Summary
监控活细胞的泛素 - 蛋白酶体活性的方法。一个degron不稳定的绿色荧光蛋白（GFP-DGN）和一个稳定的的GFP-dgnFS融合蛋白的生成和使用慢病毒表达载体导入细胞。这种技术允许产生稳定的GFP-dgn/GFP-dgnFS表达细胞株中，泛素 - 蛋白酶体活性可以很容易地使用的反射荧光或流式细胞术评估。
Abstract
蛋白酶是异常的，错误折叠的，损坏或氧化蛋白1，2中的蛋白水解降解的主要涉及的胞内细胞器。蛋白酶体活性的维护被牵连了许多关键的细胞过程，如细 胞的应激反应，细胞周期调控和细胞分化或免疫系统的反应5。已与泛素-蛋白酶体系统的功能障碍，肿瘤，神经退行性疾病4，6的发展。此外，在蛋白酶体活性的减少被发现作为一个功能的细胞衰老和有机体的老化7，8，9，10。在这里，我们提出了一种方法来衡量使用GFP-的DGN融合蛋白在活细胞的泛素 - 蛋白酶体的活性。至能够监视泛素 - 蛋白酶体活性的活的原代细胞，互补的DNA构建体编码的绿色荧光蛋白（GFP）-DGN融合蛋白（GFP-DGN，不稳定）和携带的移码突变的变体（GFP-dgnFS的，稳定11）被插入在慢病毒表达载体。我们更喜欢这种技术比传统的转染技术，因为它保证了一个非常高的转染效率的细胞类型或捐赠者的年龄无关。可以使用显示在GFP-dgnFS（稳定）蛋白和蛋白酶体抑制剂的存在或不存在中的不稳定的蛋白（GFP-DGN）的荧光之间的差异，来估计在每个特定的细胞株的泛素 - 蛋白酶体活性。这些差异可以通过荧光显微镜监测，也可以通过流式细胞仪检测。
Protocol
1。质粒的构建
- 订购定制寡核苷酸编码为DGN（ACKNWFSSLSHFVIHL 11）和为dgnFS（HARTGSLACPTSSSICE）和结扎到质粒pEGFP-C1载体，以获得与DGN / dgnFS的（ 图1）的GFP的融合。
- 通过PCR扩增的GFP-dgn和GFP-dgnFS的的编码序列，。根据协议pENTR定向TOPO克隆试剂盒，并继续与pLenti6/V5定向TOPO克隆试剂盒（ 图6）。
2。病毒生产
- 转染前一天（第1天）的种子，满分HEK 293FT细胞在T75烧瓶中，以便它们将是90-95％汇合的转染当天。
- 在转染当天，在1.5毫升的DMEM稀释36μl的脂质体Lipofectamine 2000试剂，无血清和抗生素在一个15毫升鹘。另外15毫升猎鹰和稀释3微克pLenti6/V5携带互补的DNA构造或者GFP DGN或GFP-dgnFS的的，2.5微克信封编码质粒pMD2.G和7.5微克载体骨干psPAX2的在1.5毫升无血清和抗生素的DMEM中。 5分钟后稀释的DNA与稀释的脂质体Lipofectamine 2000试剂相结合。
- 孵育混合物20分钟，在室温下，以允许DNA-脂质体转染法络合物形式。
- 的HEK 293FT细胞中取出介质，取代它仔细7毫升培养基（不含抗生素）和DNA-脂质体混合物的烧瓶和岩石，它来回混合（2天）。在湿润的5％CO 2培养箱中，将烧瓶在37℃下过夜孵育。
- 改变介质的第二天（不含抗生素的10毫升培养基，第3天）。
- 48小时后（第5天）收获上清液，在300×g离心5分钟，在室温下离心，并通过0.45μm的PVDF过滤器过滤上清液。
培养基- DMEM（HEK 293FT）
帐篷“> DMEM10％FBS的
0.1毫米MEM NEAA
6 mM的L-谷氨酰胺
1毫米MEM丙酮酸钠
1％PEN链球菌（可选）
500微克/毫升遗传霉素（可选）
3。病毒浓度的聚乙二醇（PEG）沉淀
- 加入一体积的聚乙二醇溶液（50mM的聚乙二醇，41 mM氯化钠，高压釜中，pH值= 7.2，PEG）4体积的上清液和在4℃下孵育2小时小心地混合每20-30分钟反相。
- 自旋向下在1500 xg离心30分钟，在4°C应该可以看到一个白色的小球。
- 吸取上清，在1500×g离心5分钟，并再次离心在4℃下吸出剩余的PEG解决方案。
- 将沉淀重悬于培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS），通过移液向上和向下大力为20至30秒的涡流。作为一个指导原则使用T75烧瓶和分装到100μL500μL。病毒存放于-80℃。
- 满分5×10 4 U2-OS细胞转染前一天的6孔板的各孔中的种子。
- 在转染当天，除去培养基，并替换它由1毫升含有8微克/毫升聚凝胺（溴化己二甲铵溴化物）的DMEM中。浓缩病毒上清1:10和1:100稀释，并加入1μl一个好。对于更高的病毒浓度，用1微升，加入5μl和10μl浓缩病毒上清的剩余井。一个阱被留下作为阳性对照。
- 翌日2ml的DMEM替换培养基。
- 开始第二天的选择。应用10μg/ ml的杀稻瘟菌素各孔上。每隔一天更换抗生素的培养基。
- 约6-7天后开始选择未转染的细胞都死了。对于染色洗细胞3次，用PBS和覆盖细胞，用结晶紫（10毫克/升结晶紫在20％乙醇），并在室温下孵育5-10分钟。吸液结晶紫（可以重复使用几次）和两次DDH 2 O冲洗井和干板。
- 计数菌落并乘以1000和其对应的稀释（ 图7）。此过程可以计算转染单元（TU）的病毒/毫升。
培养基- DMEM（HFF-2/U2-OS）
DMEM
10％FBS的
6mm的L-谷氨酰胺
笔链球菌1％
5。人二倍体成纤维细胞转导（此步骤可用于任何类型的细胞。）
- 种子从5×10 4人二倍体成纤维细胞（HDF）中的6孔板中的转导的前一天。
- 使用多重感染两个一起聚凝胺8微克/毫升一毫升，共转导增强。
- 改变介质的第二天。
- 何时的细胞会合开始用10μg/ ml的杀稻瘟素的选择是在70-80％的。选择完成后（没有更多未转染的细胞死亡）的细胞就可以开始扩大，使细胞为实验做好准备。杀稻瘟素的慢性选择与允许生成稳定的细胞系过度GFP-DGN或GFP-dgnFS的融合蛋白，准备测量蛋白酶体活性。此过程保证独立的细胞类型的一个非常高的转染效率。
6。通过流式细胞仪的测量
- 种子从1×10 5个细胞（携带GFP-DGN或GFP-dgnFS的的）实验的前一天。
- 处理对照细胞前3小时，与蛋白酶体抑制剂的测量， 例如 ，100微克/毫升LLNL。
- 用PBS洗两次，用0.5毫升的胰蛋白酶收集细胞。要停止胰蛋白酶消化使用4.5毫升培养液中的细胞转移到15毫升猎鹰的。
- 自旋吨细胞在300×g离心5分钟，在室温下。
- 吸取培养基，重新悬浮在PBS中的细胞，并再次降速在300×g离心5分钟，在37℃下
- 吸取PBS，重新悬浮于400μlFACS缓冲液中（10毫摩尔的Hepes，140 mM氯化钠，2.5mM的CaCl 2的 ，pH值= 7.4），和细胞转移到FACS管。
- 保持冰和测量样品的细胞通过流式细胞仪检测。细胞不应该长于30分钟被存储在4℃下
7。代表性的成果
在GFP-DGN融合蛋白进行的序列，这是针对蛋白酶体，并因此，该蛋白质是立即退化;它对应于GFP荧光信号的减少。移码突变（GFP-dgnFS）进行该序列的突变版本的，是不被蛋白酶体降解，它会导致更高的绿色荧光。出于这些原因，年轻的与预期的高蛋白酶体活性的HDFS和转用GFP-分克n显示低（6％的阳性细胞）的荧光信号在两个流式细胞仪测量和在落射荧光（ 图2A和B，图3）。同一个HDFS转GFP-dgnFS的显示39.7％的阳性细胞。细胞的治疗与蛋白酶体抑制剂LLNL（N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-norleucinal）提出的信号两者，GFP-dgn和的GFP-dgnFS细胞的（ 图2A和B中的62.9％的最大）。
以确定可能的老年人类皮肤样本的蛋白酶体活性的下降，从青年，中年和老年人的捐助者分离的皮肤成纤维细胞与GFP dgn和GFP-dgnFS的的感染，如上所述，培养前相同的通道数流量分析流式细胞仪。在这些实验中，一个鲜明的年轻个体之间的GFP信号增加（11.2±0.88％GFP阳性细胞）和中年捐助者（20.4±2.27％GFP阳性细胞，P = 0.003），说明已被观察到减少龙眼青梅中年捐助者7（ 图4）从得到的样品中的活性。在蛋白酶体活性的最古老的个体（ 图4）从分离的成纤维细胞中观察到没有进一步的减少。为GFP-dgnFS的是在所有情况下，荧光强度〜90％（数据未示出），这表明了高转染效率为三个不同的年龄组。
图1。在GFP-dgn和的GFP-dgnFS序列的显示是，GFP（绿色）的多个克隆位点的pEGFP-CL1载体（灰色）和的DGN / dgnFS序列（红色）的3'-末端。
图2。分析GFP-DGN和GFP-dgnFS的的人二倍体成纤维细胞的流式细胞仪。 A.年轻的人包皮成纤维细胞（HFF-2）感染了慢病毒载体的绿色荧光蛋白（GFP）DGN基因或GFP-dgnFS（移码）构造，使用流式细胞仪（FACS粤语II，Becton Dickinson公司）的指示，分析GFP荧光。另有说明外，细胞也处理3h处理与蛋白酶体抑制剂N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-norleucinal（LLNL）。未感染的细胞用作对照。实验一式三份进行。B.数据是三个独立实验的代表。这些数字反映的GFP阳性细胞的数量。 点击此处查看大图 。
图3。被视为图2中的GFP-dgn和GFP-dgnFS的的HFF-2细胞的荧光显微镜分析。杨HFF-2。在感染后第9天，细胞呈V荧光相差显微镜isualized通过。
图4。在人体皮肤老化的蛋白酶体活性的变化。从9个不同的捐赠者在指定的年龄组的人包皮成纤维细胞的慢病毒结构编码GFP-DGN最低限度的扩大和感染。在感染后第9天，细胞，用流式细胞仪分析。数据上得到了每个年龄组的三个样本一式两份（±SE）。
图5。实验方法。自定义寡核苷酸DGN和dgnFS的克隆到pEGFP-C1的载体和病毒为每个使用HEK 293FT细胞的结构。确定病毒的滴度。将细胞与病毒转导和扩大。后优惠待遇细胞分析通过流式细胞仪检测荧光信号。
图6。 GFP-DGN序列的pLenti6/V5-DEST矢量地图的：GFP-DGN pLenti。的地图显示。缩写：PCMV（CMV启动子），GFP-DGN（序列的GFP-DGN），P SV40（SV40早期启动子），EM7（EM7子），稻瘟菌素（杀稻瘟抗性基因），ΔU3/ 3'LTR（3'LTR与删除U3区域），SV40，SV40多聚腺苷酸化信号（pA的），氨苄西林（氨苄青霉素抗性基因），pUC系毛利（pUC的原点），PRSV / 5'LTR（RSV / 5'LTR杂合启动子），Ψ（HIV-1Ψ包装信号），HIV-1 REV应答元件（RRE）。
图7。 U2-OS滴定板。U2-OS接种6孔板上，并与不同的病毒浓度（稀释1/100和1/10，1，5和10μl的共同转染的ncentrated病毒上清）。作为一个未转染对照（NT）。经过6-7天，将细胞染色，用结晶紫和在空气中干燥。
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Discussion
用绿色荧光蛋白（GFP）作为底物泛素-蛋白酶体活性记者，发表于2000年12首次出版。从那时起，GFP已成为一种普遍的工具，可视化细胞的活动，特别是泛素 - 蛋白酶体的过程。若要监视在体内的泛素-蛋白酶体活性的转基因小鼠模型与基于GFP的记者已被引入13。额外另一种转基因小鼠模型的体内研究建立一个类似的不稳定degron的GFP记者作为本出版物中的14。
不幸的是，作为一个记者的GFP有一定的缺陷，这已被证明，Dantuma 等。和Bowman 等。12,15。首先，不稳定GFP可以积累而抑制蛋白酶体由于未知的原因。作为泛素 - 蛋白酶体的机械是一个系统，其功能是依赖于多个步骤，广告isturbance降解之前可以导致记者基板的积累导致假阳性效果12。其次，基于GFP的记者基板是由于其半衰期较短的转录和翻译的变化十分敏感。 GFP荧光的任何变化，因此，能够减少或增加的合成和翻译15的结果。解决这些问题已经在其他研究中的GFP的修改如下：
蛋白酶体活性被认为是降低细胞衰老和有机体的老化7，8，9，10。在衰老研究领域，重点主要是去除氧化蛋白的蛋白酶体起着关键的作用，有没有确凿的证据，在这种情况下，2降解蛋白的泛素化之前。以前的工作还表明，利用绿色荧光蛋白基因的变异uncleavable泛素部分是适合研究复杂过程的protein降解16。这GFP结构给人的可能性监控蛋白酶体活性没有通过泛素机械干扰的潜在影响它的活动。
在这项工作中，我们使用了degron不稳定GFP记者蛋白（GFP-DGN）监视人二倍体成纤维细胞在活泛素 - 蛋白酶体活性。有一个全面的转染效率，功能和转录/翻译水平的GFP-DGN记者的，适当的控制措施都包括在内。我们年轻的未经处理的GFP-DGN转染的成纤维细胞几乎没有绿色荧光可见，蛋白酶体的功能不会受到影响。为了验证，抑制蛋白酶体的信号的增加与，我们治疗GFP-DGN转染的成纤维细胞，用蛋白酶抑制剂看到GPF的积累抑制后。三分之一的控制，我们使用GFP-dgnFS的。有了这个结构，我们可以显示overa会的转染效率，可以从细胞株细胞株，我们有在细胞内的结构的概述在合成率与所有三个控件不同。
这里介绍的方法，使用户能够容易且迅速地测量在活细胞中的泛素 - 蛋白酶体活性。甲稳定过度表达的GFP报告用基材，可以实现用不同的技术17。在该出版物中，转染的GFP-DGN进入细胞的cDNA的慢病毒的系统，该系统提供了一个稳定的表达来实现。此外，使用该系统能够独立的细胞类型，细胞代谢条件或捐赠者的年龄7的高转染效率。我们已成功地使用这个协议引入DNA的内皮细胞中，转染的其他方法失败18。然而，以往的实验表明，细胞，扩大在文化表现出较低的萤光信号比新鲜转染的细胞，可能是由于较长的选择压力。
PEG沉淀是用来增加转化每毫升单位（TU /毫升）的滴度。如果良好的滴度达到（高于5×10 10 TU /毫升），PEG沉淀，可以省略。 PEG沉淀过程中的一个重要步骤，是要避免剧烈的暂停或移液产生气泡。它可以灭活的病毒颗粒，并显着降低的转染效率。
使用蛋白酶抑制剂时，应进行先验的实验。使用的最终浓度和温育时间取决于细胞类型，并且必须通过实验来确定。往前HFF-2细胞的观察显示，3小时孵化与LLNL不应被超过，因为1）的毒性作用的抑制剂2）过高的GFP信号，可以达到，或3）蛋白酶抑制的副作用，在更长的添Ë时期。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究由国家老化（NFN S93）由奥地利科学基金会（FWF），欧盟委员会综合项目MiMAGE和PROTEOMAGE，荷兰基因组计划研究网络/荷兰科学研究组织（NGI / NWO; 05040202，050 - 060-810恩查），欧盟资助网络的卓越寿命（FP6 036894），和基因组学创新研究计划（SenterNovem IGE01014和IGE5007）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
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