Summary
Vi beskriver en metod för att generera förvandlas linjer B-celler med Epstein-Barr-viruset. Vi illustrerar också en roman test som kan identifiera B-celler avsedda att genomgå förvandlingen redan tre dagar efter infektion.
Abstract
Infektion av B-celler med Epstein-Barr virus (EBV) leder till spridning och efterföljande immortalisering, vilket resulterar i upprättandet av lymfoblastoida cell-linjer (LCL) in vitro. Eftersom LCL är latent infekterad med EBV, ger de ett modellsystem för att undersöka EBV latens och virus-driven B celltillväxt och Tumörgenesens 1. LCL har använts för att presentera antigener i olika immunologiska analyser 2, 3. Dessutom kan LCL användas för att generera humana monoklonala antikroppar 4, 5 och ger en potentiellt obegränsad källa när tillgång till grundläggande biologiska material är begränsat 6, 7.
En rad olika metoder har beskrivits för att generera LCL. Tidigare metoder har inkluderat användningen av mitogener som phytohemagglutinin, lipopolysackarid 8 och pokeweed mitogen 9 för att öka effektiviteten i EBV-medierad immortalisering. På senare tid har andra använde immunosuppressiv medel såsom ciklosporin A till hämmar T-cell-medierad Avlivning av infekterade B-celler 7, 10-12.
Den långa tid från EBV-infektion etablering av cellinjer driver krav på snabbare och mer tillförlitliga metoder för EBV-drivna B celltillväxt omvandling. Med hjälp av en kombination av hög titer EBV och ett immunsuppressivt medel, kan vi konsekvent infektera, förändra och skapa LCL från B-celler i perifert blod. Denna metod använder en liten mängd perifera mononukleära celler som är infekterade in vitro-kluster av celler kan påvisas. Närvaron av CD23 med EBV i närvaro av FK506, en T-cell immunsuppressiv. Traditionellt är utväxt av förökar B-celler övervakas genom visualisering av mikroskopiska kluster av celler ungefär en vecka efter infektion med EBV. Klumpar av LCL kan ses med blotta ögat efter flera veckor. Vi beskriver en analys för att avgöra tidigt om EBV-medierad growth omvandling är framgångsrik redan innan mikroskopisk kluster av celler kan påvisas. Närvaron av CD23 hej CD58 + celler observerades så tidigt som tre dagar efter infektion visar ett lyckat resultat.
Protocol
1. EBV stamberedning
- Subkultur exponentiellt växande B95-8 celler (ATCC # CRL 1612, 13) på 3 x 10 5 celler / ml i en 75cm 2 vävnadsodling kolv med steril teknik. Celler odlas i hela RPMI 1640 som innehåller 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum (FBS), Penicillin / streptomycin vid 100U/ml och 100 mikrogram / ml, och amfotericin B vid 0,5 mikrogram / ml vid 37 ° C i närvaro av 5% CO 2.
- Fyrtioåtta timmar senare, resuspendera cellerna i färska komplett RPMI 1640 på 1 x 10 6 celler / ml. Att inducera virus produktion, stimulera celler med 20ng/ml tetradecanoyl phorbol acetat (TPA) i 1 timme i en standard CO 2 inkubator. Tvätta cellerna tre gånger med RPMI 1640 för att ta bort TPA.
- Resuspendera cellerna i den ursprungliga volymen av kompletta RPMI 1640 (från 1,2) och placera kolven i CO 2 inkubator för 96 timmar. Denna metod har visat sig ge hög titer av infektiösa virus parpartiklar 6.
- Centrifugera vid 600 x g under 10 minuter vid 4 ° C för att separera EBV-innehållande supernatant från celler. Filtrera supernatanten genom ett 0,45-micron filter, delprov, och förvara vid -70 ° C i över ett år.
Ett alternativ är att få supernatanten från B95-8 celler som innehåller EBV från ATCC (VR-1492) och använd vid spädning rekommenderas av ATCC.
2. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Rita 10 ml blod från givare till en hepariniserade spruta eller ett hepariniserat blod rör. Späd ut blodet med 20 ml PBS i rumstemperatur i en 50 ml koniska rör.
- Underlag utspädd blod med 15 ml Ficoll Hypaque lymfocyter separation medium. Centrifugera vid 225 x g utan broms i rumstemperatur i 30 minuter.
- Avlägsna buffy coat och i en ny 50 ml koniska rör. Höj volymen till 50 ml med PBS och centrifugera vid 600 xg vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Pour av supernatanten. Tvätta cellerna genom resuspending pelleten i 50 ml PBS och spinning på 600 x g vid rumstemperatur i 10 minuter. Tvätta två gånger på ett liknande sätt.
- Resuspendera tvättade cellerna i 1 ml av kompletta RPMI. Användning 5 mikroliter av celler för att förbereda en 1 / 10 utspädning i Trypan blått. Räkna levande celler med hjälp av en hemocytometer.
- Justera volymen med hela RPMI i ett 25 cm 2 vävnadskultur kolv för att få en cell koncentration på 2 x 10 6 / ml.
3. Infektion med EBV
- Lägg FK506 (AG Scientific) till cellsuspension från 2,6 till en slutlig koncentration av 20 Nm. Placera kolven i CO 2-inkubator vid 37 ° C i en timme.
- Snabbt tina en alikvot av EBV. Ta kolven ur kuvösen och lägger EBV för cellerna till 1 / 10 utspädning. Normalt ger detta utspädning en MOI på 50-100. Snurra flaskan för att blanda och placera den upprätt i CO 2-inkubator vid 37 ° C.
Notera: ei steg 4, görs för att förutsäga framgångsrikt resultat, är ett valfritt steg. Om Steg 4 skall utföras, måste du inkubera ytterligare en kolv av icke-infekterade PBMC på 2 x 10 6 celler / ml som kontroll.
4. Identifiera förökar population av celler (Valfritt steg)
- Förbered FACS buffert: PBS + 5% FBS. Förvaras vid 4 ° C.
- Gör följande antikroppen blandar i 50 mikroliter volym vardera för färgning celler i steg 4,6. Antikropp spädningar bör göras i FACS buffert innehållande 1mg/ml av mus IgG (Sigma) för att hämma icke-specifik bindning av antikroppar.
- enda färgade med PE konjugerat anti-CD23 antikroppar (1 / 50 utspädning)
- single-färgat med FITC-konjugerat anti-CD58 antikroppar (1 / 50 utspädning)
- enda färgade med PE-Cy5 konjugerat anti-CD19 antikroppar (1 / 50 utspädning)
- triple-färgas för CD23, CD58 och CD19 (1 / 50 utspädning vardera)
- enda färgade med PE konjugerad isotypisk kontrollantikropp matchas mot CD23-PE (vid samma koncentration som anti-CD23-antikropp)
- single-färgat med FITC-konjugerad isotypisk kontroll antikropp matchas mot CD58-FITC (vid samma koncentration som anti-CD58-antikropp)
- enda färgade med PE-Cy5 konjugerad isotypisk kontroll antikropp matchas mot CD19-PE-Cy5 (vid samma koncentration som anti-CD19-antikropp)
- triple-färgade med alla tre antikroppar isotypisk kontroll.
- I dag tre efter exponering för EBV, snurra försiktigt kolven för att få en mer enhetlig cellsuspension. Ta 2 ml från flaska till en 2 ml Eppendorf-rör. Snurra slangen i mikrocentrifug vid 3000 rpm i rumstemperatur i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i FACS buffert på 5 x 10 6 till 1 x 10 7 celler / ml.
- Ta bort åtta 50μl portioner i enskilda Eppendorf rör eller en 96-väl V-bottenplatta. Spin rör eller plattan vid 1500 x g.i 3 minuter.
- Kassera supernatanten och vortexrör / platta. Resuspendera cellerna i varje rör / brunn i 50 mikroliter av FACS buffert som innehåller lämpliga antikroppar spädningar upprättats i 4,2.
- Inkubera rören / platta på is i mörker i 30 minuter. Centrifugera cellerna vid 3000 rpm i 3 minuter, avlägsna supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av FACS buffert. Centrifugera cellerna igen och ta bort supernatanten för att slutföra tvätt. Upprepa ytterligare två tvättar.
- Resuspendera cellerna i 200 mikroliter FACS buffert och få data med hjälp av en flödescytometer, förvärva 20 tusen händelser / rör.
- Analysera data med WinMDI (freeware för FACS analys av data på PC). Gate på levande celler med användning av fram-och Side Scatter profiler. Sedan gate levande celler för uttrycket av CD19 + (B-celler markör) efter att ha jämfört med celler som färgats med isotypisk kontroll antikropp matchas mot anti-CD19-antikropp. Tomt CD19 + levande B-celler med fluorescensintensiteten för CD23 på x-axeln och fluorescensintensiteten för CD58 på y-axeln. Bestäm CD23 + och CD58 +-celler genom att jämföra med EBV-exponerade celler färgade med matchade antikroppar isotypisk kontroll. Förekomst av CD23 hej CD58 + celler i EBV-exponerade kultur (Figur 2C) förutspår framgångsrika utväxt av EBV-infekterade tillväxt omvandlas celler. Däremot gör dyka CD23 hej CD58 + celler inte när cellerna inte utsätts för EBV (Figur 2A) eller utsätts för en icke-föreviga stam av EBV (Figur 2B). CD23 hej CD58 +-celler har experimentellt visat att genomgå spridning och därefter etablera LCL (14).
5. Utbyggnad och frysförvaring av LCL
- Visualisering av celler genom ljusmikroskop: Genom en vecka efter EBV-infektion, kluster av celler är synliga i ljusmikroskop. Figur 3 visar ett exempel på tidig mikroskopiska kluster (Figur 3B) i en kolv.
- Eftersom tiden går, mikroskopiska kluster bli större så att klumpar är synligamakroskopiskt i kolven. Figur 3C visar större kluster av celler i etablerade LCL med ljusmikroskop.
- Föda celler: Dubbla volymen av substratet i kulturen kolven på dag 12. Därefter utöka kultur genom att öka sin volym 2-3 gånger med komplett RPMI.
- Periodicitet utfodring celler bör bestämmas utifrån graden av celltillväxt. När odlingsmedium blir gul, är det i allmänhet dags att byta ut medier som ovan. Normalt sker detta en gång per vecka. Dock kan vissa cellinjer behöver matas mer eller mindre ofta. Expandera kultur till 75-100 ml under de närmaste veckorna.
- Frysförvaring: När fryser ner celler, centrifugera celler med 600 x gi 10 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i kallt fryser medium som innehåller 90% FBS och 10% dimetylsulfoxid vid 1 x 10 7 celler / ml. Placera röret i flytande kväve.
6. Representativa resultat:
Lyckat resultat förväntas av förekomsten av CD23 hej CD58 + celler. Cirka 2-3% av levande celler på dag 3-4 efter exponering för EBV bör ha den här profilen (Figur 2C). Andra delpopulationer av CD23 +, CD23 -, CD58 + och CD58 - celler som observerats efter exponering för EBV visa minimal spridning 14. Un-infekterade celler (Figur 2A) och celler som utsätts för EBV från HH514-16 celler (Figur 2B), hyser en icke föreviga stam av EBV, inte visar CD23 hej CD58 + celler.
Du kan också visualisera celler genom ljusmikroskop för att övervaka lyckat resultat: Som tidigare nämnts, inom en vecka efter EBV-infektion, små kluster av celler i kolven är synliga i ljusmikroskop (Figur 3B). Eftersom tiden går och celler utvecklas till LCL, mikroskopiska kluster bli större (figur 3C) så att klumpar är synliga makroskopiskt i kolven.
Figur 1. Arbetsflöde för generering och frysförvaring av lymfoblastoida cell-linjer. Perifert blod centrifugeras genom en Ficoll lutning. PBMC närvarande i buffycoat av en etablerad lutning utsätts för FK506 följt av tillägg av EBV. EBV-exponerade celler odlas vid 37 ° C i närvaro av 5% CO 2 att upprätta och därefter expandera LCL för frysförvaring.
Figur 2. Identifiering av en undergrupp av B-celler förväntas genomgå spridning efter exponering för EBV. Un-smittade PBMC (A) eller PBMC utsätts för EBV från HH514-16 celler (B) eller från B95-8 celler (C) i närvaro av FK506 skördades på dag 3. Cellerna färgades med fluorokromkonjugerade antikroppar riktade mot CD19, CD23 och CD58. Efter gating på levande cells, FN-smittade (A) och EBV-exponerade (B och C) CD19 + B-celler undersöktes för uttryck av CD23 och CD58. En undergrupp av B-celler som uttrycker CD58 och höga nivåer av CD23 (CD23 hi CD58 +), observerades endast i de celler som utsätts för omvandling behöriga EBV (från B95-8 celler), avbildas.
Figur 3. Visualisering av cell kluster i EBV-infekterade celler. PBMC behandlades med FK506 och infekterade med EBV. Un-smittade (A) och EBV-exponerade (B) celler undersöktes en vecka efter infektion av faskontrast mikroskopi (10x förstoring). Fem veckor gamla lymfoblastoid cellinje visas i C.
Discussion
Metoden som beskrivs i detta dokument genererar LCL från givare perifert blod med en snabb immortalisering och tider frysförvaring. Genom att använda FK506, en T-cell immunsuppressiv och höga titrar av infektiösa virus har vi möjlighet att främja spridningen av EBV-infekterade B-celler från perifert blod mononukleära celler. Dessa insatser gör den beskrivna metoden mer effektiv, vilket resulterar i snabb expansion av celler för senare experiment.
Traditionellt har tillväxt omvandlingen följts upp genom visualisering av kluster av celler genom ljusmikroskop ungefär en vecka efter exponering för EBV 6, 15. Dock är kluster av celler inte en specifik indikator på EBV-medierad tillväxthämning omvandling. Vi har tidigare visat sammanhängande identifiering av förökar cellpopulation via flödescytometri 14, som ger en korrekt och specifik metod för att bestämma lyckat resultat redan efter tre dagar akterER exponering av B-celler till EBV.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av NIH bidrag K08 AI062732, K12 HD001401 och 1UL1RR024139-02 och ett barns hälsa forskningsanslag från Charles H. Hood Foundation att SB-M. och av Research Foundation vid State University of New York vid Stony Brook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
