Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing

Summary

Beschreven wij een procedure voor het uiteenvallen van colorectale kanker (CRC) levensvatbare enkele cellen, die vervolgens worden opgevangen op maat antilichaam microarrays herkennen van oppervlakte-antigenen (DotScan CRC microarray) te produceren. Subpopulaties van cellen gebonden aan de microarray kan worden geprofileerd door fluorescentie multiplexen behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorescerende kleurstoffen.

Abstract

De huidige prognose en de classificatie van de CRC is gebaseerd op enscenering systemen die histopathologische en klinische bevindingen te integreren. Echter, in het merendeel van de CRC gevallen cel disfunctie is het resultaat van talrijke mutaties die eiwit-expressie en post-translationele modificatie ¹ te wijzigen.

Een aantal van de cel-oppervlakte-antigenen, met inbegrip van clustervorming van differentiatie (CD) antigenen, zijn geïdentificeerd als potentiële prognostische of gemetastaseerde biomarkers in CRC. Deze antigenen zijn ideale biomarkers als hun uitdrukking vaak verandert met tumorprogressie of interacties met andere celtypen, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM).

Het gebruik van immunohistochemie (IHC) voor kanker sub-classificatie en prognose is goed vastgesteld voor bepaalde typen tumoren ^2,3. Er is echter geen enkele 'marker' zien prognostische waarde groter is dan klinisch-pathologische staging of algemeen geaccepteerd voor gebruik in de routine pathologie rapportage van alle CRC gevallen.

Een meer recente benadering van de prognostische stratificatie van de ziekte fenotypes is gebaseerd op oppervlakte-eiwit profielen met behulp van meerdere 'markers'. Terwijl de expressie profilering van tumoren met behulp van proteomics technieken zoals iTRAQ is een krachtig hulpmiddel voor de ontdekking van biomarkers4, is het niet optimaal voor dagelijks gebruik in diagnostische laboratoria en kunnen niet verschillende celtypen te onderscheiden in een gemengde bevolking. Daarnaast worden grote hoeveelheden van het tumorweefsel nodig zijn voor de profilering van gezuiverde plasmamembraan glycoproteïnen van deze methoden.

In deze video beschreven we een eenvoudige methode voor oppervlakte-proteomics van levensvatbare cellen van uitgesplitste CRC monsters met behulp van een DotScan CRC antilichaam microarray. De 122-antilichaam microarray bestaat uit een standaard 82-antilichaam regio herkennen van een reeks van lijn-specifieke leukocyten markers, adhesie-moleculen, receptoren en merkers van inflammatie en immuunrespons ^5, samen met een satelliet-regio voor de detectie van 40 potentieel prognostische markers voor CRC . Cellen zijn vastgelegd alleen op antilichamen voor die zij uitdragen de bijbehorende antigeen. De cel dichtheid per punt, bepaald door optische scanning, weerspiegelt het aandeel van de cellen die dat antigeen, het niveau van expressie van het antigeen en affiniteit van het antilichaam ^6.

Voor CRC weefsel of normale darmslijmvlies, optische scans weerspiegelen de immunofenotype van gemengde populaties van cellen. Fluorescentie multiplexing kan vervolgens worden gebruikt om de geselecteerde sub-populaties van cellen van belang gevangen op de array profiel. Bijvoorbeeld, Alexa 647-anti-epitheliale cellen (EpCAM, CD326), is een pan-epitheliale differentiatie antigeen dat gebruikt werd om CRC cellen en ook de epitheliale cellen van de normale darmslijmvlies te detecteren, terwijl de phycoerythrine-anti-CD3, werd gebruikt op te sporen infiltrerende T-cellen ^7. De DotScan CRC microarray moet het prototype voor een diagnostisch alternatief voor de anatomisch-based CRC staging systeem.

Protocol

Figuur 1. Workflow voor de bereiding van een suspensie van levende cellen van een chirurgische steekproef van CRC.

1. Klinische monster uitsplitsing

Alle monsters werden verzameld uit de Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australië) en Concord Repatriëring Hospital (Concord West, NSW, Australië) met informed consent onder het Protocol nr. X08-164.

1. Verzamel verse colorectale kanker (CRC) of adenoom exemplaren, en normale darmmucosa ten minste 10 cm van de tumor. Bewaar monsters in gebalanceerde zoutoplossing Hank's pH 7.3 (HBSS) bij 4 ° C tot 12 uur na resectie.
2. Volg de veiligheidsvoorschriften voor menselijke ziekteverwekkers, verwerken alle klinische monsters in een biologisch veiligheidskabinet klasse II. Ontleden de monsters in 2 mm blokjes in een petrischaal met behulp van twee scalpelmesjes.
3. Incubeer tumor en normaal weefsel in aparte Eppendorf buisjes met af en toe voorzichtig mengen gedurende 60 minuten bij 37 ° C met een gelijk volume van RPMI 1640 medium dat 2% (v / v) collagenase type 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) en 0.1 % (w / v) deoxyribonuclease ik van runderen pancreas (DNAse I; Sigma-Aldrich).
4. Force semi-verteerd weefsel door een fijne zeef gaas met behulp van een zuiger uit een 10 ml spuit; wassen cellen door met HBSS.
5. Pass als gevolg celsuspensie door middel van 200 micrometer en 50 um Filcon filters (BD Biosciences) de cel aggregaten te verwijderen. Het grootste deel van het DNA, slijm en cel aggregaten worden verwijderd in deze serie van filtraties.
6. Centrifugeer celsuspensies op 400 xg bij 20 ° gedurende 5 minuten.
7. Resuspendeer celpellets in warmte-geïnactiveerd FCS met 10% dimethylsulfoxide (DMSO), langzaam bevriezen in cryovials en bewaar bij -80 °. De bevriezing proces heeft de neiging om slijm te verminderen in de steekproef en lyseert rode bloedcellen.

2. Monstervoorbereiding voor cel vast te leggen

1. Dooi van monsters snel in een 37 ° waterbad en resuspendeer cellen in 10 ml HBSS te wassen de DMSO.
2. Centrifugeer celsuspensies op 410 xg bij 20 ° gedurende 5 minuten.
3. Giet het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 500 ui van HBSS.
4. Behandel het monster met 0,1% (w / v) DNAse I gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
5. Mix 10 pi van elke celsuspensie met een gelijk volume van trypan blauw en load 10 pi van het mengsel in een hemocytometer. Met behulp van een lichtmicroscoop bij 100-voudige vergroting, graaf levensvatbare cellen, die lijken duidelijk te wijten aan trypan blauw uitsluiting, terwijl de dode cellen nemen de kleurstof. Een minimum 4 x 10 ⁶ levensvatbare cellen nodig is voor cel vast te leggen op de microarray.
6. Na de DNAse behandeling resuspendeer de celsuspensie in 10 ml HBSS en centrifugeer bij 410 xg bij 20 ° gedurende 5 minuten.
7. Giet het supernatant en resuspendeer celpellets in RPMI 1640 tot een uiteindelijk volume van 200 pi.

3. Antilichaam microarray cel vast te leggen

1. Bevochtig de DotScan antilichaam microarray door dompelen van de nitrocellulose sectie in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor ongeveer 20 s. Veeg voorzichtig de glazen randen van de microarray met gevouwen Kimwipes, het vermijden van het aanraken van de nitrocellulose sectie.
2. Voeg het water aan de microarray incubatie lade om een ​​vochtige kamer te geven. Plaats de microarray in de kamer en de pipet de celsuspensie in RPMI 1640 op de vochtige nitrocellulose sectie. Pipetteer druppels op elke hoek van de nitrocellulose te zorgen voor een gelijkmatige spreiding van cellen.
3. Incubeer de microarrays bij 37 ° C gedurende 1 uur De incubatie kan cellen om zich te vestigen en in contact komen met antilichamen op de microarray. Cellen die oppervlakte-antigenen die overeenkomen met de antilichamen ze op zullen worden vastgelegd.
4. Na incubatie, dip de microarrays voorzichtig en verticaal in drie troggen met ten minste 15 ml PBS te wassen ongebonden cellen (20 s per wasbeurt).
5. Bereid 3,7% (w / v) formaldehyde in PBS op de cellen en antilichamen met behulp van cross-linking fix. Voorzichtig pipet ongeveer 1 ml tot de nitrocellulose deel van de microarray te dekken. Incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
6. Volgende duik microarrays in 3 veranderingen van PBS (15 ml, 30 s per stuk) uit te spoelen teveel formaldehyde.
7. Veeg de randen en de achterkant van het glas dia met Kimwipes en scan de microarray met behulp van de DotScan scanner, terwijl de nitrocellulose sectie vochtig is. De optische scan verleent de antigeen expressie patroon van een gemengde celpopulatie bijvoorbeeld CRC-cellen, leukocyten en andere stromale cellen van de tumor.

4. Fluorescentie multiplexing

1. Haal de microarray van de scanner en toe te passen 200 pi van de blokkerende buffer (2% w / v BSA, 2% hitte-geïnactiveerd AB-serum mens, PBS, pH 7,3). Incubeer het in de microarray lade bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
2. Bereid de multiplexing oplossing in een Eppendorf buis bekleed met aluminiumfolie: 20 pL phycoerythrin-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australië, # IM12824; 1/7.5 de uiteindelijke verdunning), 10 pi Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA, 1 / 15 verdunning), 2 pi van hitte-geïnactiveerd AB-serum mens (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australië) en 118 pi van het blokkeren van buffer.
3. Afvoer van overtollig blokkerende buffer van de microarray en pipet de multiplexing oplossing op de nitrocellulose gedeelte, het verspreiden van uniform. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
4. Dompel de microarray verticaal in drie dalen van 15 ml verse PBS; (30 s per stuk).
5. Laat de microarrays drogen in het donker en bewaar bij 4 ° C in een dia doos. De microarray kan worden opgeslagen in het donker voor maximaal 3 maanden zonder verlies van fluorescentie.
6. Scan de droge microarray met behulp van een Typhoon FLA 9000 scanner (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australië) met een resolutie ingesteld op 50 (532 nm laser, 580 BP30 emissie filter voor PE. 633 nm laser en 670 BP30 emissie-filter voor Alexa 647). De microarrays worden gescand met de nitrocellulose kant naar beneden op het glas scanner lade.
7. Sla de fluorescerende beelden als TIFF-bestanden en het gebruik van Photoshop ingesteld beeldformaat 17 x 25 cm en de resolutie tot 72 pixels / cm. Importeer de afbeelding in het DotScan analyse software om de intensiteit van de stippen te analyseren.
8. De DotReader een digitale afbeelding van de dot binding patroon en kwantificeert de dichtheid van de cel bindend voor elk antilichaam stip op een 8 bit grijsheid schaal (1-256 U). Af en toe niet-specifieke binding isotype controle werd afgetrokken van bindende waarden voor antilichamen met bijbehorende immunoglobuline isotypen. Dot fluorescentie-intensiteiten voor elke microarray werden genormaliseerd ten opzichte van de helderste stip op 100% intensiteit. Signaal / kracht spot werd opgenomen in een. Xml-bestand (raw data) of vertegenwoordigd zijn als een staafdiagram in een. Pdf-bestand (eindrapport)
9. Microarray heatsmaps en hiërarchische clustering werden uitgevoerd met behulp van MultiExperiment Viewer (MeV) versie 4.4 van de TM4 Microarray Software Suite ( http://www.tm4.org/mev.html ). Hiërarchische clustering werd uitgevoerd op de achtergrond gecorrigeerde gegevens met behulp van MeV met complete linkage analyse. Euclidische afstand werd gebruikt voor de gelijkenis te meten. De 2-tailed Student's t-test met gelijke variantie werd gebruikt om de statistische significantie van de resultaten bepalen.

5. Representatieve resultaten:

De resultaten van de DotScan microarray moeten tonen consistent cel binding patronen tussen dubbele arrays. Sterke afstemming dot binding (CD44/CD29) maakt een rooster te worden geplaatst over de array gebied. Figuur 2 toont een voorbeeld van een optimale cel te vangen en multiplexing. Figuur 3 toont een aantal problemen die zich tijdens de celdeling te vangen en de mogelijke oplossingen.

De microarray cel binding resultaten kunnen worden gekwantificeerd door het meten van dot intensiteiten uitgedrukt op een schaal grijsheid variërend van 1 tot 256. Figuur 4 toont numerieke gegevens van 58 chirurgische CRC monsters, gekleurd met EpCAM-Alexa 647 antilichaam, als een heatmap met hiërarchische clustering. Hoewel het aantal monsters is beperkt, CRC's van hetzelfde stadium hebben de neiging te clusteren in dezelfde groep.

Figuur 2. Cell binding patroon van klinische colorectale kanker tumor (Australian Clinic-Pathologische Staging, ACP podium B1). (A) DotScan antilichaam belangrijke laten zien locaties van antilichamen voor de linker helft van het duplicaat microarray (beschreven). Het bovenste deel bevat de oorspronkelijke 82 antilichamen van de DotScan leukemie microarray. Een extra 40-antilichamen, die overeenkomen met specifieke oppervlakte antigenen blijken te zijn up-gereguleerd in de literatuur, werden toegevoegd als microarray een CRC 'satelliet'. Het onderste deel bestaat uit isotype controle antilichamen (b) Optische beeld van de CRC-cellen te binden aan de microarray. (C) CD3 fluorescentie-afbeelding met T-cellen. (D) EpCAM fluorescentie-afbeelding met CRC cellen.

Figuur 3. Voorbeelden van slechte DotScan resultaten en mogelijke oplossingen. (A) lage cel binding; oplossing: zorg ervoor dat in ieder geval 4x106 levensvatbare cellen bevinden zich op de array (b) isotype controle bindende en niet-specifieke binding cel; oplossing: warmte-geïnactiveerd humaan AB serum toe te voegen aan monster voor incubatie op microarray te minimaliseren isotype controle bindend. Af en toe een kleine hoeveelheid van niet-specifieke binding van cellen aan de nitrocellulose gebeurt met CRC monsters en heeft geen significante invloed op de resultaten. (C) Nitrocellulose uitdroging tijdens incubatie; oplossing: zorgen steekproef omvat de hele nitrocellulose sectie en microarray is geïncubeerd op een vlakke ondergrond. (D) Hoge achtergrond artefacten; oplossing: zorgen voor demicroarray is grondig wassen na incubatie.

Figuur 4. DotScan analyse software gegenereerd staafdiagrammen die cel bindend dichtheden op een grijsheid schaal van 1 tot 256. Getallen op de as hebben betrekking op CD antigenen. Andere afkortingen zijn TCR, T-cel-receptor; κ, λ, immunoglobuline lichte ketens, sig, oppervlakte immunoglobuline, DCC, verwijderd in colorectale kanker eiwit; EGFR, epidermale groeifactor receptor; FAP, fibroblast activatie-eiwit; HLA-A, B, C HLA-DR, menselijke leukocyten antigenen DR en A, B, C respectievelijk MICA, MHC klasse I-keten-related protein A; MMP-14, matrix metallopeptidase 14; PIGR, polymere immunoglobuline receptor; TSP-1, thrombospondine-1; Mabthera, gehumaniseerd anti-CD20. Klik hier om een grotere foto te bekijken .

Discussion

In deze video laten we zien hoe de DotScan antilichaam microarray kan gebruikt worden in een eenvoudige, semi-kwantitatieve manier om de oppervlakte-antigeen profielen studie voor celpopulaties van CRC weefsel.

Het verkrijgen van een levensvatbare enkele celsuspensie van weefsel is cruciaal voor het succes van het experiment, omdat energie-afhankelijke processen (bijv., antigeen aftopping en / of pseudopodia vorming) lijken noodzakelijk voor een stevige binding van hele cellen om antilichamen stippen tijdens de incubatie, terwijl de dode cellen worden vervolgens gewassen uit. Type 1 collagenase werd aanvankelijk gebruikt voor weefsel disaggregation8, maar werd vervangen door collagenase 4, die veroorzaakt minder schade aan de celmembranen, want het bevat minder protease verontreinigingen. Deze verandering heeft geen invloed op celopbrengst, levensvatbaarheid of binding patronen. Slijm van sommige tumoren en controlemonsters minder celopbrengst en verstoord cel vast te leggen. Dit kleverigheid van het slijm werd geminimaliseerd door de opslag van opgesplitste celsuspensie in 10% DMSO / FCS bij -80 ° C, vermoedelijk als gevolg van veranderingen in slijm eigenschappen na invriezen en ontdooien ^9. Vervolgens werden alle monsters bevroren toestand bewaard in 10% DMSO / FCS na disaggregatie en werden snel ontdooid om levensvatbare celsuspensies te produceren, met een consistente binding patronen. Monsters met <50% levensvatbaarheid of met een slechte binding met de aanpassing / huishoudelijke dienst dots (CD44/CD29) werden weggelaten uit de analyse.

Een paar antilichaam klonen toonden een verminderde affiniteit wanneer gebonden aan de nitrocellulose mogelijk als gevolg van een verandering in de bouw, bijvoorbeeld, de prominente CRC marker CD15s hadden heel weinig of geen cel bindend. Antilichamen die consequent tentoongesteld negatieve resultaten moeten worden vervangen door andere hybridomaklonen. Een andere mogelijke oorzaak van een slechte werking van een aantal antistoffen was interferentie aan binding door bovine serum albumine (BSA). BSA-vrije antistoffen moet worden gebruikt op de microarray waar mogelijk.

Hoewel grote cohorten patiënten nodig zijn voor statistische analyse van microarray data, hiërarchische clustering van onze resultaten (58 klinische monsters) is bemoedigend. Normalisatie van gegevens met behulp van methoden beschreven door Yang ¹⁰ moet zorgen voor een betere statistische significantie.

Terwijl de DotScan antilichaam microarray maakt bepaling van de nieuwe patronen van expressie van de bekende CD-antigenen, is het meest effectief bij gebruik in combinatie met proteomische discovery technieken, zoals 2-dimensionale gel elektroforese en LC-iTRAQ-MS, te identificeren nieuwe differentieel overvloedige eiwitten . Dergelijke nieuwe eiwitten zijn mogelijke markers; overeenkomstige antilichamen kunnen worden toegevoegd aan de array, en gevalideerd met klinische CRC monsters.

Het gebruik van fluorescent gelabelde antilichamen om sub-sets van de gevangen cellen profiel biedt een krachtige DotScan platform voor de analyse van gemengde populaties van cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6136-10X1L	Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II	Westinghouse	1687-2340/612
Surgical blades	Livingstone	090609	Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes	Sigma-Aldrich	R4130-10X1L
Collagenase type 4	Worthington Biochemical	4188
Deoxyribonuclease 1	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Terumo Syringe (10 mL)	Terumo Medical Corp.	SS+10L	Box of 100
Filcon filter (200 μm)	BD Biosciences	340615
Filcon filter (50 μm)	Filcon filter (50 µm)	Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603
Fetal calf serum	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	7017
Dimethyl sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Hemocymeter Technocolor Neubar	Hirschmann	not available
Light microscope	Nikon Instruments	Nikon TMS
Cyrovial tubes	Greiner Bio-One	121278
Cryo freezing contrainer	Nalge Nunc international	5100-0001
DotScan antibody microarray kit	Medsaic	not available
DotScan microarray wash tray	Medsaic	not available
KimWipes	Kimberly-Clark Corporation	4103
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	F1635-500ML
DotReaderTM	Medsaic	not available
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418-10G
Heat-inactivated AB serum 2%	Invitrogen	34005100
Phyc–rythrin-conjugated CD3	Beckman Coulter Inc.	ET386
AlexaFluor647-conjugated EpCAM	BioLegend	324212
Typhoon FLA 9000	GE Healthcare	28-9558-08	532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4	TM4 Microarray Software Suite	Open – source software (Ref 11)