Summary
我々は、EBウイルスを用いて形質転換B細胞株を生成する方法を説明します。我々はまた、感染3日後には早くも変換を受けることを運命づけB細胞を識別することができる新たなアッセイを示しています。
Abstract
Epstein - Barrウイルス（EBV）によるB細胞の感染は、in vitroでのリンパ芽球様細胞株（LCL）の設立で、その結果、増殖とその後の不死化につながる。 LCLが潜在EBVに感染しているので、彼らは、EBVの潜伏とウイルス駆動型B細胞の増殖と腫瘍形成1を調査するモデルシステムを提供しています。 LCLは、免疫学的ア ッセイ2、3の様々な抗原を提示するために使用されている。さらに、LCLは、ヒトモノクローナル抗体4、5を生成し、主要な生物学的物質へのアクセスが6,7に限定されて潜在的に無限のソースを提供するために使用することができます。
様々な方法は、LCLを生成するように記載されている。以前の方法には、フィトヘマグルチニン、リポ多糖8などのマイトジェンの使用を含め、およびEBV -介した不死化の効率を高めるためにマイトジェン9ヨウシュヤマゴボウている。最近では、他の人はimmunosupprを使用しているこのようなT細胞媒介性感染B細胞7、10-12の殺害を阻害するためシクロスポリンのような様格剤。
EBV感染から細胞株の確立までの時間のかなりの長さは、EBV駆動型のB細胞増殖の変換のためのより速く、より信頼性の高い方法の必要性を駆動する。高力価EBVと免疫抑制剤の組み合わせを使用して、我々は一貫して、感染、変換、および末梢血のB細胞からLCLを生成することができます。この方法は、細胞のin vitroでのクラスタに感染している末梢血単核細胞の少量を実証することができます使用しています。 FK506、免疫抑制性T細胞の存在下でEBVとCD23の存在。伝統的に、増殖B細胞の伸長は、EBV感染後約一週間の細胞の顕微鏡クラスターの視覚化によって監視されます。 LCLの塊は、数週間後に肉眼で見ることができます。我々は、EBV -介したグラムであれば早期に決定するアッセイを説明rowth変換は、細胞の顕微鏡クラスターを示すことができる前であっても成功しています。 CD23の存在ハイテク CD58 +細胞は、3日後に感染が成功した結果を示すように早期に観察された。
Protocol
1。 EBV株の準備
- 無菌操作を用いて75センチメートル2の組織培養フラスコに3 × 10 5細胞/ mlで、指数関数的にB95 - 8細胞を（13 ATCC＃CRL 1612）成長サブカルチャー。細胞は37℃で0.5μg/ mlでそれぞれ10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン/ 100U/mlでストレプトマイシンおよび100μg/ mlを含む完全RPMI 1640中で成長し、アンホテリシンBされています° Cの存在下で5％CO 2の。
- 48時間後、1 × 10 6細胞/ mlの新鮮な完全RPMI 1640に再懸濁し、細胞。ウイルス産生を誘導するために、標準的なCO 2インキュベーターで1時間、20ng/mlテトラデカノイルホルボールアセテート（TPA）で細胞を刺激する。 TPAを削除するには、RPMI 1640で細胞を3回洗浄する。
- 完全RPMI 1640（1.2から）の元のボリュームに細胞を再懸濁し、96時間CO 2インキュベーターにフラスコを置く。このメソッドは、感染性ウイルスの額面の高い力価を生成することが示されているticles 6。
- ° C細胞からEBVを含む培養上清を分離するために4℃10分間600 × gで遠心する。一年以上-70 0.45ミクロンフィルター、分注し、そして店舗° Cを介してフィルター上清。
代替は、ATCC（VR - 1492）からEBVを含むB95 - 8細胞から上清を取得し、ATCCの推奨する希釈して使用することです。
2。末梢血単核細胞（PBMC）の単離
- ヘパリン化シリンジまたはヘパリン添加血液チューブにドナーから10 mlの血液を描画します。 50 mlコニカルチューブに室温で20 mlのPBSで血液を希釈する。
- アンダーレイは、15ミリリットルフィコールハイパックリンパ球分離培地で血液を希釈。 30分間室温でブレーキなしで225 × gで遠心する。
- 新しい50 mlコニカルチューブにバフィーコートと転送を削除します。 PBSで50mlにボリュームを上げ、10分間室温で600 × gでスピン。
- POU上清をオフR。 50ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、10分間室温で600 × gで回転することで細胞を洗浄する。同様の方法でさらに2回洗浄する。
- 再懸濁し、完全なRPMI 1mlに細胞を洗浄した。トリパンブルー1 / 10希釈を準備するために細胞の5μLを使用してください。血球計算板を用いて生細胞を数える。
- 2 × 10 6 / mlの細胞濃度を得るために25cm 2の組織培養フラスコで完全RPMIを使用して音量を調整します。
3。 EBVによる感染
- 2.6から20nMの最終濃度を細胞懸濁液にFK506（AGサイエンティフィック）を追加します。 37℃CO 2インキュベーター内で場所のフラスコで1時間のためのC。
- 急速にEBVのアリコートを解凍。インキュベーターからフラスコを取り外し、1 / 10希釈で細胞にEBVを追加します。通常は、この希釈はMOI 50-100を提供します。 37℃CO 2インキュベーター内で直立それをミックスして配置するスワールフラスコ℃に
番目の点に注意してください。ステップ4で、成功した結果を予測するために実行、オプションの手順です。ステップ4が実行されることになっている場合は、コントロールとして2 × 10 6細胞/ mlで非感染PBMCの追加のフラスコを培養する必要があります。
4。細胞の増殖をを識別する（オプションの手順）
- PBS + 5％FBS：FACSバッファを準備します。 4℃で保存します。
- 以下の抗体を作るステップ4.6で細胞を染色するために50μLボリュームでそれぞれをミックス。抗体の希釈液は、抗体によって非特異的結合を阻害するマウスIgG（シグマ）の1mg/mlを含むFACS緩衝液で行う必要があります。
- PE標識抗CD23抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色
- FITC結合抗CD58抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色
- PE - Cy5を結合抗CD19抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色
- CD23、CD58、およびCD19（1 / 50希釈ごと）のための三重染色
- PE結合体化アイソタイプコントロールを持つ単一の染色CD23 - PE（抗CD23抗体と同じ濃度で）にマッチした抗体
- CD58 - FITC（抗CD58抗体と同じ濃度で）にマッチしたFITC標識アイソタイプコントロール抗体を持つ単一の染色
- CD19 - PE - Cy5標識（抗CD19抗体と同じ濃度で）にマッチしたPE - Cy5を結合したアイソタイプコントロール抗体を持つ単一の染色
- すべての3つのアイソタイプコントロール抗体で三重染色。
- より均一な細胞懸濁液を得るためのEBV、優しくスワールフラスコへの日帰りで3つのポスト露出。 2ミリリットルエッペンドルフチューブにフラスコから2ミリリットルを削除します。 3分間室温で3000rpmで遠心チューブをスピン。
- 5 × 10 6〜1 × 10 7細胞/ mlのFACS緩衝液で清と再懸細胞を吸引除去する。
- 個々のエッペンドルフチューブや96ウェルV底板8つの50μlのアリコートを削除します。スピンチューブまたは1500 × gでプレート3分間。
- 上清と渦管/プレートを捨てる。 4.2で作成した適切な抗体の希釈液を含むFACS緩衝液50μLの各チューブ/ウェルの細胞を再懸濁します。
- 30分間暗所で氷上でチューブ/プレートをインキュベートします。 3分間3000rpmで遠心分離細胞は、上清を除去、およびFACS緩衝液200μlを加える。再び細胞を遠心分離し、洗浄を完了するために上清を取り除く。さらに2つの洗浄を繰り返します。
- 200μLのFACS緩衝液に懸濁し、フローサイトメーターを使用してデータを取得し、20,000イベント/チューブを獲得する。
- WinMDI（PC上でFACSのデータ解析のためのフリーウェア）を使用してデータを分析する。前方と側方散乱プロファイルを使用して生細胞にゲートを。その後、抗CD19抗体にマッチしたアイソタイプコントロール抗体で染色した細胞と比較して後にCD19 +（B細胞マーカー）の発現のためのゲート生細胞。プロットCD19 +ライブB y軸上のx軸とCD58の蛍光強度でCD23の蛍光強度を持つ細胞。マッチしたアイソタイプコントロール抗体で染色したEBV -曝露した細胞と比較することによりCD23 +およびCD58 +細胞を決定する。 EBV -露出文化のCD23 ハイ CD58 +細胞（図2C）の存在は、EBVに感染した成長形質転換細胞の正常な伸長を予測している。対照的に、CD23 ハイ CD58 +細胞は、細胞がEBV（図2A）にさらさまたはEBVの非不死化株（図2B）に公開されていないときに出現しません。 CD23 ハイ CD58 +細胞は、実験的に増殖を起こし、その後、LCLを（14）を確立することが実証されている。
5。 LCLの拡大と凍結保存
- 光顕微鏡による細胞の可視化：EBV感染後一週間で、細胞のクラスターは、光学顕微鏡で見ることができます。図3は、フラスコの早い段階で微細なクラスター（図3B）の例を示しています。
- 時間が進むにつれて、微細なクラスターとなるような塊が見える大きくなります肉眼フラスコインチ図3Cは、光学顕微鏡により設立されたLCLの細胞の大規模なクラスタを示しています。
- 細胞を供給する：12日目に培養フラスコで培養液の量を2倍にしてください。その後、完全RPMIを使用して、そのボリューム2〜3倍に増やすことによって文化を展開します。
- 摂食細胞の周期性は、細胞増殖の速度に基づいて決定されるべきである。培養液が黄色に変わったら、それは一般的に上記のようにメディアを交換する時期です。通常、これは1週間に1回発生します。ただし、一部の細胞株は、多かれ少なかれ頻繁に供給する必要があります。今後数週間にわたって75〜100ミリリットルの文化を展開します。
- 凍結保存：室温で10分間細胞を、600 × gで遠心細胞を凍結。 1 × 10 7細胞/ mlで、90％FBSを含む冷凍結培地および10％ジメチルスルホキシドで上清と再懸細胞ペレットを取り外します。液体窒素でチューブを置きます。
6。代表的な結果：
成功した結果は、CD23 ハイ CD58 +細胞の存在によって予測されている。約EBVへの曝露後3〜4日で生きている細胞の2-3％は、（図2C）、このプロファイルを持つ必要があります。他のCD23のサブ集団+、CD23 - 、CD58 +、及びCD58 -細胞がEBVへの曝露後に最小限の増殖14を示す観察。 HH514 - 16細胞（図2B）からEBVへの曝露非感染細胞（図2A）と、細胞は、EBVの非不死化株を保有する、CD23 ハイ CD58 +細胞を示していない。
また、成功を監視するために光学顕微鏡で細胞を可視化することができる：前述のように、EBVの感染後一週間以内に、フラスコ中の細胞の小さなクラスターは、光学顕微鏡（図3B）で表示されます。時間の経過と細胞がLCLへと発展するように、微細なクラスターは（3C図）塊がフラスコ内に肉眼で見えるように大きくなる。
図1。リンパ芽球様細胞株の生成と凍結保存のためのワークフロー。末梢血液をフィコール勾配を通じて遠心分離される。確立された勾配のバフィーコートのPBMCの存在は、EBVの添加により、続いFK506にさらされています。 EBV -曝露した細胞を37℃で確立し、その後、凍結保存用のLCLを拡大するため、5％CO 2の存在下で増殖されています。
図2。EBVへの曝露後に増殖を受けることが予想されるB細胞の亜集団の同定。 HH514 - 16細胞（B）から、またはFK506の存在下でB95 - 8細胞は（C）3日目に収穫したから派生したEBVにさらされる非感染PBMC（）またはPBMC。細胞はCD19、CD23、およびCD58に対して指向の蛍光標識抗体で染色した。生細胞のゲーティング後の、非感染（）及びEBV -露出（BおよびC）CD19 + B細胞はCD23およびCD58の発現について調べた。 CD58を発現するB細胞とCD23（CD23 ハイ CD58 +）の高レベルの亜集団は、変換有能なEBV（B95 - 8細胞に由来する）に曝露した細胞でのみ観察された、描かれています。
図3。EBV感染細胞の細胞クラスターの可視化。 PBMCは、FK506で処理し、EBVに感染していた。非感染（A）及びEBV -露出（B）細胞は位相差顕微鏡（10倍の倍率）が一週間後に感染を調べた。五週齢のリンパ芽球様細胞株は、Cで示されています
Discussion
このホワイトペーパーで説明する方法では、急速な不死化および凍結保存の時間を持つドナー末梢血からLCLを生成します。 FK506、免疫抑制性T細胞、および感染性ウイルスの高力価を使用することで我々は、末梢血単核細胞からのEBV感染B細胞の増殖を促進することができます。これらの介入は、その後の実験のための細胞の急速な拡大の結果、記載された方法がより効率的になる。
伝統的に、成長の変換はEBV 6,15への曝露後約一週間、光学顕微鏡で細胞のクラスターの可視化によって監視されています。しかし、セルのクラスタリングは、EBV -介した増殖形質転換の具体的な指標ではありません。我々は以前に後方三日には早くも成功を決定するために、正確かつ具体的な方法を提供する、フローサイトメトリー14を介して増殖する細胞集団の一貫性の識別を示しているEBVのB細胞の小胞体への暴露。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、NIHの助成金K08 AI062732、K12 HD001401、および1UL1RR024139 - 02とチャールズHフード財団からのSB - Mへの母子保健の研究助成金によって賄われていた。とニューヨーク州立大学ストーニーブルック校での研究の財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
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