione di cellule B infettate 7, 10-12.
La considerevole periodo di tempo da infezione da EBV allo stabilimento di linee cellulari unità l'esigenza di metodi più veloce ed affidabile per EBV-driven trasformazione crescita delle cellule B. Usando una combinazione di alto titolo EBV e un agente immunosoppressivo, siamo in grado di infettare in modo coerente, trasformare e generare LCL dalle cellule B nel sangue periferico. Questo metodo utilizza una piccola quantità di cellule mononucleari del sangue periferico che sono infettati in gruppi di cellule in vitro può essere dimostrata. La presenza di CD23 con EBV in presenza di FK506, una cellula T immunosoppressori. Tradizionalmente, conseguenza della proliferazione delle cellule B è controllato da gruppi di visualizzazione microscopica di cellule circa una settimana dopo l'infezione da EBV. Ciuffi di LCL può essere visto ad occhio nudo dopo diverse settimane. Descriviamo un test per determinare in anticipo se EBV-mediata gtrasformazione rescita è successo anche prima di ammassi di cellule microscopiche può essere dimostrata. La presenza di cellule CD23 + CD58 hi osserva a partire da tre giorni post-infezione indica un esito positivo.
Protocol
1. EBV magazzino preparazione
- Subculture in crescita esponenziale B95-8 celle (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 5 cellule / ml in un pallone di 75 centimetri 2 di coltura tissutale con tecnica sterile. Le cellule sono coltivate in RPMI 1640 completo contenente il 10% di siero siero fetale bovino (FBS), penicillina / streptomicina a 100U/ml e 100 mcg / ml, rispettivamente, e amfotericina B a 0,5 mcg / ml a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2.
- Quarantotto ore dopo, risospendere le cellule in fresco completo RPMI 1640 con 1 x 10 6 cellule / ml. Per indurre la produzione del virus, stimolano le cellule con acetato di 20ng/ml tetradecanoyl forbolo (TPA) per 1 ora in un incubatore standard di CO 2. Lavare le cellule tre volte con RPMI 1640 per rimuovere TPA.
- Risospendere le cellule del volume originale di completo RPMI 1640 (da 1,2) e posizionare il pallone in CO 2 incubatore per 96 ore. Questo metodo ha dimostrato di produrre alti titoli di par virus infettivoticles 6.
- Centrifugare a 600 x g per 10 minuti a 4 ° C per separare EBV contenenti supernatante della coltura dalle cellule. Surnatante filtrare attraverso un filtro di 0,45 micron, aliquota, e conservare a -70 ° C per più di un anno.
Un'alternativa è quella di ottenere il supernatante da B95-8 celle contenenti EBV dalla ATCC (VR-1492) e utilizzare alla diluizione raccomandata dalla ATCC.
2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
- Draw 10 ml di sangue da donatore in una siringa eparina o un tubo di sangue eparinato. Diluire il sangue con 20 ml di PBS a temperatura ambiente in una provetta da 50 ml.
- Alla base di sangue diluito con 15 ml di mezzo di separazione Ficoll Hypaque linfociti. Centrifugare a 225 x g senza freno a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Rimuovere il buffy coat e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml. Aumentare il volume a 50 ml con PBS e spin a 600 xg a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Pour off surnatante. Lavare le cellule da risospendere pellet in 50 ml di PBS e filatura a 600 x g a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare due volte in un modo simile.
- Risospendere lavato le cellule in 1 ml di RPMI completo. Usare 5 ml di cellule di preparare una diluizione 1 / 10 in tripan blu. Contare le cellule vive usando un emocitometro.
- Regolare il volume con RPMI completo in un centimetro 25 2 fiasco di coltura per ottenere una concentrazione cellulare di 2 x 10 6 / ml.
3. L'infezione da EBV
- Aggiungi FK506 (AG scientifico) alla sospensione cellulare da 2.6 a una concentrazione finale di 20 nm. Pallone posto di CO 2 incubatore a 37 ° C per un'ora.
- Scongelare rapidamente una aliquota di EBV. Rimuovere beuta da incubatore e aggiungere EBV nelle cellule di diluizione 1 / 10. In genere, questa diluizione fornisce una MOI di 50-100. Swirl pallone per mescolarne e lo mettono diritto di CO 2 incubatore a 37 ° C.
Nota °al punto 4, eseguita per predire l'esito di successo, è un passo opzionale. Se Fase 4 deve essere eseguita, è necessario incubare un pallone aggiuntivo di non-infetti PBMC con 2 x 10 6 cellule / ml come controllo.
4. L'identificazione della popolazione di cellule proliferanti (passo opzionale)
- Preparare FACS buffer: PBS + 5% FBS. Conservare a 4 ° C.
- Effettuare l'anticorpo seguenti mescola in 50 microlitri di volume ciascuno per la colorazione delle cellule nella fase 4.6. Diluizioni degli anticorpi devono essere effettuati in tampone FACS contenente 1mg/ml del mouse IgG (Sigma) per inibire legame non specifico dagli anticorpi.
- singolo-colorati con PE coniugato anticorpo anti-CD23 (1 / 50 di diluizione)
- singolo-colorati con FITC coniugato anticorpo anti-CD58 (1 / 50 di diluizione)
- singolo-colorati con PE-Cy5 coniugato anticorpo anti-CD19 (1 / 50 di diluizione)
- triplo macchiato per CD23, CD58 e CD19 (1 / 50 ogni diluizione)
- singolo-colorati con controllo isotipico coniugato PEanticorpi abbinato a CD23-PE (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD23)
- singolo-colorati con FITC coniugato controllo isotipo abbinato a CD58-FITC (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD58)
- singolo-colorati con PE-Cy5 coniugato anticorpo di controllo isotipo abbinato a CD19-PE-Cy5 (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD19)
- tre colorate con tutti gli anticorpi isotipo controllo a tre.
- In tre giorni post-esposizione ad EBV, delicatamente fiasco agitare per ottenere una sospensione cellulare più uniforme. Rimuovere da 2ml matraccio in un tubo di 2 ml Eppendorf. Spin tubo in una microcentrifuga a 3000 rpm a temperatura ambiente per 3 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone FACS a 5 x 10 6 a 1 x 10 7 cellule / ml.
- Rimuovere otto aliquote 50μl in singoli tubi Eppendorf o un 96-well V-parte inferiore della piastra. Tubi di rotazione o la piastra a 1500 x gper 3 minuti.
- Eliminare il surnatante e tubi vortex / piastra. Risospendere le cellule in ogni tubo / pozzetto in 50 ml di tampone FACS contenente diluizioni degli anticorpi adeguati preparati in 4.2.
- Incubare le provette / piastre in ghiaccio al buio per 30 minuti. Cellule centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti, togliere il surnatante e aggiungere 200 ml di tampone FACS. Centrifugare le cellule di nuovo e rimuovere il surnatante per completare il lavaggio. Ripetere due lavaggi più.
- Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer FACS ed acquisire i dati utilizzando un citofluorimetro, l'acquisizione di 20.000 eventi / tubo.
- Analizzare i dati utilizzando WinMDI (freeware per l'analisi FACS dati su PC). Porta su cellule vive usando i profili scatter in avanti e laterale. Poi, le cellule porta dal vivo per l'espressione di CD19 + (cellule B marker) dopo il confronto con le cellule colorate con anticorpo di controllo isotipo abbinato a degli anticorpi anti-CD19. Plot CD19 + vivere cellule B con intensità di fluorescenza per CD23 su asse x e l'intensità di fluorescenza per CD58 su asse y. Determinare CD23 + CD58 + e cellule confrontando per EBV-esposto le cellule colorate con anticorpi isotipo di controllo abbinati. Presenza di CD58 + CD23 hi cellule EBV-esposti cultura (Figura 2C) predice escrescenza successo di EBV-infettate crescita delle cellule trasformate. Al contrario, le cellule CD23 + CD58 hi non emergono quando le cellule non siano esposti a EBV (Figura 2A) o esposti ad un non-immortalando ceppo EBV (Figura 2B). Hi CD58 delle cellule CD23 + sono stati sperimentalmente dimostrato di subire proliferazione e successivamente stabilire LCL (14).
5. Espansione e crioconservazione di LCL
- Visualizzazione delle cellule mediante microscopia ottica: per una settimana dopo l'infezione da EBV, gruppi di cellule sono visibili al microscopio ottico. La figura 3 mostra un esempio dei primi gruppi microscopici (Figura 3B) in un pallone.
- Col passare del tempo, diventano più grandi ammassi microscopici grumi in modo che siano visibilimacroscopicamente nel pallone. Figura 3C mostra grandi ammassi di cellule stabilito LCL al microscopio ottico.
- Alimentazione celle: doppio del volume del terreno di coltura nel pallone cultura il giorno 12. Successivamente, espandere la cultura aumentando il suo volume 2-3 volte con RPMI completo.
- Periodicità di cellule di alimentazione deve essere determinato sulla base del tasso di crescita delle cellule. Quando il terreno di coltura diventa giallo, è generalmente il momento di sostituire i mezzi di comunicazione di cui sopra. Tipicamente, questo accade una volta alla settimana. Tuttavia, alcune linee cellulari può avere bisogno di essere alimentato più o meno frequentemente. Espandere la cultura di 75-100 ml nelle settimane prossime.
- Crioconservazione: congelamento Quando le cellule, le cellule centrifugare a 600 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in medium freddo gelido contenente 90% FBS e il 10% dimetilsolfossido a 1 x 10 7 cellule / ml. Tubo posto in azoto liquido.
6. Rappresentante dei risultati:
Risultato positivo è previsto per la presenza di CD23 hi cellule CD58 +. Circa il 2-3% di cellule vive per 3-4 giorni dopo l'esposizione a EBV dovrebbe avere questo profilo (Figura 2C). Altri sotto-popolazioni di CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 e - cellule osservata dopo l'esposizione a EBV mostrare proliferazione minimo 14. Un cellule infettate (Figura 2A) e le cellule esposte a EBV da HH514-16 cellule (Figura 2B), l'ospitare un non-immortalando ceppo EBV, non dimostrano hi CD58 + CD23 delle cellule.
Si può anche visualizzare le cellule al microscopio ottico per il monitoraggio dell'esito positivo: Come accennato in precedenza, entro una settimana dopo l'infezione da EBV, piccoli gruppi di cellule nel pallone sono visibili al microscopio ottico (Figura 3B). Col passare del tempo e le cellule si sviluppano in LCL, cluster microscopico diventano più grandi (Figura 3C) tale che macchie sono visibili macroscopicamente nel pallone.
Figura 1. Flusso di lavoro per la generazione e la crioconservazione di linee cellulari linfoblastoidi. Sangue periferico viene centrifugato da un gradiente di Ficoll. PBMC presenti nel buffy coat di un gradiente stabilito sono esposti a FK506 seguita da aggiunta di EBV. EBV-esposto le cellule sono coltivate a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 a stabilire e successivamente espandere LCL per la crioconservazione.
Figura 2. Identificazione di una sotto-popolazione di linfociti B dovrebbe subire proliferazione dopo l'esposizione a EBV. Un-infettati PBMC (A) o PBMC esposti a EBV derivati da HH514-16 cellule (B) o da cellule B95-8 (C) in presenza di FK506 sono state raccolte al giorno 3. Le cellule sono state colorate con fluorocromo-coniugati anticorpi diretti contro CD19, CD23 e CD58. Dopo gating su cellule vives, non-infetti (A) e EBV-esposti (B e C) delle cellule B CD19 + sono stati esaminati per l'espressione di CD23 e CD58. Un sub-popolazione di linfociti B che esprimono livelli elevati di CD58 e CD23 (CD23 hi CD58 +), osservata solo nelle cellule esposte alla trasformazione competente EBV (derivati da cellule B95-8), è raffigurato.
Figura 3. Visualizzazione di gruppi di cellule in cellule infettate da EBV. PBMC sono stati trattati con FK506 e infettati con EBV. Un-infetti (A) e EBV-esposte (B), le cellule sono state esaminate uno settimane dopo l'infezione mediante microscopia a contrasto di fase (ingrandimento 10x). Cinque settimane di vecchia linea di cellule linfoblastoidi è mostrato in C.
Discussion
Il metodo descritto in questo articolo genera LCL da donatore di sangue periferico con immortalizzazione rapidi e tempi di crioconservazione. Attraverso l'uso di FK506, una cellula T immunosoppressiva, e alti titoli del virus infettivo, siamo in grado di promuovere la proliferazione di cellule infettate da EBV-B a partire da cellule mononucleate del sangue periferico. Questi interventi rendono il metodo descritto più efficiente, con conseguente rapida espansione delle cellule per gli esperimenti successivi.
Tradizionalmente, la trasformazione la crescita è stata monitorata attraverso la visualizzazione di gruppi di cellule mediante microscopia ottica circa una settimana dopo l'esposizione a EBV 6, 15. Tuttavia, il raggruppamento delle celle non è un indicatore specifico di EBV trasformazione mediata della crescita. Abbiamo già dimostrato di identificazione consistente della popolazione di cellule proliferanti mediante citometria di flusso 14, fornendo un metodo accurato e specifico per determinare la buona riuscita già a tre giorni di poppaer l'esposizione delle cellule B di EBV.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal NIH AI062732 K08, K12 HD001401 e 1UL1RR024139-02 e una salute di Grant Bambino Ricerca dalla H. Charles Hood Foundation per SB-M. e dalla Fondazione di Ricerca presso l'Università dello Stato di New York a Stony Brook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
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