ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
हम कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के लिए व्यवहार्य एकल कक्षों, जो तब अनुकूलित सतह एंटीजन (DotScan सीआरसी माइक्रोएरे) को पहचानने एंटीबॉडी प्रोटीन पर कब्जा कर रहे हैं उत्पादन के disaggregation के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. माइक्रोएरे के लिए बाध्य कोशिकाओं के उप - आबादी प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट रंजक के साथ टैग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग बहुसंकेतन द्वारा profiled किया जा सकता है है.
Protocol
चित्रा 1. सीआरसी की एक शल्य नमूना से जीवित कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी के लिए कार्य प्रवाह .
1. क्लीनिकल नमूना disaggregation
प्रोटोकॉल X08 164 सं के तहत सूचित सहमति के साथ सभी नमूनों रॉयल प्रिंस अल्फ्रेड अस्पताल (Camperdown, एनएसडब्लयू, ऑस्ट्रेलिया) और Concord प्रत्यावर्तन अस्पताल (Concord पश्चिम, एनएसडब्लयू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए थे.
- ताजा कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) या ग्रंथ्यर्बुद नमूनों, और सामान्य आंत्र mucosa ट्यूमर से कम से कम 10 सेमी लीजिए. हांक संतुलित नमक समाधान 7.3 (4 बजे HBSS) पीएच ° सी में लकीर के बाद 12 घंटे के लिए स्टोर नमूने.
- मानव रोगज़नक़ों के लिए सुरक्षा नियमों का पालन करें, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट वर्ग द्वितीय में सभी नैदानिक नमूनों की प्रक्रिया. दो स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर एक पेट्री डिश में 2 मिमी cubes में नमूने काटना.
- कभी कभी 37 में कोमल 60 मिनट के लिए मिश्रण के साथ अलग Eppendorf ट्यूबों में ट्यूमर और सामान्य ऊतकों सेते ° सी RPMI १,६४० 2% (v / v) collagenase 4 प्रकार (Worthington, Lakewood, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमरीका) और 0.1 युक्त मध्यम के एक बराबर मात्रा के साथ % गोजातीय pancrease से deoxyribonuclease (w / v) मैं (DNase मैं, सिग्मा Aldrich).
- सेना के एक ठीक तार की जाली एक 10 एमएल सिरिंज से एक गोताख़ोर का उपयोग झरनी के माध्यम से ऊतक अर्द्ध पचा, HBSS के साथ के माध्यम से धोने की कोशिकाओं.
- 200 सुक्ष्ममापी और 50 सुक्ष्ममापी Filcon फिल्टर (बी बायोसाइंसेज) के माध्यम से सेल निलंबन परिणामस्वरूप सेल समुच्चय को दूर दर्रा. डीएनए बलगम, और सेल समुच्चय के अधिकांश filtrations की इस श्रृंखला में हटा रहे हैं.
- 5 मिनट के लिए 20 ° पर 400 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- गर्मी निष्क्रिय FCS में Resuspend सेल छर्रों 10% डाइमिथाइल sulphoxide (DMSO) युक्त, cryovials -80 ° और दुकान में धीरे धीरे स्थिर. जमने की प्रक्रिया के नमूने में बलगम कम देता है और लाल रक्त कोशिकाओं lyses.
2. सेल पर कब्जा करने के लिए नमूना तैयार
- 37 ° पानी और DMSO के बाहर धोने HBSS की 10 एमएल में स्नान resuspend कोशिकाओं में जल्दी नमूने पहले गला लें.
- 5 मिनट के लिए 20 ° पर 410 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निथारना और HBSS के 500 μL में सेल गोली resuspend.
- 0.1% (w / v) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए DNase मैं के साथ नमूना समझो.
- Trypan नीले रंग की एक बराबर मात्रा के साथ प्रत्येक कक्ष निलंबन का 10 μL मिक्स और hemocytometer में मिश्रण की 10 μL लोड. 100 गुना बढ़ाई पर एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, गिनती व्यवहार्य कोशिकाओं है, जो trypan नीले अपवर्जन के लिए कारण स्पष्ट दिखाई देते हैं, जबकि मृत कोशिकाओं को डाई ले. न्यूनतम 4 x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं माइक्रोएरे पर सेल पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है.
- DNase उपचार के बाद, 10 एमएल HBSS और अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 20 ° पर 410 XG पर सेल निलंबन resuspend.
- 200 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए और 1640 RPMI में supernatants resuspend सेल छर्रों निथारना.
3. एंटीबॉडी माइक्रोएरे सेल पर कब्जा
- फॉस्फेट nitrocellulose अनुभाग में सूई से DotScan एंटीबॉडी माइक्रोएरे गीला लगभग 20 एस के लिए खारा (पीबीएस) buffered ध्यान से Kimwipes साथ जोड़कर माइक्रोएरे के गिलास किनारों पोंछ nitrocellulose अनुभाग को छूने से परहेज.
- माइक्रोएरे ऊष्मायन ट्रे के लिए पानी जोड़ें करने के लिए एक नम चैम्बर प्रदान. चेंबर में माइक्रोएरे प्लेस और नम nitrocellulose अनुभाग पर RPMI 1640 में सेल निलंबन विंदुक. पिपेट nitrocellulose के प्रत्येक कोने पर चला जाता है एक भी कोशिकाओं के प्रसार करने के लिए सुनिश्चित करें.
- 37 ° C पर एक एच. के लिए प्रोटीन का सेते ऊष्मायन कोशिकाओं को बसने और माइक्रोएरे पर एंटीबॉडी के साथ संपर्क में आने के लिए अनुमति देता है. सतह एंटीजन एंटीबॉडी वे देश के लिए इसी व्यक्त कक्ष पर कब्जा कर लिया जाएगा.
- ऊष्मायन के बाद, प्रोटीन धीरे और खड़ी से तीन कम से कम 15 एमएल पीबीएस युक्त अनबाउंड कोशिकाओं (धो प्रति 20 एस) के लिए रवाना धोने troughs में डुबकी.
- 3.7% (w / v) पीबीएस में formaldehyde तैयार पार से जोड़ने की कोशिकाओं और एंटीबॉडी तय करने के लिए. धीरे लगभग 1 एमएल विंदुक माइक्रोएरे के nitrocellulose अनुभाग को कवर. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- अतिरिक्त formaldehyde धोने, अगला डुबकी पीबीएस (30 प्रत्येक 15 एमएल) के 3 परिवर्तन में प्रोटीन.
- पोछो किनारों और Kimwipes के साथ गिलास स्लाइड के पीछे और DotScan स्कैनर का प्रयोग करते समय माइक्रोएरे स्कैन, nitrocellulose अनुभाग नम है. ऑप्टिकल एक मिश्रित सेल की आबादी जैसे सीआरसी कोशिकाओं, leukocytes और ट्यूमर के अन्य stromal कोशिकाओं के प्रतिजन अभिव्यक्ति पैटर्न स्कैन प्रदान करता है.
4. बहुसंकेतन प्रतिदीप्ति
- माइक्रोएरे स्कैनर से निकालें और अवरुद्ध बफर (2% BSA w / ध्, 2% अटल बिहारी गर्मी निष्क्रिय मानव सीरम, Pbs, 7.3 पीएच) के 200 μL लागू. यह 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर माइक्रोएरे ट्रे में सेते हैं.
- Multip तैयारएक Eppendorf ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर में समाधान lexing: 20 μL Phycoerythrin विरोधी CD3 (के Beckman कल्टर, Gladesville, एनएसडब्लयू, ऑस्ट्रेलिया, IM12824 #; 1/7.5 अंतिम कमजोर पड़ने), 10 μL Alexa Fluor 647 - विरोधी EpCAM (Biolegend, सैन डिएगो, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका, कमजोर पड़ने 1 / 15), 2 गर्मी निष्क्रिय मानव अटल बिहारी (सिग्मा Aldrich, Castle हिल, एनएसडब्लयू, ऑस्ट्रेलिया) सीरम और अवरुद्ध बफर के 118 μL μL.
- माइक्रोएरे से अधिक अवरुद्ध बफर नाली और nitrocellulose अनुभाग पर बहुसंकेतन समाधान पिपेट, समान फैल. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- 15 मिलीलीटर ताजा पीबीएस के तीन troughs में खड़ी माइक्रोएरे डुबकी, (30 प्रत्येक).
- 4 में काले और दुकान में शुष्क प्रोटीन ° सी एक स्लाइड बॉक्स में. माइक्रोएरे करने के लिए 3 महीने के लिए अंधेरे में प्रतिदीप्ति की हानि के बिना संग्रहित किया जा सकता है.
- सूखी 50 से सेट संकल्प के साथ एक आंधी FLA 9000 स्कैनर (जीई हेल्थकेयर, Rydalmere, एनएसडब्लयू, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग माइक्रोएरे स्कैन (532 एनएम लेजर, 580 पीई के लिए BP30 उत्सर्जन फिल्टर 633 एनएम लेजर और 647 Alexa के लिए 670 BP30 उत्सर्जन फिल्टर). प्रोटीन nitrocellulose कांच स्कैनर ट्रे पर नीचे का सामना करना पड़ पक्ष के साथ स्कैन कर रहे हैं.
- 17 से झगड़ा फ़ाइलों के रूप में फ्लोरोसेंट छवियों और फ़ोटोशॉप सेट का उपयोग कर छवि आकार सहेजें x 25 सेमी और 72 पिक्सल / सेमी के संकल्प. DotScan विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवि को आयात करने के लिए डॉट्स की तीव्रता का विश्लेषण.
- DotReader डॉट बाध्यकारी पैटर्न के एक डिजिटल छवि पर कब्जा और एक 8 बिट भूरापन पैमाने (1-256 यू) पर प्रत्येक एंटीबॉडी डॉट पर सेल बंधन के घनत्व quantifies. समसामयिक निर्धारण गैर विशिष्ट नियंत्रण बाध्यकारी बाध्यकारी मूल्यों से इसी immunoglobulin isotypes साथ एंटीबॉडी के लिए subtracted था. प्रत्येक माइक्रोएरे के लिए डॉट प्रतिदीप्ति तीव्रता 100% तीव्रता में प्रतिभाशाली सेट डॉट के खिलाफ normalized थे. सिग्नल / हाजिर ताकत एक xml फ़ाइल (कच्चे डेटा) में दर्ज की गई थी या एक में एक बार चार्ट के रूप में प्रतिनिधित्व. Pdf फ़ाइल (अंतिम रिपोर्ट)
- माइक्रोएरे heatsmaps और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग TM4 माइक्रोएरे सॉफ्टवेयर सुइट (से MultiExperiment व्यूअर (MeV) 4.4 संस्करण का उपयोग किया गया http://www.tm4.org/mev.html ). पदानुक्रमित क्लस्टरिंग पृष्ठभूमि समायोजित पूरा उठाना विश्लेषण के साथ MeV का उपयोग डेटा पर प्रदर्शन किया गया था. इयूक्लिडियन दूरी समानता उपाय के लिए इस्तेमाल किया गया था. 2 पूंछ बराबर प्रसरण के साथ विद्यार्थी का t-परीक्षण के परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
DotScan माइक्रोएरे से परिणाम डुप्लिकेट सरणियों के बीच लगातार सेल बंधन पैटर्न दिखाने चाहिए. मजबूत संरेखण डॉट बंधन (CD44/CD29) करने के लिए एक ग्रिड सरणी क्षेत्र पर रखा जा सक्षम बनाता है. चित्रा 2 इष्टतम सेल पर कब्जा है और बहुसंकेतन का एक उदाहरण दिखाता है. चित्रा 3 कुछ आम सेल पर कब्जा है और संभव समाधान के दौरान सामना करना पड़ा समस्याओं से पता चलता है.
माइक्रोएरे सेल बाध्यकारी परिणाम डॉट एक धूसरत्व पैमाने पर 1 से 256 को लेकर व्यक्त की तीव्रता को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 4 में 58 शल्य सीआरसी नमूने से संख्यात्मक डेटा, पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के साथ एक हीटमैप के रूप में EpCAM Alexa 647 एंटीबॉडी के साथ दाग, दिखाता है. हालांकि नमूनों की संख्या सीमित है, एक ही चरण के सीआरसी एक ही समूह में क्लस्टर के लिए करते हैं.
चित्रा 2 सेल नैदानिक कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमर (ऑस्ट्रेलियाई मचान क्लिनिक रोग, एसीपी चरण B1) के बंधन पैटर्न. (क) DotScan एंटीबॉडी कुंजी डुप्लिकेट माइक्रोएरे (रेखांकित) के बाईं आधे के लिए एंटीबॉडी के स्थानों को दिखा. शीर्ष अनुभाग DotScan लेकिमिया माइक्रोएरे के मूल 82 एंटीबॉडी शामिल हैं. एक अतिरिक्त 40 एंटीबॉडी, विशिष्ट सतह प्रतिजनों के लिए इसी साहित्य में विनियमित किया जा पाया, एक CRC 'उपग्रह' माइक्रोएरे के रूप में जोड़ा गया. नीचे अनुभाग निर्धारण नियंत्रण (ख) सीआरसी कोशिकाओं के ऑप्टिकल छवि माइक्रोएरे के लिए बाध्य एंटीबॉडी के होते हैं. (ग) CD3 प्रतिदीप्ति छवि टी कोशिकाओं दिखा. (घ) EpCAM प्रतिदीप्ति छवि सीआरसी कोशिकाओं दिखा.
चित्रा 3 गरीब DotScan परिणाम और संभव समाधान के उदाहरण.. (क) कम सेल बंधन, समाधान:; माइक्रोएरे पर ऊष्मायन पहले नमूना गर्मी निष्क्रिय मानव अटल बिहारी सीरम जोड़ने के लिए कम से कम करने समाधान सुनिश्चित करें कि कम से कम 4x106 व्यवहार्य कोशिकाओं सरणी पर (ख) नियंत्रण निर्धारण बाध्यकारी और गैर विशिष्ट बंधन सेल हैं निर्धारण नियंत्रण बाइंडिंग. कभी कभी, nitrocellulose करने के लिए कोशिकाओं की गैर विशिष्ट बंधन की एक छोटी राशि सीआरसी नमूनों के साथ होता है और परिणाम काफी प्रभावित नहीं. (ग) nitrocellulose ऊष्मायन के दौरान बाहर सुखाने, समाधान: यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना पूरे nitrocellulose अनुभाग को शामिल किया गया और माइक्रोएरे एक फ्लैट सतह पर incubated है. (घ) उच्च पृष्ठभूमि कलाकृतियों, समाधान: सुनिश्चितमाइक्रोएरे अच्छी तरह से निम्नलिखित ऊष्मायन धोया जाता है.
चित्रा 4. DotScan विश्लेषण सॉफ्टवेयर पट्टी चार्ट का प्रतिनिधित्व एक धूसरत्व पैमाने पर सेल घनत्व बाध्यकारी 1 से 256 को लेकर उत्पन्न. अक्ष पर संख्या सीडी एंटीजन को देखें. Κ, λ, immunoglobulin प्रकाश जंजीरों;, हस्ताक्षर, सतह immunoglobulin, डीसीसी, कोलोरेक्टल कैंसर प्रोटीन में नष्ट कर दिया, EGFR, epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर, FAP, fibroblast सक्रियण प्रोटीन, एचएलए - ए, बी, अन्य संक्षिप्त TCR, टी सेल रिसेप्टर एचएलए DR-सी, मानव ल्युकोसैट एंटीजन डॉ और ए, बी, सी क्रमशः, अभ्रक, MHC मैं प्रोटीन श्रृंखला से संबंधित वर्ग एक, MMP-14, मैट्रिक्स 14 metallopeptidase; PIGR, polymeric immunoglobulin रिसेप्टर, टीएसपी-1, thrombospondin-1; Mabthera, humanised विरोधी CD20 यहाँ क्लिक करें बड़ी छवि को देखने .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे DotScan एंटीबॉडी माइक्रोएरे एक सरल, अर्द्ध मात्रात्मक सीआरसी ऊतकों से सेल आबादी के लिए सतह प्रतिजन प्रोफाइल का अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
ऊतक से एक व्यवहार्य एकल कक्ष निलंबन प्राप्त प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऊर्जा पर निर्भर प्रक्रियाओं (जैसे, प्रतिजन कैपिंग और / या pseudopodia गठन) के लिए फर्म पूरे कोशिकाओं के ऊष्मायन के दौरान एंटीबॉडी डॉट्स के लिए बाध्य के लिए आवश्यक हो दिखाई देते हैं, जबकि मृत कोशिकाओं बाद में धुल रहे हैं. टाइप 1 collagenase शुरू disaggregation8 ऊतक के लिए नियोजित किया गया था, लेकिन 4 collagenase जो कोशिका झिल्लियों को कम नुकसान का कारण बनता है, के रूप में यह कम protease contaminants के शामिल द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था. यह परिवर्तन सेल उपज, व्यवहार्यता या बाध्यकारी पैटर्न को प्रभावित नहीं किया. कुछ ट्यूमर और नियंत्रण के नमूने से बलगम सेल उपज कम और सेल पर कब्जा के साथ दखल. बलगम की यह चिपचिपाहट disaggregated -80 में 10% / DMSO FCS में सेल निलंबन ° सी, ठंड और 9 विगलन के बाद बलगम गुणों में परिवर्तन की वजह से संभवतः के भंडारण के द्वारा कम से कम किया गया था. बाद में सभी नमूने संग्रहीत किया गया disaggregation के बाद 10% / DMSO FCS में जमे हुए थे और तेजी से करने के लिए व्यवहार्य सेल निलंबन अनुरूप बाध्यकारी पैटर्न के साथ, उत्पादन thawed. <50% व्यवहार्यता या संरेखण / गृह व्यवस्था डॉट्स (CD44/CD29) पर गरीब बाध्यकारी दिखाने के साथ नमूने के विश्लेषण से छोड़े गए थे.
कुछ एंटीबॉडी क्लोन कम आत्मीयता से पता चला जब nitrocellulose करने के लिए बाध्य रचना, जैसे में एक परिवर्तन के कारण संभवतः प्रमुख सीआरसी मार्कर CD15s बहुत कम या कोई सेल बंधन था. एंटीबॉडी कि लगातार नकारात्मक परिणामों का प्रदर्शन अलग हाइब्रिडोमा क्लोन के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. कुछ एंटीबॉडी के गरीब गतिविधि का एक अन्य संभावित कारण गोजातीय सीरम albumin (BSA) द्वारा बाध्यकारी करने के लिए हस्तक्षेप किया गया था. BSA मुक्त एंटीबॉडी माइक्रोएरे पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए जहां संभव है.
हालांकि बड़े रोगी साथियों माइक्रोएरे डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण, हमारे परिणाम के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग (58 नैदानिक नमूनों) के लिए आवश्यक हैं बढ़ावा दिया गया है. 10 यांग द्वारा वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर डेटा के सामान्य सुधार सांख्यिकीय महत्व प्रदान करना चाहिए.
जबकि DotScan एंटीबॉडी माइक्रोएरे ज्ञात सीडी प्रतिजनों की अभिव्यक्ति के नए पैटर्न के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है, यह सबसे प्रभावी है जब जैसे दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन और LC-iTRAQ एमएस प्रोटिओमिक खोज तकनीक के साथ संयोजन में उपयोग किया, उपन्यास विभिन्न प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की पहचान . इस तरह के उपन्यास प्रोटीन संभावित मार्करों हैं, इसी एंटीबॉडी सरणी के लिए जोड़ा जा सकता है, और नैदानिक सीआरसी नमूनों के साथ मान्य है.
fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए कब्जा कर लिया कोशिकाओं के उप - सेट प्रोफ़ाइल कक्षों की मिश्रित आबादी के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली DotScan मंच प्रदान करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम रॉयल प्रिंस अल्फ्रेड और Concord प्रत्यावर्तन अस्पताल सीआरसी और सामान्य आंत्र mucosa की ताजा नमूनों को इकट्ठा करने के लिए शारीरिक पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में स्टाफ धन्यवाद. काम कैंसर संस्थान के न्यू साउथ वेल्स translational कार्यक्रम अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington Biochemical | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo Medical Corp. | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 µm) | Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603 | |
| Fetal calf serum | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon Instruments | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner Bio-One | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalge Nunc international | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark Corporation | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phyc–rythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter Inc. | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed,, et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
Tags
इम्यूनोलॉजी 55 अंक कोलोरेक्टल कैंसर leukocytes एंटीबॉडी माइक्रोएरे बहुसंकेतन प्रतिदीप्ति सीडी प्रतिजनोंErratum
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 07/03/2015.
Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au
