Carcinoma del colon-retto Profilo delle proteine ​​di superficie L'utilizzo di un anticorpo Microarray e Multiplexing fluorescenza

Summary

Abbiamo descritto una procedura per la disaggregazione del tumore del colon-retto (CRC) per la produzione di singole cellule vitali, che vengono poi catturate su microarray anticorpi personalizzato riconoscere gli antigeni di superficie (DotScan CRC microarray). Sotto-popolazioni di cellule legato al microarray può essere profilato con multiplazione a fluorescenza utilizzando anticorpi monoclonali taggati con coloranti fluorescenti.

Abstract

La prognosi attuale e classificazione dei CRC si basa sulla messa in scena di sistemi che integrano i risultati istopatologici e clinici. Tuttavia, nella maggior parte dei casi CRC, la disfunzione delle cellule è il risultato di numerose mutazioni che modificano l'espressione di proteine ​​e modificazioni post-traduzionali ^1.

Un certo numero di antigeni di superficie cellulare, tra cui cluster di differenziazione (CD) antigeni, sono stati identificati come potenziali o biomarker prognostico nel CRC metastatico. Questi antigeni rendono ideale come biomarcatori spesso la loro espressione cambia con la progressione del tumore o interazioni con altri tipi di cellule, come i linfociti infiltranti il ​​tumore (TILS) e macrofagi associati al tumore (TAM).

L'uso di immunoistochimica (IHC) per il tumore sub-classificazione e la prognosi è ben consolidata per alcuni tipi di tumore ^2,3. Tuttavia, nessun singolo 'marker' ha mostrato un significato prognostico maggiore clinico-patologici di sosta o guadagnato un largo consenso per l'uso in routine patologia segnalazione di tutti i casi CRC.

Un approccio più recente stratificazione prognostica dei fenotipi malattia si basa su profili di proteina di superficie utilizzando più 'marker'. Mentre profili di espressione dei tumori con tecniche di proteomica, come iTRAQ è un potente strumento per la scoperta di biomarkers4, non è ottimale per l'uso di routine nei laboratori diagnostici e non può distinguere i diversi tipi di cellule in una popolazione mista. Inoltre, grandi quantità di tessuto tumorale sono necessari per il profiling delle glicoproteine ​​membrana plasmatica purificati da questi metodi.

In questo video abbiamo descritto un metodo semplice per la profilatura proteoma superficie delle cellule vitali da disaggregati campioni CRC utilizzando un anticorpo DotScan CRC microarray. Il 122-anticorpo microarray è costituito da un normale 82-anticorpi regione riconoscere una serie di marcatori lignaggio leucociti-specifici, molecole di adesione, recettori e marcatori di infiammazione e la risposta immunitaria ^5, insieme ad una regione satellitare per l'individuazione di 40 potenziali marcatori prognostici per la CRC . Le cellule vengono catturati solo gli anticorpi per i quali essi esprimono l'antigene corrispondente. La densità delle cellule per punto, determinato attraverso la scansione ottica, riflette la proporzione di cellule che esprimono l'antigene, il livello di espressione dell'antigene e l'affinità degli anticorpi ^6.

Per il tessuto CRC o normale mucosa intestinale, scansioni ottiche riflettono l'immunofenotipo delle popolazioni miste di cellule. Multiplexing fluorescenza può quindi essere utilizzato per il profilo selezionato sotto-popolazioni di cellule di interesse catturato l'array. Per esempio, Alexa 647-anti-molecola di adesione delle cellule epiteliali (carcinomi, CD326), è un pan-antigene epiteliale di differenziazione che è stato utilizzato per rilevare le cellule CRC e anche le cellule epiteliali della mucosa intestinale normale, mentre ficoeritrina-anti-CD3, è stato utilizzato per rilevare infiltrazione delle cellule T ^7. Il DotScan CRC microarray dovrebbe essere il prototipo di una diagnosi alternativa al anatomicamente basato su sistema di stadiazione CRC.

Protocol

Figura 1. Flusso di lavoro per la preparazione di una sospensione di cellule vive da un campione chirurgico di CRC.

1. Disaggregazione del campione clinico

Tutti i campioni sono stati raccolti dal Principe Reale Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australia) e l'Ospedale rimpatrio Concord (Concord West, NSW, Australia) con il consenso informato ai sensi del protocollo n. X08-164.

1. Raccogliere fresca cancro del colon-retto (CRC) o campioni adenoma, e normale mucosa intestinale di almeno 10 cm dal tumore. Conservare i campioni a pH salina bilanciata di Hank soluzione 7.3 (HBSS) a 4 ° C per un massimo di 12 ore dopo la resezione.
2. Seguire le norme di sicurezza per gli agenti patogeni umani, processo di tutti i campioni clinici in un armadio di sicurezza biologica di classe II. Sezionare i campioni in 2 cubi mm in una capsula di Petri con due lame di bisturi.
3. Incubare tumore e tessuto normale in separato tubi Eppendorf con occasionali miscelazione dolce per 60 minuti a 37 ° C con un uguale volume di RPMI 1640 medium contenente il 2% (v / v) collagenasi tipo 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) e 0,1 % (w / v) deossiribonucleasi ho da pancrease bovina (DNAsi I; Sigma-Aldrich).
4. Forza semi-digerito tessuto attraverso un colino fine rete metallica con un pistone di una siringa da 10 ml; lavare le cellule attraverso con HBSS.
5. Passare con conseguente sospensione cellulare attraverso 200 micron e 50 filtri Filcon micron (BD Biosciences) per rimuovere aggregati cellulari. La maggior parte degli aggregati di DNA, muco e cellule vengono rimosse in questa serie di filtrazioni.
6. Centrifugare sospensioni cellulari a 400 xg a 20 ° per 5 minuti.
7. Pellet cellulari risospendere in FCS inattivato al calore contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO), congelare lentamente in cryovials e conservare a -80 °. Il processo di congelamento tende a ridurre il muco nel campione e lisa i globuli rossi.

2. Preparazione del campione per la cattura delle cellule

1. Scongelare i campioni rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° e risospendere le cellule in 10 ml di HBSS per lavare il DMSO.
2. Centrifugare sospensioni cellulari a 410 xg a 20 ° per 5 minuti.
3. Decantare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 500 ml di HBSS.
4. Trattare il campione con 0,1% (w / v) DNAsi I per 20 minuti a temperatura ambiente.
5. Miscelare 10 ml di ciascuna sospensione cellulare con un uguale volume di trypan blu e carico 10 microlitri della miscela in un emocitometro. Utilizzando un microscopio ottico a 100 volte ingrandimento, conta cellule vitali, che appaiono chiari a causa dell'esclusione trypan blu, mentre le cellule morte raccogliere la tintura. Un minimo di 4 x 10 ⁶ cellule vitali è necessario per catturare cella del microarray.
6. Dopo il trattamento DNAsi, risospendere la sospensione cellulare in 10 ml HBSS e centrifugare a 410 xg a 20 ° per 5 minuti.
7. Decantare il sopranatante e risospendere pellet cellulare in RPMI 1640 ad un volume finale di 200 ul.

3. Anticorpo microarray di cattura delle cellule

1. Inumidire il microarray DotScan anticorpi immergendo la sezione nitrocellulosa in tampone fosfato (PBS) per circa 20 s. Asciugare con cura i bordi di vetro del microarray con Kimwipes piegato, evitando di toccare la sezione nitrocellulosa.
2. Aggiungere acqua al vassoio di incubazione microarray di fornire una camera umida. Posizionare il microarray nella camera e pipetta sospensione di cellule in RPMI 1640 sulla sezione nitrocellulosa umido. Pipetta gocce su ogni angolo della nitrocellulosa per assicurare un'equilibrata ripartizione delle cellule.
3. Incubare il microarray a 37 ° C per 1 h. L'incubazione permette alle cellule di stabilirsi e di entrare in contatto con gli anticorpi sul microarray. Cellule che esprimono antigeni di superficie corrispondente agli anticorpi atterrano sul verrà catturata.
4. Dopo l'incubazione, immergere il microarray delicatamente e verticalmente in tre vasche contenenti almeno 15 ml di PBS per lavare le cellule non legato (20 s per ogni lavaggio).
5. Preparare 3,7% (w / v) di formaldeide in PBS per fissare le cellule e di anticorpi cross-linking. Delicatamente pipetta circa 1 ml per coprire la sezione nitrocellulosa del microarray. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
6. Prossimo tuffo microarray in 3 cambi di PBS (15 ml, 30 s ciascuno) per lavare formaldeide in eccesso.
7. Pulire i bordi e il retro del vetrino con Kimwipes e la scansione del microarray utilizzando il tempo DotScan scanner, la sezione di nitrocellulosa è umida. La scansione ottica fornisce il pattern di espressione dell'antigene di una popolazione di cellule miste ad esempio cellule di CRC, leucociti ed altre cellule stromali del tumore.

4. Fluorescenza multiplexing

1. Rimuovere il microarray dallo scanner e applicare 200 l di tampone di bloccaggio (2% w / v BSA, 2% di siero umano AB siero, PBS, pH 7,3). Incubare nel vassoio microarray a temperatura ambiente per 20 min.
2. Preparare il multiplexing soluzione in una provetta Eppendorf coperto con un foglio di alluminio: 20 l ficoeritrina-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australia, # IM12824; 1/7.5 diluizione finale), 10 L Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA; 1 / 15 di diluizione), 2 ml di inattivato al calore umano siero AB (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) e 118 ml di tampone di bloccaggio.
3. Drenare l'eccesso tampone di bloccaggio dal microarray e pipetta la soluzione multiplexing sulla sezione nitrocellulosa, diffondendo uniformemente. Incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
4. Immergere il microarray verticalmente in tre depressioni di 15 ml PBS fresco; (30 s ciascuno).
5. Lasciate che i microarray asciugare al buio e conservare a 4 ° C in una scatola di diapositive. I microarray possono essere conservati al buio per un massimo di 3 mesi senza perdita di fluorescenza.
6. Eseguire la scansione del microarray a secco utilizzando un tifone FLA 9000 scanner (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia) con risoluzione impostata a 50 (532 nm laser, 580 BP30 emissione filtro per PE. Laser 633 nm e 670 BP30 emissione filtro per Alexa 647). I microarray sono acquisiti con il lato nitrocellulosa rivolto verso il basso sul vassoio di vetro dello scanner.
7. Salvare le immagini come file TIFF fluorescente e utilizzando dimensioni di Photoshop l'immagine a 17 x 25 cm e la risoluzione a 72 pixel / cm. Importa l'immagine nel software di analisi DotScan per analizzare l'intensità di punti.
8. Il DotReader cattura una immagine digitale del modello di punti vincolanti e quantifica la densità di cellule vincolanti su ogni punto di anticorpi a livello grigiore 8 bit (1-256 U). Occasionali legame non specifico controllo isotipico è stato sottratto dai valori vincolanti per gli anticorpi di isotipi di immunoglobuline corrispondente. Intensità di fluorescenza punto per ogni microarray sono stati normalizzati contro i più brillanti punto fissato a 100% di intensità. Segnale / punto di forza è stato registrato in un file. Xml (dati grezzi) o rappresentato come un grafico a barre in un file. Pdf (relazione finale)
9. Microarray heatsmaps e clustering gerarchico sono stati condotti utilizzando MultiExperiment Viewer (MeV) versione 4.4 dal Microarray TM4 Software Suite ( http://www.tm4.org/mev.html ). Clustering gerarchico è stata effettuata su dati di base-impostato con MeV con l'analisi di linkage completo. Distanza euclidea è stata utilizzata per la misura di similarità. Il 2-code di Student t-test con varianza pari è stato utilizzato per determinare la significatività statistica dei risultati.

5. Rappresentante dei risultati:

I risultati del microarray DotScan dovrebbe mostrare modelli di cellulare coerente legame tra gli array duplicato. Forte allineamento punti vincolanti (CD44/CD29) consente una griglia da posizionare sopra l'area vasta. La Figura 2 mostra un esempio di cattura delle cellule ottimale e multiplexing. La figura 3 mostra alcuni problemi comuni riscontrati durante la cattura delle cellule e le possibili soluzioni.

I risultati delle cellule microarray vincolante può essere quantificata misurando intensità puntino espresso su una scala di grigio che vanno da 1 a 256. Figura 4 mostra i dati numerici da 58 campioni chirurgici CRC, colorati con carcinomi Alexa 647 anticorpi, come heatmap con il clustering gerarchico. Anche se il numero di campioni è limitato, CRC della stessa fase tendono a raggrupparsi nello stesso gruppo.

Figura 2. Modello cellulare vincolante del clinico tumore del colon-retto (Australian Clinic-patologico di sosta, ACP stadio B1). (A) DotScan chiave anticorpi che mostrano le posizioni di anticorpi per la metà sinistra del microarray duplicato (descritto). La parte superiore contiene l'originale 82 anticorpi del microarray leucemia DotScan. Un ulteriore 40 anticorpi, corrispondenti a specifici antigeni di superficie trovato per essere up-regolata in letteratura, sono stati aggiunti come microarray un CRC 'satellite'. La sezione inferiore è costituito da anticorpi isotipo di controllo (b) immagine ottico di cellule CRC legame alla microarray. (C) CD3 immagine a fluorescenza che mostra T-cellule. (D) EpCAM fluorescenza immagine che mostra cellule CRC.

Figura 3. Esempi di poveri risultati DotScan e le possibili soluzioni. (A) cella di bassa vincolante; soluzione: assicurarsi che almeno 4x106 cellule vitali sono sulla matrice (b) cellule di controllo Isotipo vincolanti e non vincolanti specifici; soluzione: aggiungere inattivato al calore umano siero AB a campione prima di incubazione su microarray per minimizzare isotipo di controllo vincolanti. Occasionalmente, una piccola quantità di legame non specifico di cellule per la nitrocellulosa si verifica con i campioni CRC e non influenzano significativamente i risultati. (C) nitrocellulosa essiccazione durante l'incubazione; soluzione: garantire campione copre l'intera sezione nitrocellulosa e microarray è incubata su una superficie piana. (D) manufatti ad alta priorità bassa; soluzione: garantire lamicroarray è accuratamente lavata dopo l'incubazione.

Figura 4. Software di analisi DotScan generato grafici a barre che rappresentano le densità di cellule vincolante per grigiore una scala da 1 a 256. Numeri sull'asse riferiscono agli antigeni CD. Altre abbreviazioni sono TCR, delle cellule T del recettore; κ, λ, catene leggere delle immunoglobuline, sig, immunoglobuline di superficie, DCC, cancellati nella proteina del cancro del colon-retto; EGFR, epidermal growth factor receptor, FAP, l'attivazione delle proteine ​​dei fibroblasti; HLA-A, B, C HLA-DR, leucocitario umano antigeni DR e A, B, C rispettivamente, MICA, MHC di classe I della catena proteina correlata A; MMP-14, metallopeptidase matrice 14; PIGR, recettore delle immunoglobuline polimeriche; TSP-1, trombospondina-1; MabThera, umanizzato anti-CD20. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

In questo video ci dimostra come il microarray anticorpi DotScan può essere utilizzato in modo semplice, semi-quantitativa modo per studiare i profili antigene di superficie per le popolazioni di cellule dal tessuto CRC.

Ottenere una sospensione vitale singola cellula da tessuto è fondamentale per il successo dell'esperimento, perché l'energia-dipendente dei processi (ad esempio, l'antigene tappatura e / o formazione di pseudopodi) sembrano essere necessari per il legame ditta di cellule intere di punti di anticorpi durante l'incubazione, mentre le cellule morte vengono successivamente lavato via. Collagenasi di tipo 1 è stato inizialmente impiegato per il tessuto disaggregation8, ma è stato sostituito da collagenasi 4 che provoca meno danni alle membrane cellulari, in quanto contiene un minor numero di contaminanti della proteasi. Questo cambiamento non ha influito sulla produzione di cellule, vitalità o schemi vincolanti. Muco da parte di alcuni tumori e campioni di controllo ridotto rendimento delle cellule e interferito con la cattura delle cellule. Questa viscosità del muco è stato minimizzato da stoccaggio di sospensione cellulare disaggregati in 10% DMSO / FCS a -80 ° C, presumibilmente a causa di cambiamenti nelle proprietà muco dopo il congelamento e scongelamento ^9. Successivamente, tutti i campioni sono stati conservati congelati nel 10% DMSO / FCS dopo disaggregazione e sono stati rapidamente scongelati per la produzione di sospensioni di cellule vitali, coerente con i modelli vincolanti. I campioni con vitalità <50% o mostrando vincolante poveri allineamento / pulizia punti (CD44/CD29) sono stati omessi dall'analisi.

Un paio di cloni di anticorpi ha mostrato un'affinità ridotta quando legato alla nitrocellulosa probabilmente a causa di un cambiamento di conformazione, ad esempio, l'eminente CD15s marcatore CRC aveva vincolante cellule molto poco o niente. Gli anticorpi che mostravano costantemente risultati negativi dovrebbero essere sostituiti con cloni differenti ibridomi. Un'altra possibile causa della scarsa attività di alcuni anticorpi è stata l'interferenza di legame con l'albumina sierica bovina (BSA). BSA senza anticorpi dovrebbero essere usati sui microarray dove possibile.

Anche se grandi coorti di pazienti sono necessari per l'analisi statistica dei dati di microarray, clustering gerarchico dei nostri risultati (58 campioni clinici) è stata incoraggiante. Normalizzazione dei dati utilizzando approcci descritti da Yang ¹⁰ dovrebbe fornire una migliore significatività statistica.

Mentre il microarray anticorpi DotScan consente la determinazione di nuovi modelli di espressione degli antigeni CD conosciuto, è più efficace se usato in combinazione con tecniche di proteomica scoperta, come il 2-dimensionale elettroforesi su gel e LC-MS-iTRAQ, per identificare nuove proteine ​​differenzialmente abbondanti . Queste nuove proteine ​​sono marker potenziale; anticorpi corrispondenti potrebbero essere aggiunte alla matrice, e validato con i campioni clinici CRC.

L'uso di anticorpi marcati con fluorescenza al profilo sub-insiemi di cellule catturate offre una potente piattaforma DotScan per l'analisi di popolazioni miste di cellule.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6136-10X1L	Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II	Westinghouse	1687-2340/612
Surgical blades	Livingstone	090609	Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes	Sigma-Aldrich	R4130-10X1L
Collagenase type 4	Worthington Biochemical	4188
Deoxyribonuclease 1	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Terumo Syringe (10 mL)	Terumo Medical Corp.	SS+10L	Box of 100
Filcon filter (200 μm)	BD Biosciences	340615
Filcon filter (50 μm)	Filcon filter (50 µm)	Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603
Fetal calf serum	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	7017
Dimethyl sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Hemocymeter Technocolor Neubar	Hirschmann	not available
Light microscope	Nikon Instruments	Nikon TMS
Cyrovial tubes	Greiner Bio-One	121278
Cryo freezing contrainer	Nalge Nunc international	5100-0001
DotScan antibody microarray kit	Medsaic	not available
DotScan microarray wash tray	Medsaic	not available
KimWipes	Kimberly-Clark Corporation	4103
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	F1635-500ML
DotReaderTM	Medsaic	not available
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418-10G
Heat-inactivated AB serum 2%	Invitrogen	34005100
Phyc–rythrin-conjugated CD3	Beckman Coulter Inc.	ET386
AlexaFluor647-conjugated EpCAM	BioLegend	324212
Typhoon FLA 9000	GE Healthcare	28-9558-08	532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4	TM4 Microarray Software Suite	Open – source software (Ref 11)