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Biology

जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि की निगरानी एक Degron (DGN) अस्थिर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (GFP) आधारित प्रोटीन का उपयोग

Published: November 10, 2012 doi: 10.3791/3327

Summary

Ubiquitin-एंटीबॉडी जीवित कोशिकाओं में गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक विधि का वर्णन है. एक degron अस्थिर GFP (GFP-DGN) और एक स्थिर GFP-dgnFS संलयन प्रोटीन उत्पन्न कर रहे हैं और एक lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग सेल में transduced. इस तकनीक के लिए एक स्थिर GFP-dgn/GFP-dgnFS व्यक्त सेल लाइन में जो ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि epifluorescence या प्रवाह cytometry का उपयोग आसानी से किया जा मूल्यांकन कर सकते हैं उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

एंटीबॉडी मुख्य intracellular organelle असामान्य, misfolded, क्षतिग्रस्त या ऑक्सीकरण हो जाता है 1 प्रोटीन, 2 की गिरावट proteolytic में शामिल है. सेल तनाव 3 प्रतिक्रिया, कोशिका चक्र विनियमन और सेलुलर भेदभाव 4 या प्रतिरक्षा प्रणाली जवाब में 5 की तरह, एंटीबॉडी गतिविधि के रखरखाव में कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में फंसा था. ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली की शिथिलता ट्यूमर और neurodegenerative रोगों के 4, 6 के विकास के लिए संबंधित दिया गया है. इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी गतिविधि में एक कमी सेलुलर senescence और organismal उम्र बढ़ने के 7, 8, 9, 10 की एक विशेषता के रूप में पाया गया था. यहाँ, हम रहने वाले एक GFP-DGN संलयन प्रोटीन का उपयोग कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. प्राथमिक जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि पर नजर रखने में सक्षम हो सकता है, पूरक डीएनए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) DGN संलयन प्रोटीन के लिए कोडिंग constructs (GFPDGN, अस्थिर) और एक एक frameshift उत्परिवर्तन (GFP dgnFS, 11 स्थिर) ले जाने variant lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर में डाला जाता है. हम पारंपरिक अभिकर्मक तकनीकों पर इस तकनीक को पसंद करते हैं, क्योंकि यह एक बहुत ही उच्च अभिकर्मक दक्षता की गारंटी देता है सेल प्रकार या दाता की उम्र के स्वतंत्र. (स्थिर) GFP-dgnFS प्रोटीन और या एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला की अनुपस्थिति में अस्थिर प्रोटीन (GFP DGN) द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने के लिए एक विशेष सेल तनाव में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन मतभेदों epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकता है या cytometry प्रवाह से मापा जा सकता है.

Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण

  1. DGN (11 ACKNWFSSLSHFVIHL) के लिए और dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) के लिए आदेश कस्टम एन्कोडिंग oligo-nucleotides और यह pEGFP-C1 वेक्टर में कटी घमनी को बांधना / DGN dgnFS (1 चित्रा) के साथ GFP की संलयन प्राप्त करने के.
  2. पीसीआर के प्रोटोकॉल pENTR दिशात्मक Topo क्लोनिंग किट और pLenti6/V5 दिशात्मक Topo क्लोनिंग किट (चित्रा 6) के साथ जारी रखने के अनुसार GFP-DGN और GFP-dgnFS के लिए कोडिंग अनुक्रम बढ़ाना.

2. वायरस उत्पादन

  1. अभिकर्मक के पहले दिन (1 दिन) एक T75 बोतल इतना है कि वे अभिकर्मक की दिन पर 90-95% सहधारा होगा HEK 293FT कोशिकाओं के बाहर बीज.
  2. अभिकर्मक का दिन DMEM की 1.5 मिलीलीटर में सीरम और एक 15 मिलीलीटर बाज़ में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना lipofectamine 2000 अभिकर्मक की 36 μl पतला. एक और 15 मिलीलीटर बाज़ का प्रयोग करें और 3 pLenti6/V5 ग्राम या तो GFP के लिए ले जाने के पूरक डीएनए का निर्माण जलमिश्रित DGN या GFP dgnFS, 2.5 ग्राम लिफाफा एन्कोडिंग प्लाज्मिड और सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना DMEM के 1.5 मिलीलीटर में 7.5 ग्राम वेक्टर psPAX2 रीढ़ की हड्डी pMD2.G. 5 मिनट के बाद पतला डीएनए पतला lipofectamine अभिकर्मक 2000 के साथ संयुक्त है.
  3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते प्रपत्र डीएनए lipofectamine परिसरों की अनुमति.
  4. HEK 293FT कोशिकाओं के माध्यम निकालें, यह ध्यान और मध्यम के 7 मिलीलीटर (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) के द्वारा जगह फ्लास्क और मिक्सिंग के लिए इसे आगे और पीछे रॉक (2 दिन) के लिए डीएनए - lipofectamine मिश्रण जोड़ें. फ्लास्क रातोंरात एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. अगले दिन (3 दिन में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10 मिलीलीटर मध्यम) मध्यम बदलें.
  6. 48 घंटा के बाद (5 दिन) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर फसल तैरनेवाला अपकेंद्रित्र, और एक 0.45 सुक्ष्ममापी PVDF फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फिल्टर.

संस्कृति मध्यम DMEM (293FT HEK)

तम्बू "> DMEM
10% FBS
0.1 मिमी सदस्य NEAA
6 मिमी एल glutamine
1 मिमी सदस्य सोडियम पाइरूवेट
1% पेन Strep (वैकल्पिक)
500 ग्राम / एमएल Geneticin (वैकल्पिक)

3. Polyethylene glycol (खूंटी) वर्षा वायरस एकाग्रता

  1. तैरनेवाला और 4 में 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस के चार संस्करणों के लिए, एक मात्रा polyethylene glycol (खूंटी 50 मिमी Polyethylene glycol, 41 मिमी NaCl, आटोक्लेव, = पीएच 7.2) समाधान जोड़ें ध्यान यह inverting द्वारा हर 20-30 मिनट का मिश्रण.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1500 XG में नीचे स्पिन एक सफेद गोली दिखाई जानी चाहिए.
  3. तैरनेवाला Aspirate और फिर 5 मिनट के लिए 1500 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र शेष खूंटी समाधान Aspirate.
  4. मध्यम या में गोली Resuspend फॉस्फेट pipetting और नीचे और तेजी से 20 से 30 सेकंड के लिए भंवर द्वारा खारा (पीबीएस) buffered. एक दिशानिर्देश के रूप में एक T75 फ्लास्क और यह 100 μl अशेष भाजक के लिए 500 μl का उपयोग करें. -80 में वायरस स्टोर डिग्री सेल्सियस

  1. 5 बाहर बीज × 10 4 एक 6 अच्छी तरह से थाली अभिकर्मक पहले दिन की एक अच्छी तरह से कोशिकाओं U2 ओएस.
  2. अभिकर्मक के दिन संस्कृति के माध्यम हटाने और यह DMEM 8 ग्राम / एमएल polybrene (hexadimethrine ब्रोमाइड) से युक्त 1 मिलीलीटर द्वारा प्रतिस्थापित. केंद्रित वायरस तैरनेवाला 1:10 और 1:100 पतला और 1 μl एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक जोड़ना. उच्च वायरस सांद्रता 1 μl, 5 μl और शेष कुओं के लिए केंद्रित वायरस तैरनेवाला के 10 μl का उपयोग करें. एक अच्छी तरह से एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया है.
  3. अगले दिन DMEM के 2 मिलीलीटर से मध्यम की जगह.
  4. अगले दिन चयन के साथ शुरू करो. प्रत्येक पर अच्छी तरह से 10 / छ एमएल Blasticidin लागू. एंटीबायोटिक युक्त मध्यम हर दूसरे दिन बदलें.
  5. चयन शुरू करने के बाद लगभग 6-7 दिनों untransduced कोशिकाओं मर चुके हैं. के लिए धुंधला हो जाना कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धो और साथ क्रिस्टल बैंगनी (10 मिलीग्राम / एल क्रिस्टल बैंगनी कोशिकाओं को कवर20%) इथेनॉल और 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते में. Aspirate क्रिस्टल बैंगनी (एक बार कुछ reused किया जा सकता है) और कुओं DDH 2 हे के साथ दो बार कुल्ला थाली सूखी.
  6. कालोनियों गणना और 1000 और इसी कमजोर पड़ने (7 चित्रा) से गुणा. इस प्रक्रिया के लिए वायरस / एमएल अभिकर्मक इकाइयों (टीयू) की गणना करने के लिए अनुमति देता है.

संस्कृति मध्यम DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6mm एल glutamine
1% पेन Strep

5. मानव diploid Fibroblasts के पारगमन (इस प्रक्रिया में किसी भी कोशिका प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.)

  1. 5 बाहर बीज × 10 4 मानव diploid (HDFs) fibroblasts 6 अच्छी तरह प्लेटें पारगमन से पहले दिन.
  2. दो के संक्रमण की बहुलता के साथ प्रयोग 8 / मिलीलीटर polybrene पारगमन बढ़ाने के रूप में एक मिली लीटर के एक कुल में ग्राम के साथ.
  3. अगले दिन मध्यम बदलें.
  4. जबकोशिकाओं को 10 ग्राम / मिलीलीटर blasticidin साथ चयन confluency शुरू की 70-80% पर हैं. चयन के बाद पूरा हो गया है (कोई अधिक untransfected कोशिकाओं मर) कोशिकाओं के विस्तार शुरू और कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए तैयार कर सकते हैं. पुरानी blasticidin साथ चयन करने के लिए एक स्थिर सेल लाइन overexpressing GFP-DGN या GFP-dgnFS संलयन प्रोटीन, एंटीबॉडी गतिविधि को मापने के लिए तैयार उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रक्रिया में एक बहुत ही उच्च अभिकर्मक दक्षता स्वतंत्र सेल प्रकार की गारंटी देता है.

6. फ्लो मापन

  1. 1 बाहर बीज × 10 5 (या तो GFP-DGN या GFP dgnFS ले) कोशिकाओं के प्रयोग से पहले दिन.
  2. नियंत्रण कक्ष 3 घंटा पहले एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला के साथ माप, उदाहरण के 100 छ / मिलीलीटर LLNL समझो.
  3. पीबीएस के साथ दो बार धोने और trypsin की 0.5 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं फसल. रोकने के मध्यम संस्कृति के 4.5 मिलीलीटर trypsinisation का उपयोग करें और एक 15 मिलीलीटर बाज़ कोशिकाओं स्थानांतरण.
  4. स्पिन टीवह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG में कोशिकाओं.
  5. मध्यम Aspirate, पीबीएस में कोशिकाओं resuspend और 37 नीचे फिर 5 मिनट के लिए 300 XG में स्पिन डिग्री सेल्सियस
  6. पीबीएस, FACS बफर (10 मिमी HEPES, 140 मिमी NaCl, 2.5 मिमी 2 CACL, पीएच = 7.4) के 400 μl में resuspend Aspirate और FACS ट्यूबों में कोशिकाओं हस्तांतरण.
  7. प्रवाह cytometry से बर्फ और उपाय के नमूने पर कोशिकाओं रखें. कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर अब की तुलना में 30 मिनट संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए

7. प्रतिनिधि परिणाम

GFP-DGN संलयन प्रोटीन जो एंटीबॉडी और इसलिए प्रोटीन तुरंत अपमानित करने का लक्ष्य है एक अनुक्रम किया जाता है, यह GFP प्रतिदीप्ति संकेत में कमी करने के लिए मेल खाती है. frameshift उत्परिवर्ती (GFP dgnFS) इस दृश्य के एक mutated संस्करण वहन करती है और एंटीबॉडी के द्वारा अपमानित नहीं है, यह उच्च हरी प्रतिदीप्ति की ओर जाता है. इन कारणों के लिए, उच्च एंटीबॉडी गतिविधि की उम्मीद के साथ युवा HDFs और GFP-महानिदेशक के साथ transducedn एक कम (6% सकारात्मक कोशिकाओं) दोनों प्रवाह cytometry माप में और epifluorescence (चित्रा 2A और बी, चित्रा 3) में प्रतिदीप्ति संकेत दिखा. एक ही HDFs GFP-dgnFS के साथ सकारात्मक कोशिकाओं के 39.7% प्रदर्शित transduced. एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला LLNL (N-acetyl-एल leucyl - एल leucyl - एल norleucinal) के साथ कोशिकाओं के इलाज के दोनों, GFP DGN और GFP-dgnFS कोशिकाओं (चित्रा 2A और बी में 62.9% की अधिकतम संकेत उठाया ).

आयु वर्ग के मानव त्वचा के नमूने में एंटीबॉडी गतिविधि में संभव गिरावट निर्धारित करने के लिए, युवा, मध्यम आयु वर्ग और पुराने दाताओं से पृथक त्वचीय fibroblasts GFP-DGN और GFP-dgnFS के साथ संक्रमित थे, जैसा कि ऊपर वर्णित और प्रवाह से विश्लेषण से पहले ही मार्ग संख्या की खेती cytometry. इन प्रयोगों में, युवा व्यक्तियों के बीच GFP संकेत में एक स्पष्ट वृद्धि (11.2 ± 0.88% GFP पॉजिटिव कोशिकाओं) और मध्यम आयु वर्ग के दाताओं (20.4 ± 2.27% GFP पॉजिटिव कोशिकाओं, पी = .003) देखी गई है, एक संकेत है proteas में कमीवृद्ध 7 दाताओं (4 चित्रा) से प्राप्त नमूनों में ome गतिविधि. एंटीबॉडी गतिविधि में आगे कोई कमी सबसे पुराना व्यक्तियों (4 चित्रा) से अलग fibroblasts में मनाया गया. सभी मामलों में GFP-dgnFS के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता था ~ 90% (नहीं दिखाया डेटा), जो तीन विभिन्न आयु समूहों के लिए एक उच्च अभिकर्मक दक्षता को इंगित करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. GFP की (हरा) के कई क्लोनिंग साइट pEGFP CL1 (ग्रे) वेक्टर और अनुक्रम / DGN dgnFS (लाल) GFP-DGN और GFP-dgnFS अनुक्रम. प्रदर्शित अंत 3'है.

चित्रा 2
चित्रा 2. GFP-DGN और GFP-dgnFS मानव diploid fibroblasts के प्रवाह cytometry विश्लेषण. ए यंग मानव चमड़ी fibroblasts (HFF-2) एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले जाने lentiviral वैक्टर से संक्रमित थे (GFP)-DGN जीन या एक GFP-dgnFS (frameshift) का निर्माण, के रूप में संकेत दिया है और प्रवाह cytometry (FACS सर्ग द्वितीय, Becton Dickinson) का उपयोग GFP प्रतिदीप्ति के लिए विश्लेषण. जहां संकेत दिया है, कोशिकाओं को भी एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला N-acetyl एल leucyl - एल leucyl-L norleucinal (LLNL) के साथ 3 के लिए इलाज किया. असंक्रमित कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. प्रयोगों triplicates में प्रदर्शन किया गया बी डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. संख्या GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की राशि को प्रतिबिंबित बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. GFP-DGN और GFP-dgnFS HFF-2 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण युवा HFF-2. चित्रा 2 में के रूप में इलाज किया गया. संक्रमण के बाद 9 दिनों में, कोशिकाओं v थेप्रतिदीप्ति और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी isualized.

चित्रा 4
चित्रा 4. मानव त्वचा की उम्र बढ़ने में एंटीबॉडी गतिविधि में परिवर्तन का संकेत आयु समूहों में नौ अलग दाताओं से मानव चमड़ी fibroblasts न्यूनतम और विस्तार किया गया lentiviral GFP-DGN के लिए कोडिंग constructs के साथ संक्रमित. संक्रमण के बाद 9 दिनों में, कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया गया. डेटा डुप्लिकेट में तीन आयु समूह के प्रति नमूने (एसई ±) पर प्राप्त किया गया है.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रायोगिक दृष्टिकोण DGN और dgnFS के लिए कस्टम oligo nucleotides. वेक्टर pEGFP C1 में क्लोन कर रहे हैं और वायरस प्रत्येक HEK 293FT कोशिकाओं का उपयोग निर्माण के लिए उत्पादन कर रहे हैं. वायरस के अनुमापांक निर्धारित किया जाता है. कोशिकाएं वायरस के साथ transduced कर रहे हैं और विस्तार किया. इष्ट उपचार के बाद कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैंप्रवाह cytometry द्वारा प्रतिदीप्ति संकेत के लिए.

चित्रा 6
6 चित्रा. GFP - DGN pLenti के मानचित्र. PLenti6/V5-DEST GFP - DGN अनुक्रम सहित वेक्टर नक्शा प्रदर्शित होता है. Abbreviations: (सीएमवी प्रमोटर) PCMV, GFP-DGN (GFP-DGN के अनुक्रम), पी SV40 (SV40 जल्दी प्रमोटर), EM7 (EM7 प्रमोटर), Blasticidin (Blasticidin प्रतिरोध जीन) / ΔU3 3'LTR (3'LTR साथ नष्ट कर दिया U3) क्षेत्र, SV40 PA (SV40 polyadenylation संकेत), (एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन) एम्पीसिलीन, PUC (पीयूसी मूल) मूल PRSV / 5'LTR (RSV 5'LTR / संकर प्रमोटर), Ψ (एचआईवी 1 Ψ पैकेजिंग संकेत ), आरआरई (एचआईवी-1 राजस्व प्रतिक्रिया तत्व).

7 चित्रा
चित्रा 7. U2 ओएस titering प्लेट U2 ओएस एक 6-अच्छी तरह से थाली पर वरीयता प्राप्त किया गया और अलग वायरस सांद्रता (1/100 और 1/10 के कमजोर पड़ने, 1, 5 और सह के 10 μl साथ ट्रांसफ़ेक्टवायरल तैरनेवाला ncentrated). एक अच्छी तरह से untransfected नियंत्रण (NT) के रूप में इस्तेमाल किया गया था. 6-7 दिनों के बाद कोशिकाओं क्रिस्टल बैंगनी और हवा सूख साथ दाग थे.

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Discussion

1 ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि के लिए एक संवाददाता सब्सट्रेट के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग प्रकाशन 12 2000 में प्रकाशित किया गया था. तब से, GFP सेलुलर गतिविधियों, विशेष रूप से ubiquitin-एंटीबॉडी प्रक्रिया कल्पना करने के लिए एक आम उपकरण बन गया है. Ubiquitin-एंटीबॉडी vivo में गतिविधि पर नजर रखने एक GFP आधारित संवाददाता के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 13 शुरू किया गया है. Vivo अनुसंधान में एक इसी तरह degron अस्थिर GFP संवाददाता के रूप में इस प्रकाशन में 14 प्रयोग किया जाता के साथ अतिरिक्त एक और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की स्थापना की.

दुर्भाग्य से, एक पत्रकार के रूप में GFP कुछ दोष है जो Dantuma एट अल द्वारा दिखाया गया है और बोमन एट अल. 12,15. सबसे पहले, अस्थिर GFP एंटीबॉडी के अवरोध के बिना अज्ञात कारणों की वजह से जमा कर सकते हैं. Ubiquitin-एंटीबॉडी मशीनरी के रूप में एक प्रणाली की कार्यक्षमता जिसका कई कदम पर निर्भर है, विज्ञापनगिरावट के लिए पहले isturbance संवाददाता सब्सट्रेट और झूठी सकारात्मक प्रभाव 12 में परिणाम के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दूसरा, GFP आधारित संवाददाता substrates उनके प्रतिलेखन और अनुवाद में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील आधा रहता है कम करने के लिए कारण हैं. GFP प्रतिदीप्ति में कोई परिवर्तन इसलिए कम या वृद्धि संश्लेषण और 15 अनुवाद का एक परिणाम हो सकता है. इन समस्याओं GFP संशोधनों के द्वारा किया गया है अन्य अध्ययनों में इस प्रकार के रूप में संबोधित:

एंटीबॉडी गतिविधि के लिए सेलुलर senescence और organismal उम्र बढ़ने के 7, 8, 9, 10 में कम हो पाया था. अनुसंधान उम्र बढ़ने के क्षेत्र में, ऑक्सीकरण हो जाता है जहां एंटीबॉडी प्रोटीन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता के हटाने पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित है, और कोई निर्णायक सबूत है कि प्रोटीन ubiquitylation इस मामले में 2 गिरावट पछाड़ दिया है. पिछले काम भी पता चला है कि GFP की एक उत्परिवर्तित uncleavable ubiquitin आधा भाग के साथ प्रयोग करने के लिए पी की जटिल प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैrotein गिरावट 16. यह GFP का निर्माण ubiquitin मशीनरी में गड़बड़ी के माध्यम से अपनी गतिविधि के लिए संभावित प्रभाव के बिना एंटीबॉडी गतिविधि पर नजर रखने के लिए संभावना देता है.

इस काम में, हम एक degron अस्थिर संवाददाता GFP आधारित प्रोटीन (GFP DGN) का इस्तेमाल मानव diploid fibroblasts में रहने वाले ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि पर नजर रखने के लिए. अभिकर्मक दक्षता, कार्यक्षमता और संवाददाता GFP-DGN / प्रतिलेखन अनुवाद के स्तर के एक सिंहावलोकन है, कई उचित नियंत्रण शामिल थे. हम युवा अनुपचारित GFP DGN ट्रांसफ़ेक्ट fibroblasts इस्तेमाल चलता है कि वहाँ लगभग कोई हरी प्रतिदीप्ति दिखाई और एंटीबॉडी समारोह प्रभावित नहीं है. करने के लिए मान्य है, कि एंटीबॉडी के निषेध के साथ संकेत बढ़ जाती है, हम एक एंटीबॉडी निषेध के बाद जीपीएफ के संचय अवरोध करनेवाला के साथ इलाज GFP-DGN ट्रांसफ़ेक्ट fibroblasts. एक तीसरे नियंत्रण के रूप में हम GFP-dgnFS इस्तेमाल किया. इस निर्माण के साथ हम दिखा सकते हैं Overaकरूँगा अभिकर्मक दक्षता है जो सेल सेल तनाव से तनाव और सभी तीन नियंत्रण हम कोशिका के भीतर संरचनाओं के संश्लेषण की दर पर एक सिंहावलोकन के साथ अलग कर सकते हैं.

यहाँ प्रस्तुत पद्धति उपयोगकर्ता आसानी से और तेजी से जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि को मापने के लिए सक्षम बनाता है. GFP संवाददाता सब्सट्रेट के एक स्थिर overexpression अलग 17 तकनीक के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकाशन में, GFP-DGN कोशिकाओं में सीडीएनए अभिकर्मक lentiviral प्रणाली है जो एक स्थिर अभिव्यक्ति प्रदान करता है के द्वारा प्राप्त किया है. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली के उपयोग उच्च अभिकर्मक सेल प्रकार, सेल चयापचय हालत या दाता उम्र 7 स्वतंत्र दक्षता के लिए सक्षम बनाता है. हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है जो endothelial कोशिकाओं में अभिकर्मक के अन्य तरीकों के 18 में विफल रहा है करने के लिए डीएनए परिचय. फिर भी, पिछले प्रयोगों से पता चला है कि कोशिकाओं है कि अब संस्कृति में विस्तार कर रहे हैं एक कम प्रतिदीप्ति प्रदर्शनहौसले ट्रांसफ़ेक्ट संभवतः अब चयन दबाव के कारण कोशिकाओं की तुलना में संकेत.

खूंटी वर्षा के लिए मिलीग्राम (TU / एमएल) के अनुसार बदलने इकाइयों की titer में वृद्धि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अगर अच्छा titers (5 × 10 5 / TU एमएल ऊपर) तक पहुँच रहे हैं, खूंटी वर्षण की संभावना छोड़ा जा सकता है. खूंटी वर्षण के दौरान जोरदार suspending या pipetting जो हवाई बुलबुले उत्पन्न से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. यह वायरस कणों को निष्क्रिय और काफी अभिकर्मक दक्षता में कमी कर सकते हैं.

एक priori प्रयोगों चाहिए जब एंटीबॉडी inhibitors का उपयोग किया जाना चाहिए. अंतिम एकाग्रता का इस्तेमाल किया और ऊष्मायन समय सेल प्रकार निर्भर हैं और प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है. HFF दो कोशिकाओं पर पिछला टिप्पणियों से पता चला है है कि LLNL साथ 3 ऊष्मायन 1 की वजह से पार नहीं चाहिए) अवरोध करनेवाला के विषाक्त प्रभाव 2) भी उच्च GFP संकेत है कि पहुँचा जा सकता है, या 3) एंटीबॉडी अवरोध के साइड इफेक्ट अब टिम परई समय.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस अध्ययन के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: ऑस्ट्रियाई विज्ञान फाउंडेशन (FWF), यूरोपीय आयोग एकीकृत परियोजनाएं MiMAGE और PROTEOMAGE, नीदरलैंड जीनोमिक्स पहल द्वारा एजिंग (S93 NFN) पर राष्ट्रीय अनुसंधान नेटवर्क / वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (एनजीआई NWO / 05040202 और 050 - 060-810) NCHA, यूरोपीय संघ के नेटवर्क उत्कृष्टता जीवनकाल (036,894) FP6 वित्त पोषित, और अभिनव जीनोमिक्स पर उन्मुख अनुसंधान कार्यक्रम (SenterNovem, IGE01014 और IGE5007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 Vector BD Bioscience Clontech 6084-1
pENTR Directional TOPO Cloning Kit Invitrogen K2400-20
pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit Invitrogen V496-10
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668019
DMEM Sigma-Aldrich D5546
PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) Carl Roth Gmbh P667.1
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P2139
NaCl Merck & Co., Inc. 1.06404.1000
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) Invitrogen 14190
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 10,768-9
Blasticidin Invitrogen R21001
Crystal violet Sigma-Aldrich C3886
FACS tubes BD Biosciences
Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) Invitrogen 15140130
L-glutamine 200 mM Invitrogen 25030024
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom AG S0115
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x Invitrogen 11140035
MEM Sodium Pyruvate 100 mM Invitrogen 11360039
D-(+)-Glucose (45%) Sigma-Aldrich G8769
Geneticin Invitrogen 11811023
CaCl2 Merck & Co., Inc. C5080
Hepes Sigma-Aldrich H3375
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300054

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References

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जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि की निगरानी एक Degron (DGN) अस्थिर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (GFP) आधारित प्रोटीन का उपयोग
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Greussing, R., Unterluggauer, H., Koziel, R., Maier, A. B., Jansen-Dürr, P. Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein. J. Vis. Exp. (69), e3327, doi:10.3791/3327 (2012).

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