Summary
يوصف أسلوب لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية. يتم إنشاء A-degron مزعزعة الاستقرار GFP-(GFP-DGN) ومستقرة انصهار بروتين GFP-dgnFS وtransduced في الخلية باستخدام ناقلات lentiviral التعبير. هذا الأسلوب يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة GFP-dgn/GFP-dgnFS معربا عن الذي يمكن اليوبيكويتين-proteasome النشاط المقررة بسهولة باستخدام epifluorescence أو التدفق الخلوي.
Abstract
Proteasome هو عضية الرئيسي داخل الخلايا المشاركة في تدهور بروتين غير طبيعي من والبروتينات وتتجمع تلف أو المؤكسد 1 و 2. تورط استمرار نشاط proteasome في العديد من العمليات الخلوية الأساسية، مثل الاستجابة للضغط النفسي الخلية 3، تنظيم دورة الخلية والتمايز الخلوي 4 أو استجابة جهاز المناعة 5. وقد يرتبط ضعف النظام اليوبيكويتين-proteasome لنمو الاورام وأمراض الاعصاب 4 و 6. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على انخفاض في النشاط proteasome كنمط من أنماط الشيخوخة الخلوية والشيخوخة العضوي 7 و 8 و 9 و 10. هنا، نقدم طريقة لقياس اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية باستخدام البروتين GFP-DGN الانصهار. لتكون قادرة على رصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية الأولية، DNA مكملة لترميز يبني البروتين الفلوري الأخضر (GFP)-DGN انصهار بروتين (GFP-يتم إدراج DGN، غير مستقر) ومتغير يحمل طفرة انزياح الإطار (GFP-dgnFS ومستقرة 11) في التعبير lentiviral ناقلات. نحن نفضل هذا الأسلوب أكثر الأساليب التقليدية لأنها ترنسفكأيشن يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا أو سن المتبرع. ويمكن استخدام الفرق بين مضان المعروضة بواسطة GFP-dgnFS (مستقر) والبروتين البروتين زعزعة الاستقرار (GFP-DGN) في غياب أو وجود المانع proteasome لتقدير اليوبيكويتين-proteasome النشاط في كل سلالة خلية معينة. يمكن رصد هذه الاختلافات بواسطة المجهر epifluorescence أو يمكن قياس التدفق الخلوي من قبل.
Protocol
1. بلازميد البناء
- ترتيب مخصص بنسبة ضئيلة من النيوكليوتيدات الترميز لDGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) وdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) وligate عليه في ناقلات pEGFP-C1 للحصول على الانصهار في GFP مع DGN / dgnFS (الشكل 1).
- تضخيم تسلسل الترميز لGFP-DGN وGFP dgnFS-PCR بواسطة وفقا للبروتوكول من مجموعة الاتجاه pENTR الاستنساخ TOPO والاستمرار في الاتجاه pLenti6/V5 كيت الاستنساخ TOPO (الشكل 6).
2. فيروس الإنتاج
- قبل يوم واحد ترنسفكأيشن (يوم 1) البذور من خلايا 293FT HEK في قوارير T75 بحيث أنها سوف تكون متموجة 90-95٪ في اليوم من ترنسفكأيشن.
- في يوم 36 ترنسفكأيشن تمييع ميكرولتر من الكاشف 2000 lipofectamine في 1.5 مل من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية في 15 مل فالكون. استخدام آخر 15 مل الصقر وتمييع 3 ميكروغرام pLenti6/V5 تحمل DNA مكملة لبناء إما GFP -DGN أو GFP-dgnFS، 2.5 الترميز المغلف pMD2.G ميكروغرام البلازميد و 7.5 ميكروغرام ناقلات العمود الفقري psPAX2 في 1.5 مل من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية. بعد 5 دقائق يتم الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف 2000 lipofectamine المخفف.
- احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمجمعات DNA-lipofectamine إلى النموذج.
- إزالة المتوسطة من الخلايا 293FT HEK، والاستعاضة عنها بعناية بنسبة 7 مل من المتوسط (بدون المضادات الحيوية) وإضافة خليط الحمض النووي lipofectamine إلى القارورة والصخور ذهابا وإيابا لخلط (يوم 2). احتضان بين عشية وضحاها في القارورة C ° 37 في حاضنة مرطب 5٪ CO 2.
- تغيير المتوسطة في اليوم التالي (10 مل المتوسطة دون المضادات الحيوية؛ اليوم 3).
- بعد 48 ساعة طاف الحصاد (يوم 5)، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصفية طاف من خلال مرشح ميكرومتر PVDF 0.45.
ثقافة المتوسط - DMEM (HEK 293FT)
خيمة "> DMEM10٪ FBS
0.1 مم MEM NEAA
6 مم الجلوتامين L-
1 ملي الصوديوم MEM البيروفات
1٪ القلم بكتيريا (اختياري)
500 ميكروغرام / مل Geneticin (اختياري)
3. تركيز الفيروس عن طريق هطول الأمطار البولي ايثيلين (PEG) جلايكول
- البولي إثيلين جلايكول إضافة واحد حل حجم (50 ملم غليكول البولي إثيلين، 41 مم كلوريد الصوديوم، الأوتوكلاف، ودرجة الحموضة = 7.2؛ PEG) لأربعة مجلدات من طاف ° C. واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 مزيج بعناية كل دقيقة 20-30 من قلب.
- تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 وينبغي أن يكون بيليه الأبيض تكون مرئية.
- نضح طاف وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1500 x ج لمدة 5 دقائق في C. ° 4 نضح الحل PEG المتبقية.
- إعادة تعليق بيليه في المتوسطة أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من قبل pipetting صعودا وهبوطا بقوة ودوامة لمدة 20 إلى 30 ثانية. كمبدأ توجيهي لاستخدام 500 ميكرولتر قارورة T75 واحد وقسامة إلى 100 ميكرولتر. تخزين الفيروس في -80 ° C.
= "jove_title"> 4. Titering من الفيروسات
- البذور من 5 × 10 4 U2-OS الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا في اليوم السابق ترنسفكأيشن.
- في يوم ترنسفكأيشن إزالة ثقافة المتوسط والاستعاضة عنها 1 مل من DMEM يحتوي على 8 ميكروغرام / مل polybrene (hexadimethrine الميثيل). يخفف من فيروس المركزة 1:10 و 1:100 طاف وإضافة 1 ميكرولتر كل واحد أيضا. لاستخدام تركيزات أعلى الفيروس 1 ميكرولتر، ميكرولتر 5 و 10 ميكرولتر من طاف فيروس المركزة لآبار المتبقية. واحدة جيدا ويترك كعنصر تحكم إيجابية.
- في اليوم التالي استبدال المتوسطة بنسبة 2 مل من DMEM.
- تبدأ مع اختيار في اليوم التالي. تطبيق 10 ميكروغرام / مل Blasticidin على كل جانب. استبدال المضادات الحيوية المحتوية المتوسطة كل يوم الثاني.
- حوالي 6-7 أيام بعد بدء اختيار الخلايا untransduced قد لقوا حتفهم. لتلطيخ غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وتغطية الخلايا مع البنفسجي الكريستال (10 ملغ / لتر البنفسجي الكريستالفي الايثانول 20٪) واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. (يمكن إعادة استخدامها عدة مرات) الرشفة الكريستال البنفسجي وشطف الآبار مرتين مع DDH 2 O وتجفيف اللوحة.
- عد المستعمرات وتتكاثر مع 1،000 والتخفيف المقابلة (الشكل 7). هذا الإجراء يسمح لحساب وحدات ترنسفكأيشن (TU) من فيروس / مل.
ثقافة المتوسط - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10٪ FBS
6MM الجلوتامين L-
1٪ القلم بكتيريا
5. تنبيغ الخلايا الليفية الإنسان مضاعف (ويمكن استخدام هذا الإجراء عن أي نوع من الخلايا.)
- البذور من 5 × 10 4 الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا (HDFs) إلى 6 لوحات جيدة في اليوم السابق تنبيغ.
- استخدام تعدد إصابة اثنين معا مع 8 ميكروغرام / مل كما polybrene محسن تنبيغ في مجموعه واحد ملليلتر.
- تغيير المتوسطة في اليوم التالي.
- عندماالخلايا هي في 70-80٪ من بداية confluency اختيار مع 10 ميكروغرام / مل blasticidin. بعد الانتهاء من اختيار (لا يموت المزيد من الخلايا untransfected) يمكن توسيع تبدأ الخلايا والخلايا على استعداد لإجراء التجارب. اختيار المزمن مع blasticidin يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة overexpressing GFP-DGN أو البروتينات الانصهار GFP-dgnFS، وعلى استعداد لقياس النشاط proteasome. هذا الإجراء يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا.
6. القياس قياس التدفق الخلوي
- البذور المغادرة 1 × 10 5 خلايا (إما تحمل GFP-DGN أو GFP dgnFS) قبل يوم من التجربة.
- علاج الخلايا السيطرة قبل 3 ساعة قياس مع مثبط proteasome، على سبيل المثال 100 ميكروغرام / مل LLNL.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا باستخدام 0.5 مل من التربسين. لوقف استخدام trypsinisation 4.5 مل من مستنبت ونقل الخلايا إلى الصقر 15 مل.
- تدور رانه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المتوسط، إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وتدور أسفل مرة أخرى في 300 XG لمدة 5 دقائق عند 37 ° C.
- نضح في برنامج تلفزيوني، resuspend في 400 ميكرولتر من العازلة FACS (ملي Hepes 10، 140 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 مم CaCl 2، الرقم الهيدروجيني = 7.4) ونقل الخلايا في أنابيب FACS.
- إبقاء الخلايا على عينات الجليد وقياس التدفق الخلوي من قبل. يجب أن لا يتم تخزين الخلايا لفترة أطول من 30 دقيقة في C. ° 4
7. ممثل النتائج
البروتين GFP-DGN الانصهار يحمل التسلسل الذي يستهدفه إلى proteasome، وبالتالي فإن البروتين هو المتدهورة على الفور، بل يتوافق مع انخفاض في إشارة مضان GFP. متحولة انزياح الإطار (GFP-dgnFS) يحمل نسخة من تحور هذا التسلسل وليس تدهورت بفعل proteasome، بل يؤدي إلى ارتفاع مضان أخضر. لهذه الأسباب، transduced الشباب HDFs مع النشاط المتوقع proteasome عالية ومع GFP-DGن تظهر انخفاض (6٪ الخلايا إيجابية) إشارة مضان في كل من تدفق الخلوي والقياس في epifluorescence (الشكل 2A وB، الشكل 3). transduced في نفس HDFs مع GFP-dgnFS عرض 39.7٪ من الخلايا إيجابية. أثار علاج الخلايا مع مثبط LLNL proteasome (N-اسيتيل-L-لوسيل-L-لوسيل-L-norleucinal) إشارة إلى الحد الأقصى من 62.9٪ في كل من، GFP-DGN وGFP-dgnFS الخلايا (الشكل 2A وB ).
لتحديد الانخفاض في النشاط ممكن proteasome في العمر عينات الجلد البشري، الخلايا الليفية الجلدية أصيب معزولة عن الجهات المانحة الشباب، في منتصف العمر وكبار السن مع GFP-DGN وGFP-dgnFS أعلاه كما هو موضح وزراعتها لنفس العدد مرور قبل تحليل تدفق الخلوي. وقد لوحظ في هذه التجارب، زيادة واضحة في إشارة GFP بين الأفراد الشباب (11.2 ± 0.88٪ الخلايا GFP إيجابية) ومتوسطي العمر المانحين (20.4 ± 2.27٪ GFP إيجابية الخلايا، P = 0.003)، مما يدل على انخفاض في PROTEASOME النشاط في عينات تم الحصول عليها من الجهات المانحة الذين تتراوح أعمارهم بين 7 (الشكل 4). لم يلاحظ أي انخفاض آخر في نشاط الخلايا الليفية في proteasome معزولة عن أقدم الأفراد (الشكل 4). وكان لكثافة مضان GFP-dgnFS في جميع الحالات ~ 90٪ (البيانات لا تظهر) مما يدل على الكفاءة العالية لترنسفكأيشن المجموعات الثلاث العمرية المختلفة.
الشكل 1. تسلسل GFP-DGN وGFP dgnFS. المعروض هو نهاية 3'-من GFP (الخضراء) على موقع الاستنساخ متعددة من ناقلات pEGFP-CL1 (الرمادي) وتسلسل DGN / dgnFS (الحمراء).
الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي من GFP-DGN وGFP-dgnFS الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا. أصيب A. الخلايا الليفية الإنسان يونغ القلفة (HFF-2) مع ناقلات lentiviral يحمل البروتين الأخضر نيون (GFP)-DGN الجينات أو GFP dgnFS-(انزياح الإطار) بناء، كما هو مبين وتحليلها لمضان GFP باستخدام التدفق الخلوي (FACS كانتو II، بيكتون ديكنسون). وحيث المشار إليها، وتعامل أيضا مع خلايا ل3H المانع proteasome N-اسيتيل-L-لوسيل-L-لوسيل-L-norleucinal (LLNL). واستخدمت الخلايا غير المصابة كمجموعة تحكم. وأجريت التجارب في ثلاث مكرارت البيانات B. هي ممثل ثلاث تجارب مستقلة. الأرقام تعكس كمية من الخلايا GFP إيجابية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. وعولج مضان المجهر التحليل من GFP-DGN والخلايا GFP-dgnFS HFF-2. الشباب HFF-2 كما في الشكل 2. في 9 أيام بعد الإصابة، وكانت الخلايا الخامسisualized من مضان المجهري والتخلص التباين.
الشكل 4. التغيرات في النشاط proteasome في شيخوخة الجلد البشري. تم توسيع الحد الأدنى والخلايا الليفية الإنسان القلفة من تسع جهات مانحة مختلفة في الفئات العمرية المشار إليها والمصابين يبني lentiviral الترميز لGFP-DGN. في 9 أيام بعد الإصابة، وقد تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. تم الحصول على بيانات عن ثلاث عينات لكل فئة عمرية في التكرارات (± SE).
الشكل 5. المنهج التجريبي. يتم استنساخ مخصص بنسبة ضئيلة النيوكليوتيدات لDGN وdgnFS في ناقلات pEGFP-C1 ويتم إنتاج الفيروسات لكل بناء باستخدام HEK 293FT الخلايا. يتم تحديد عيار من الفيروسات. وtransduced الخلايا مع الفيروس وتوسيع نطاقها. بعد العلاج المفضل ويتم تحليل الخلاياللإشارة مضان من قبل التدفق الخلوي.
الشكل 6. خريطة pLenti GFP-DGN. يتم عرض خريطة للpLenti6/V5-DEST ناقلات بما في ذلك تسلسل GFP-DGN. الاختصارات: PCMV (CMV المروج)، GFP-DGN (تسلسل GFP-DGN)، P SV40 (SV40 المروج المبكر)، EM7 (EM7 المروج)، Blasticidin (Blasticidin الجينات المقاومة)، ΔU3 / 3'LTR (3'LTR مع حذف U3 المنطقة)، SV40 السلطة الفلسطينية (SV40 إشارة تذييل بعديد الأدينيلات)، أمبيسيلين (أمبيسيلين الجينات المقاومة)، تقوم تقنية أوري (PUC المنشأ)، PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR المروج المختلطة)، Ψ (HIV-1 التغليف Ψ إشارة )، RRE (HIV-1 عنصر استجابة القس).
الشكل 7. كانت المصنفة U2-OS وحة titering. U2-OS بها على لوحة 6 جيدا وtransfected مع تركيزات مختلفة فيروس (التخفيف 1/100 و 1/10، 1، 5 و 10 ميكرولتر من المشتركncentrated طاف الفيروسية). واحد كان جيدا استخدامها لمكافحة untransfected (NT). بعد 6-7 أيام، كانت ملطخة الخلايا مع البنفسجي الكريستال والهواء المجفف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد نشرت أول نشر باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باعتبارها الركيزة مراسل اليوبيكويتين-proteasome النشاط في 2000 12. ومنذ ذلك الحين، أصبح GFP أداة مشتركة لتصور الأنشطة الخلوية، وخاصة عملية اليوبيكويتين-proteasome. لرصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الجسم الحي وقد تم عرض نموذج الفأر المعدلة وراثيا مع مراسل GFP المستندة إلى 13. أنشئت في البحوث المجراة إضافية أخرى نموذج الفأر المعدلة وراثيا مع مراسل مماثلة GFP degron-مزعزعة الاستقرار كما هو مستخدم في هذا المنشور 14.
للأسف، GFP كمراسلة لديه بعض النقص التي لم تظهر من قبل Dantuma وآخرون وآخرون بومان. 12،15. أولا، يمكن أن يهتز استقرار GFP تتراكم دون تثبيط proteasome لأسباب غير معروفة. بوصفها الآلية اليوبيكويتين-proteasome هو نظام الذي يعتمد على وظيفة متعددة الخطوات، إعلانيمكن isturbance قبل تدهور يؤدي إلى تراكم الركيزة مراسل ويؤدي إلى آثار إيجابية كاذبة 12. الثاني، ركائز مراسل GFP القائم ومن المقرر أن قصيرة على نصف يعيش حساسة للتغيرات في النسخ والترجمة. يمكن لأي تغيير في مضان GFP يكون ذلك نتيجة لتجميع تقليل أو زيادة والترجمة 15. وقد تم معالجة هذه المشاكل في دراسات أخرى من التعديلات من GFP على النحو التالي:
تم العثور على النشاط Proteasome أن انخفض في الشيخوخة الخلوية والشيخوخة العضوي 7 و 8 و 9 و 10. في مجال البحوث الشيخوخة، ويتم التركيز أساسا على إزالة البروتينات المؤكسدة حيث proteasome يلعب دورا رئيسيا، وليس هناك دليل قاطع على أن يسبق ubiquitylation البروتين تدهور في هذه الحالة 2. وقد أظهرت الأعمال السابقة أيضا أن استخدام GFP مع شاردة تحور اليوبيكويتين uncleavable مناسبة لدراسة عملية معقدة عrotein تدهور 16. هذا GFP-بناء يعطي امكانية لمراقبة نشاط proteasome دون التأثير المحتمل لنشاطها عبر اضطرابات في الجهاز اليوبيكويتين.
في هذا العمل، استخدمنا degron-مزعزعة الاستقرار البروتين GFP مراسل القائمة على (GFP-DGN) لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الليفية يعيشون مضاعفا الإنسان. أن يكون لمحة عامة عن كفاءة ترنسفكأيشن، وظائف ومستويات النسخ / ترجمة لمراسل GFP-DGN، وأدرجت العديد من الضوابط المناسبة. كنا صغار دون علاج الخلايا الليفية GFP-DGN بالنقل لإظهار أن هناك تقريبا أي وظيفة خضراء مضان مرئية وproteasome لا يتأثر. للتحقق من صحة، أن الزيادات إشارة مع تثبيط proteasome، كنا نعامل GFP-DGN الخلايا الليفية بالنقل مع مثبط proteasome لرؤية تراكم GPF بعد تثبيط. كعنصر تحكم استخدمنا 3 GFP-dgnFS. مع هذا البناء يمكننا إظهار overaليرة لبنانية كفاءة ترنسفكأيشن والتي يمكن أن تختلف من سلالة إلى سلالة خلية خلية ومع جميع الضوابط الثلاثة لدينا لمحة عامة عن المعدل تجميع للبنيات داخل الخلية.
طريقة المقدمة هنا تمكن المستخدم لقياس بسهولة وبسرعة النشاط اليوبيكويتين-proteasome في الخلايا الحية. ويمكن تحقيق overexpression مستقرة الركيزة مراسل GFP مع تقنيات مختلفة 17. في هذا المنشور، ويتحقق ترنسفكأيشن من [كدنا] GFP-DGN في الخلايا عن طريق نظام lentiviral الذي يوفر التعبير مستقرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام هذا النظام يتيح عالية الكفاءة ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا، خلية حالة الأيض أو العمر المانحة 7. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لإدخال DNA إلى الخلايا البطانية التي غيرها من أساليب ترنسفكأيشن فشل 18. ومع ذلك، أظهرت التجارب السابقة أن الخلايا التي يتم توسيع يعد في الثقافة عرض أقل مضانإشارة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل طازجة وربما يعود ذلك إلى الضغط يعد الاختيار.
يتم استخدام الأمطار PEG لزيادة عيار تحويل وحدات لكل مل (TU / مل). إذا وصلت التتر جيدة (فوق 5 × 10 5 TU / مل)، يمكن حذف هطول الأمطار PEG. خطوة هامة أثناء هطول الأمطار PEG هو تجنب تعليق أو قوية pipetting الذي يولد فقاعات الهواء. يمكن أن يعطل وجزيئات الفيروس ويقلل كثيرا من كفاءة ترنسفكأيشن.
يجب عند استخدام مثبطات proteasome أن إجراء التجارب مسبقا. تركيز النهائي المستخدمة وفترة حضانة هي نوع من الخلايا تعتمد ويتعين تحديد تجريبيا. كشفت الملاحظات السابقة على خلايا-2 HFF أنه لا ينبغي 3H الحضانة مع LLNL يتم تجاوز بسبب 1) الآثار السامة لمثبطات 2) مرتفعة للغاية إشارة GFP التي يمكن الوصول إليها، أو 3) الآثار الجانبية للتثبيط proteasome على أطول تيمه الفترات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل: شبكة البحوث الوطني للشيخوخة (نفن S93) من قبل مؤسسة العلوم النمساوية (FWF)، والمفوضية الأوروبية المتكاملة MiMAGE المشاريع وPROTEOMAGE، هولندا الجينوم مبادرة / المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (NGI / NWO؛ و05040202 050 - 060-810 NCHA)، ويموله الاتحاد الأوروبي من فترة الحياة شبكة التميز (FP6 036894)، وبرنامج البحوث الموجهة نحو الابتكار على علم الجينوم (SenterNovem؛ IGE01014 وIGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
