Summary
우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.
Abstract
엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 B 세포의 감염은 체외에서 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL)의 설립에 결과 증식 및 후속 불멸화 발생합니다. LCL은 latently EBV에 감염되므로, 그들은 EBV 지연 및 바이러스 기반의 B 세포 증식과 tumorigenesis 1 조사 모델 시스템을 제공합니다. LCL은 immunologic의 assays 2, 3의 다양한 항원을 제시하는 데 사용되었습니다. 또한, LCL은 인간 단클론 항체 4, 5를 생성하고 기본 생물 학적 물질에 대한 액세스가 6, 7 제한됩니다 잠재적으로 무제한 소스를 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
다양한 방법은 LCL을 생성 설명했습니다. 이전 방법은 phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8로 mitogens의 사용을 포함하고, EBV - 중재 불멸화의 효율성을 높이기 위해 mitogen 9 pokeweed있다. 최근 다른 immunosuppr를 사용한같은 시클 로스 포린과 같은 essive 에이전트는 감염된 B 세포 7, 10-12의 T 세포 - 매개 살인을 억제합니다.
EBV 감염의 세포 라인 설립 시간의 상당한 길이는 EBV 중심 B 세포의 성장 변환에 대한 더 빠르고, 좀 더 신뢰할 수있는 방법에 대한 요구 사항을 드라이브. 높은 titer EBV와 immunosuppressive 대리인의 조합을 사용하여, 우리는 지속적으로, 감염 변환, 그리고 주변 혈액에서 B 세포의 LCL를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 세포의 체외 클러스터에 감염된 말초 혈액 mononuclear 세포의 작은 금액이 시연 수 있습니다 사용합니다. FK506, 면역 반응 억제제 T 세포의 존재에 EBV와 CD23의 존재. 전통적으로, proliferating B 세포의 가지는 EBV로 감염 후 일주일에 대한 세포의 미세한 클러스터의 시각화에 의해 모니터링됩니다. LCL의 대단히 짧은 시간은 몇 주 후에 육안으로 볼 수 있습니다. 우리는 결정하기 위해 분석을 설명하는 초기 EBV - 중재 g 경우rowth 변환은 세포의 현미경 클러스터가 시연 수 있습니다 전에도 성공이다. CD23의 존재는 하이 CD58 + 세포로 초기 셋처럼 일 후 감염에게 관찰은 성공적인 결과를 나타냅니다.
Protocol
1. EBV 재고 준비
- 멸균 기술을 사용하여 75cm이 조직 문화 플라스크에서 3 × 10 5 세포 / ML에서, 기하 급수적으로 B95 - 8 세포 (13 ATCC # CRL 1612) 성장 Subculture. 전지는 37 0.5 μg / ML에서 각각 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 / 100U/ml에서 스트렙토 마이신과 100 μg / ML을 포함하는 완전한 RPMI 1640에서 성장하고, Amphotericin B 아르 ° C를 면전에서 5% CO 2.
- 마흔 여덟 시간 후, 1 × 10 6 세포 / ML에서 신선한 완료 RPMI 1640에 resuspend 세포. 바이러스 생산을 유발하기 위해서, 표준 CO 2 배양기에서 1 시간 동안 20ng/ml tetradecanoyl phorbol 아세테이트 (TPA)와 세포를 자극. TPA를 제거하는 RPMI 1640과 세포 세 번 씻으십시오.
- 전체 RPMI 1640의 원래 볼륨 (1.2부터)에 세포를 Resuspend 및 96시간에 대한 CO 2 배양기에서 술병을 배치. 이 방법은 전염성 바이러스 파의 높은 titers을 생산하기 위해 표시되었습니다ticles 6.
- 4 10 분 600 X g에서 원심 ° C 세포에서 EBV - 포함된 문화 뜨는 분리 수 있습니다. 년 이상 -70에서 0.45 - 마이크론 필터, 나누어지는 및 저장 ° C를 통해 필터 뜨는.
대안은 ATCC (VR - 1492)에서 EBV를 포함하는 B95 - 8 세포에서 뜨는을 획득하고 ATCC에서 권장하는 희석에 사용하는 것입니다.
2. 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)의 분리
- heparinized 주사기 또는 heparinized 혈액 튜브에 기증자 10 ML 혈액을 그립니다. 50 ML 원뿔 튜브의 상온 20 ML PBS로 혈액을 희석.
- 15 ML Ficoll Hypaque 림프구 분리 매체와 밑받침 희석 혈액. 30 분 동안 상온에서 브레이크없이 225 X g에서 원심 분리기.
- 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 버피 코트와 송금을 제거합니다. PBS로 50 ML에 볼륨을 인상하고 10 분 동안 상온에서 600 XG에 스핀.
- Pou뜨는 해제 R. 50 ML PBS에서 펠렛을 resuspending 10 분 상온에서 600 X g에서 회전하여 세포를 씻으십시오. 비슷한 방식으로 두 번 이상 씻으십시오.
- Resuspend 완료 RPMI 1 ML에서 세포를 씻어. Trypan 파란색으로 10분의 1 희석을 준비하는 세포의 5 μL를 사용하십시오. hemocytometer를 사용하여 라이브 세포를 세어보세요.
- 2 × 10 6 / ML의 세포 농도를 구하는 25cm이 조직 문화 플라스크에 완료 RPMI를 사용하여 볼륨을 조정합니다.
3. EBV로 감염
- 2.6 20 NM의 최종 농도로 세포 현탁액에 FK506을 (AG 과학) 추가합니다. 37 CO 2 배양기에 넣어 플라스크 ° 한 시간 만이라도 C.
- 신속 EBV의 나누어지는을 녹여. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 10분의 1 희석에있는 세포에 EBV를 추가합니다. 일반적으로이 희석은 방어 50-100을 제공합니다. 37 믹스와 CO 2 배양기에서 똑바로 그것을 배치 소용돌이 플라스크 ° C.
참고 일성공적인 결과를 예측 수행 4 단계에서 단계는 선택 사항입니다. 4 단계는 수행할 수있다면, 당신은 통제로이 X 10 6 세포 / ML에서 취소 감염 PBMC의 추가 휴대용 술병을 품어해야합니다.
4. 세포 proliferating 인구 (선택 단계)를 식별
- PBS + 5퍼센트 FBS : FACS 버퍼를 준비합니다. 4 저장 ° C.
- 다음과 같은 항체 단계 4.6에서 세포를 얼룩 50 μL 부피 각 혼합합니다. 항체 dilutions는 마우스 IgG (시그마)의 1mg/ml이 항체에 의한 비 특정 바인딩을 억제하기 위해 포함 FACS 버퍼에하여야한다.
- PE 복합 백신 CD23 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
- FITC 복합 백신 CD58 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
- PE - Cy5 복합 백신 CD19 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
- CD23, CD58, CD19 및 (50분의 1 희석 각)의 트리플 얼룩진
- PE 복합 isotype 컨트롤과 함께 단일 얼룩진항체가 (안티 CD23 항체와 같은 농도에서) CD23 - PE와 일치
- (안티 CD58 항체와 같은 농도에서) CD58 - FITC FITC와 일치 복합 isotype 제어 항체와 단일 얼룩진
- 로 단일 PE - Cy5 묻은 복합 isotype 제어 항체는 일치 CD19 - PE - Cy5 (안티 CD19 항체와 같은 농도에서)
- 세 isotype 제어 항체와 트리플 얼룩.
- EBV에 3 일이 후 노출에 부드럽게 소용돌이 플라스크는보다 균일한 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 2ml Eppendorf 튜브에 플라스크에서 2ml를 제거합니다. 3 분 상온에서 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 튜브를 돌려.
- 5 X 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML에서 FACS 버퍼에 뜨는 및 resuspend 세포를 기음.
- 여덟 50μl 개별 Eppendorf 튜브에 aliquots 또는 96 - 웰 V - 바닥 플레이트를 제거합니다. 스핀 튜브 또는 1,500 X g에서 판3 분.
- 뜨는 및 와동 튜브 / 접시를 폐기하십시오. 각각의 튜브에 Resuspend 세포 / 음 4.2 준비 적절한 항체 dilutions을 포함 FACS 버퍼 50 μL 인치
- 30 분 어둠 속에서 얼음 튜브 / 플레이트를 품어. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거 및 FACS 버퍼 200 μL를 추가합니다. 또 세포를 원심 분리기와 세척을 완료 뜨는 제거합니다. 두 번 더 씻는다를 반복합니다.
- 200 μL FACS에서 Resuspend 세포가 20,000 사건 / 튜브를 취득 흐름 cytometer를 사용하여 데이터를 버퍼와 취득.
- WinMDI를 (PC에서 FACS 데이터 분석을위한 프리웨어)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 라이브 세포 게이트. 그런 다음, 안티 CD19 항체에 일치하는 isotype 제어 항체 물들일 세포와 비교 후 CD19 + (B 세포 마커)의 표현을위한 게이트 살 세포. 플롯 CD19 + B 사는 Y 축에 대한 X 축 및 CD58에 대한 형광 강도에 CD23에 대한 형광 강도와 세포. 결정 CD23 + 및 CD58 + 일치 isotype 제어 항체 물들일 EBV 노출 세포에 비교하여 세포. EBV 노출 문화에 CD23 CD58 + 세포 안녕하세요 (그림 2C)의 존재는 EBV에 감염된 세포 성장 변화의 성공적인 파생물을 예측합니다. 세포 EBV (그림 2A)에 노출 또는 EBV (그림 2B)의 비 immortalizing 변형에 노출되지 않은 경우 반대로, CD23 CD58 + 안녕하세요 전지는 등장하지 않습니다. CD23 안녕 CD58 + 세포가 실험적으로 확산을 받아야 시연 및 이후 LCL (14)을 수립하고 있습니다.
5. LCL의 확장 및 cryopreservation
- 가벼운 현미경에 의한 세포의 시각화 : EBV 감염 후 일주일함으로써, 세포의 클러스터는 가벼운 현미경으로 볼 수 있습니다. 그림 3은 플라스크에 초기 미세한 클러스터 (그림 3B)의 예를 보여줍니다.
- 시간이 진행되면서 미세한 클러스터는 큰 그러한 것을 대단히 짧은 시간이 표시되는가macroscopically 술병 인치 그림 3C는 가벼운 현미경에 의해 설립된 LCL의 세포의 큰 클러스터를 보여줍니다.
- 세포를 먹이 : 일 12 일 문화 플라스크에 배지의 볼륨을 두 번. 그 후, 전체 RPMI를 사용하여 볼륨을 2-3 배 증가하여 문화를 확장합니다.
- 먹이 세포의 주기성은 세포 성장 속도에 따라 결정되어야합니다. 문화 매체가 노란색 켜면, 일반적으로 위와 같이 미디어를 대체하는 시간이다. 일반적으로이 한번 주당 발생합니다. 그러나, 일부 세포 라인은 더 많거나 적은 빈도로 공급해야 할 수 있습니다. 다음 몇 주 동안 75-100 ML에 문화를 확장합니다.
- Cryopreservation : 세포를 냉동하면 상온에서 10 분 동안 600 X g에서 원심 세포. 1 X 10 7 세포 / ML 90 % FBS를 포함하는 차가운 냉동 미디어와 10 % dimethylsulfoxide에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 액체 질소에 넣어 튜브.
6. 대표 결과 :
성공적인 결과는 CD23 CD58 + 세포 안녕의 존재가 예측됩니다. EBV에 노출된 후 3-4일에 살고 세포의 약 2-3 %가이 프로필 (그림 2C)가한다. 기타 CD23의 하위 인구 +, CD23 - CD58 +, CD58과 - 전지는 EBV에 노출된 후 최소한의 확산 14 보여주 관찰했다. EBV의 비 immortalizing 부담을 품고 HH514 - 16 세포 (그림 2B)에서 EBV에 노출된 취소 감염된 세포 (그림 2A)와 세포는 CD23 CD58 + 세포 안녕을 설명하지 않습니다.
일주일 이내에, 앞서 언급한 EBV 감염 후 플라스크에 세포의 작은 클러스터 조명 현미경 (그림 3B)에서 볼 수 있습니다 : 당신은 또한 성공적인 결과를 모니터링하는 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 수 있습니다. 시간 진행과 세포가 LCL로 발전로서 미세한 클러스터는 대단히 짧은 시간은 술병에 macroscopically 볼 수 있습니다 그러한 (3C 그림) 큰됩니다.
그림 1. lymphoblastoid 세포 라인의 생성 및 cryopreservation을위한 워크플로. 주변 혈액 Ficoll 기울기를 통해 centrifuged입니다. 설립 그라디언트의 버피 코트를 입고 PBMC 선물은 EBV의 또한 다음 FK506에 노출되어 있습니다. EBV - 노출된 세포는 37 ° C 수립 이후 cryopreservation에 대한 LCL을 확대하여 5 % CO 2의 존재에 재배하고 있습니다.
그림 2. EBV에 노출 후 확산을 받아야 것으로 예상 B 세포의 하위 인구의 식별. 취소 감염된 PBMC (A) 또는 PBMC가 HH514 - 16 세포 (B) 또는 FK506의 존재에 B95 - 8 세포 (C)에서 파생된 EBV에 노출하는 것은 일 3 수확했다. 세포는 CD19, CD23, CD58에 대한 감독 및 fluorochrome - 복합 항체로 얼룩진했다. 라이브 세포에 게이팅 후의, 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B와 C) CD19 + B 세포는 CD23과 CD58의 표현을위한 검사되었습니다. CD23의 CD58와 높은 수준 (CD23 CD58 + 하이)를 표현하는 B 세포의 하위 인구가 그려져 있습니다, 오직 능력 변환 EBV (B95 - 8 세포에서 파생된)에 노출 세포에서 관찰했다.
그림 3. EBV에 감염된 세포에서 세포 클러스터의 시각화. PBMC는 FK506과 치료 및 EBV에 감염되었습니다. 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B) 세포 위상 콘트라스트 현미경 (10X 배율)로 일주 후 감염 검사되었습니다. 다섯 주 오래된 lymphoblastoid 전지 라인은 C로 표시됩니다
Discussion
이 문서에서 설명하는 방법은 빠른 불멸화 및 cryopreservation 시간으로 기증자 말초 혈액에서 LCL를 생성합니다. FK506의 사용을 통해, T 세포 면역 반응 억제제를, 그리고 전염성 바이러스의 높은 titers 우리는 주변 혈액 mononuclear 세포에서 EBV에 감염된 B 세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다. 이러한 개입은 후속 실험을 위해 세포의 급속한 확대의 결과로, 설명한 방법보다 효율적으로합니다.
전통적으로 성장 변화는 EBV 6 15 노출 후 주일 가벼운 현미경에 의한 세포의 클러스터의 시각화에 의해 감시되었다. 그러나, 세포의 클러스터링은 EBV - 인한 성장 변환의 특정 표시되지 않습니다. 우리는 이전에 삼일 후미 빠르면 성공적인 결과를 결정하기 위해 정확하고 구체적인 방법을 제공 유동세포계측법 14를 통해 proliferating 세포 인구의 지속적인 신분을 증명하고있다EBV에 B 세포의 보틀 노출.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 K08 AI062732, K12 HD001401 및 1UL1RR024139 - 02과 SB - M에 찰스 H. 후드 재단의 아동 건강 연구소 부여에 의해 투자되었다. 와 스토니 브룩 뉴욕 주립 대학의에서 연구 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
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