Summary
Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.
Abstract
Proteasoma è l'organello intracellulare principale coinvolto nella degradazione proteolitica della anormali, proteine misfolded, danneggiati o ossidati 1, 2. Manutenzione delle attività del proteasoma è stato coinvolto in molti processi cellulari chiave, come risposta allo stress cellulare 3, regolazione del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare 4 o nella risposta del sistema immunitario 5. La disfunzione del sistema ubiquitina-proteasoma è stata correlata allo sviluppo di tumori e malattie neurodegenerative 4, 6. Inoltre, una diminuzione dell'attività del proteasoma trovato è una caratteristica della senescenza cellulare e organismal invecchiamento 7, 8, 9, 10. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare ubiquitina-proteasoma attività in cellule viventi usando un GFP-DGN proteina di fusione. Per poter controllare ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi primarie, DNA complementare costruisce codificante per una proteina fluorescente verde (GFP)-DGN proteina di fusione (GFP-DGN, instabile) e una variante portando una mutazione frameshift (GFP-dgnFS, stabile 11) sono inseriti in vettori di espressione lentivirali. Preferiamo questa tecnica rispetto alle tecniche tradizionali di transfezione in quanto garantisce una elevata efficienza di trasfezione molto indipendente dal tipo di cellula o l'età del donatore. La differenza tra fluorescenza visualizzata dal GFP-dgnFS (stabile) proteine e la proteina destabilizzato (GFP-dgn) in assenza o presenza di inibitori del proteasoma può essere usato per stimare ubiquitina-proteasoma attività in ciascun ceppo cella particolare. Queste differenze possono essere monitorati mediante microscopia in epifluorescenza o può essere misurata mediante citometria a flusso.
Protocol
1. Costruzione plasmide
- Ordine personalizzato oligo-nucleotidi codifica per DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) e per dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) e legare esso nel pEGFP-C1 vettore per ottenere la fusione della GFP con DGN / dgnFS (Figura 1).
- Amplifica la sequenza codificante per GFP-DGN e GFP-dgnFS mediante PCR secondo il protocollo della clonazione pENTR direzionale Kit TOPO e continuare con il pLenti6/V5 direzionale TOPO Cloning Kit (Figura 6).
2. Virus di produzione
- Il giorno prima della transfezione (giorno 1) sementi su cellule HEK 293FT in fiasche T75 un modo che sarà 90-95% confluenti il giorno della trasfezione.
- Il giorno della trasfezione diluire 36 ml di reagente lipofectamina 2000 in 1,5 ml di DMEM senza siero e antibiotici in un falcon 15 ml. Utilizzare un altro ml 15 falco e diluire 3 mcg pLenti6/V5 portando il DNA complementare costrutto sia per GFP -DGN o GFP-dgnFS, 2,5 microgrammi pMD2.G busta codifica plasmide vettore backbone e 7,5 mg psPAX2 in 1,5 ml di DMEM senza siero e antibiotici. Dopo 5 min il DNA diluito viene combinato con il reagente diluito lipofectamina 2000.
- Incubare la miscela per 20 min a temperatura ambiente per permettere i complessi DNA-lipofectamina di forma.
- Rimuovere il supporto di cellule HEK 293FT, sostituirlo con attenzione da 7 ml di terreno (senza antibiotici) e aggiungere il DNA-lipofectamina miscela al pallone e la roccia avanti e indietro per la miscelazione (2 ° giorno). Incubare la beuta notte a 37 ° C in un umidificata 5% CO 2 incubatore.
- Cambiare media il giorno successivo (10 ml di mezzo senza antibiotici; 3 ° giorno).
- Dopo 48 ore (giorno 5) supernatante raccolto, centrifugare a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e filtrare il supernatante attraverso un filtro di PVDF 0,45 micron.
Cultura medio - DMEM (HEK 293FT)
tenda "> DMEM10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutammina
1 mM MEM Piruvato di sodio
1% Pen-Strep (opzionale)
500 pg / ml Geneticin (opzionale)
3. Concentrazione Virus polietilene glicole (PEG) Precipitazioni
- Aggiungere un volume di glicole polietilene soluzione (50 Polietilenglicole mM, 41 mM NaCl, autoclave, pH = 7.2; PEG) a quattro volumi di surnatante e incubare per 2 ore a 4 ° C. Mescolare accuratamente ogni 20-30 minuti per inversione.
- Centrifugare a 1500 xg per 30 min a 4 ° C. Un pellet bianco deve essere visibile.
- Aspirare il surnatante e centrifugare nuovamente a 1500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare la soluzione rimanente PEG.
- Risospendere il precipitato in media o tampone fosfato salino (PBS) pipettando su e giù e vigorosamente vortex per 20 a 30 secondi. Come linea guida usa 500 pl per una beuta T75 e aliquota a 100 pl. Conservare il virus a -80 ° C.
- Seme su 5 × 10 4 U2-OS cellule in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione.
- Il giorno della trasfezione rimuovere il mezzo di coltura e sostituirla con 1 ml di DMEM contenente 8 mg / ml polibrene (hexadimethrine bromuro). Diluire il virus concentrato surnatante 1:10 e 1:100 e aggiungere 1 ml ciascuna ad un pozzetto. Per concentrazioni superiori virus usare 1 ml, 5 microlitri e 10 pl di surnatante virale concentrato per restanti pozzetti. Un pozzetto viene lasciata come controllo positivo.
- Il giorno seguente sostituire il mezzo da 2 ml di DMEM.
- Inizia con la selezione il giorno successivo. Applicare 10 pg / ml di blasticidina ciascun pozzetto. Sostituire il mezzo antibiotico contenente ogni secondo giorno.
- Circa 6-7 giorni dopo aver iniziato la selezione delle cellule untransduced sono morti. Per la colorazione lavare le cellule tre volte con PBS e coprire le cellule con cristal violetto (10 mg / l cristal violettoin 20% etanolo) e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare cristallo viola (può essere riutilizzato un paio di volte) e sciacquare i pozzetti due volte con DDH 2 O e asciugare la piastra.
- Contare le colonie e moltiplicare con 1.000 e la diluizione corrispondente (Figura 7). Questa procedura permette di calcolare le unità di trasfezione (TU) del virus / ml.
Cultura medio - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM
10% FBS
6MM L-glutammina
1% Pen-Strep
5. Trasduzione di fibroblasti diploidi umane (Questa procedura può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula.)
- Seed su 5 × 10 4 fibroblasti diploidi umane (HDFS) a 6-pozzetti il giorno prima trasduzione.
- Utilizzare una molteplicità di infezione di due insieme con 8 mg / ml polibrene trasduzione come enhancer in un totale di un millilitro.
- Cambiare media il giorno successivo.
- Quandole cellule sono a 70-80% di confluenza inizio della selezione con 10 pg / ml blasticidina. Dopo la selezione è completa (assenza di cellule non trasfettate più muoiono) l'espansione delle cellule può iniziare e le cellule sono pronte per esperimenti. Selezione cronica con blasticidina permette di generare una linea cellulare stabile overexpressing GFP-DGN o GFP-dgnFS proteine di fusione, pronti per misurare l'attività del proteasoma. Questa procedura garantisce un elevata efficienza di trasfezione molto indipendente dal tipo di cellula.
6. Misura di Citometria a Flusso
- Seed out 1 × 10 5 cellule (trasporto o GFP-DGN o GFP-dgnFS) il giorno prima dell'esperimento.
- Trattare cellule di controllo 3 ore prima della misurazione con l'inibitore del proteasoma, ad esempio 100 mg / ml LLNL.
- Lavare due volte con PBS e raccogliere le cellule con 0,5 ml di tripsina. Per arrestare la tripsinizzazione utilizzare 4,5 ml di mezzo di coltura e trasferire le cellule a 15 ml di una falcon.
- Spin tegli cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il terreno, risospendere le cellule in PBS e centrifugare di nuovo a 300 xg per 5 min a 37 ° C.
- Aspirare il PBS, risospendere in 400 ml di FACS tampone (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, pH = 7.4) e trasferire le cellule nei tubi FACS.
- Mantenere le cellule su campioni di ghiaccio e misura mediante citometria a flusso. Le cellule non devono essere conservate per più di 30 minuti a 4 ° C.
7. Risultati rappresentativi
La GFP-dgn proteina di fusione porta una sequenza che si rivolge al proteasoma e quindi la proteina è immediatamente degradato e corrisponde alla riduzione del segnale di fluorescenza GFP. Il frameshift mutante (GFP-dgnFS) porta una versione mutata di questa sequenza e non è degradata da proteasoma, conduce alla maggiore fluorescenza verde. Per queste ragioni, giovane HDFS previsto ad alta attività del proteasoma e trasdotte con GFP-dgn mostrano una bassa (6% cellule positive) sia nel segnale di fluorescenza misurazione del flusso e citometria a epifluorescenza (Figura 2A e B, figura 3). Lo stesso HDFS trasdotte con GFP-dgnFS visualizzare 39,7% di cellule positive. Il trattamento delle cellule con inibitore LLNL proteasoma (N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal) sollevato il segnale massimo del 62,9% in entrambi, GFP-DGN e GFP-dgnFS cellule (Figura 2A e B ).
Per determinare la possibile perdita di attività del proteasoma in età compresa tra campioni di pelle umana, fibroblasti dermici isolati da donatori giovani, di mezza età e anziani sono stati infettati con GFP-DGN e GFP-dgnFS, come sopra descritto e coltivato al numero stesso passaggio prima dell'analisi con flusso citometria. In questi esperimenti, un netto aumento del segnale GFP tra gli individui giovani (11,2 ± 0,88% GFP-positive cellule) e di mezza età donatori (20,4 ± 2,27% GFP-positive cellule, P = 0.003) è stato osservato, che indica un diminuzione Proteasome attività in campioni ottenuti da donatori di età compresa tra 7 (Figura 4). Nessun ulteriore diminuzione proteasoma è stata osservata in fibroblasti isolati da individui più vecchi (Figura 4). Intensità di fluorescenza di GFP-dgnFS era in tutti i casi ~ 90% (dati non mostrati) che indica una elevata efficienza di trasfezione per i tre gruppi di età diverse.
Figura 1. La sequenza GFP-DGN e GFP-dgnFS. Mostrato è il terminale 3 'di GFP (verde) del sito di clonaggio multiplo del vettore pEGFP-CL1 (grigio) e la DGN / dgnFS sequenza (rosso).
Figura 2. Analisi di citometria a flusso di GFP-DGN e GFP-dgnFS fibroblasti diploidi umane. A. fibroblasti prepuzio giovani umani (HFF-2) sono state infettate con vettori lentivirali che trasportano una proteina fluorescente verde (GFP)-DGN o un gene GFP-dgnFS (frameshift) costrutto, come indicato e analizzato per fluorescenza GFP mediante citometria a flusso (FACS Canto II, Becton Dickinson). Dove indicato, le cellule sono state trattate per 3 ore con un inibitore del proteasoma N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal (LLNL). Cellule non infettate sono state usate come controllo. Esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. B. Dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. I numeri riflettono la quantità di cellule GFP positive. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Analisi di microscopia a fluorescenza GFP-DGN e GFP-dgnFS HFF-2 cellule. Giovane HFF-2 sono stati trattati come in Figura 2. A 9 giorni dopo l'infezione, le cellule erano visualized di fluorescenza e microscopia a contrasto di fase.
Figura 4. Variazioni attività del proteasoma in invecchiamento della pelle umana. I fibroblasti prepuzio umano di nove donatori diversi gruppi di età indicati, sono stati minimamente ampliato e infettati con costrutti lentivirali codificanti per GFP-DGN. A 9 giorni dopo l'infezione, le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. I dati sono stati ottenuti su tre campioni per fascia d'età in duplicato (± SE).
Figura 5. Approccio sperimentale. Custom-oligo nucleotidi per DGN e dgnFS sono clonato nel vettore pEGFP-C1 e virus sono prodotti per ogni costrutto utilizzando HEK cellule 293FT. Il titolo del virus è determinata. Cellule sono trasdotte con il virus e ampliato. Dopo il trattamento preferito le cellule vengono analizzateper il segnale di fluorescenza mediante citometria a flusso.
Figura 6. Mappa di Plenti GFP-DGN. La mappa del pLenti6/V5-DEST vettore compresa la GFP-DGN sequenza viene visualizzato. Abbreviazioni: pCMV (promotore CMV), GFP-DGN (sequenza di GFP-dgn), P SV40 (SV40 promotore precoce), EM7 (EM7 promotore), blasticidina (gene di resistenza blasticidina), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR con cancellato U3 regione), SV40 pA (SV40 segnale di poliadenilazione), ampicillina (gene di resistenza alla ampicillina), pUC ori (origine pUC), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR promotore ibrido), Ψ (HIV-1 segnale di imballaggio Ψ ), RRE (HIV-1 risposta elemento Rev).
Figura 7. U2-OS piastra titolazione. U2-OS sono state seminate su una piastra da 6 pozzetti e transfettate con concentrazioni virali (diluizione di 1/100 e 1/10, 1, 5 e 10 pl di concentrated surnatante virale). Un pozzetto è stato usato come controllo non trasfettate (NT). Dopo 6-7 giorni, le cellule sono state colorate con violetto cristallo ed essiccato all'aria.
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Discussion
La prima pubblicazione con la proteina fluorescente verde (GFP) come substrato reporter per ubiquitina-proteasoma attività è stata pubblicata nel 2000 12. Da allora, la GFP è diventata uno strumento comune per visualizzare le attività cellulari, in particolare il sistema ubiquitina-proteasoma processo. Per monitorare ubiquitina-proteasoma attività in vivo un modello di topo transgenico con GFP-reporter è stato introdotto 13. Ulteriori ricerca in vivo stabilito un altro modello di topo transgenico con un simile degron-destabilizzato reporter GFP come usato in questa pubblicazione 14.
Purtroppo, GFP come reporter ha qualche imperfezione che è stato dimostrato da Dantuma et al. E Bowman et al. 12,15. Primo, destabilizzato GFP può accumulare senza l'inibizione del proteasoma per motivi sconosciuti. Come il sistema ubiquitina-proteasoma macchinari è un sistema la cui funzionalità dipende da più passaggi, adisturbance prima della degradazione può portare all'accumulo del substrato reporter e risultato in falsi positivi effetti 12. Secondo, substrati a base di GFP reporter sono a causa della loro breve emivita sensibile ai cambiamenti di trascrizione e traduzione. Qualsiasi cambiamento nella fluorescenza GFP può quindi essere un risultato di sintesi ridotta o aumentata e traduzione 15. Questi problemi sono stati affrontati in altri studi da modificazioni della GFP come segue:
Proteasoma è stato trovato per essere diminuita in senescenza cellulare e organismal invecchiamento 7, 8, 9, 10. Nel campo della ricerca di invecchiamento, l'attenzione è rivolta principalmente sulla rimozione di proteine ossidate dove il proteasoma svolge un ruolo chiave, e non vi è alcuna prova conclusiva che precede ubiquitinazione proteina degradazione in questo caso 2. Lavoro precedente ha dimostrato che l'uso di GFP con un mutato porzione uncleavable ubiquitina è adatto per studiare il complesso processo di protein degradazione 16. Questo costrutto GFP-dà la possibilità di monitorare l'attività del proteasoma senza l'influenza potenziale per la sua attività con disturbi del macchinario ubiquitina.
In questo lavoro, abbiamo utilizzato un degron-destabilizzato GFP a base di proteina reporter (GFP-dgn) per monitorare ubiquitina-proteasoma attività nel vivere fibroblasti diploidi umane. Per avere una panoramica della efficienza di trasfezione, la funzionalità e la trascrizione / traduzione livelli della GFP-DGN reporter, diversi controlli appropriati sono stati inclusi. Abbiamo usato i giovani non trattati GFP-dgn fibroblasti transfettate per dimostrare che non vi è quasi alcuna funzione verde fluorescenza visibile e proteasoma non è influenzato. Per convalidare, che il segnale aumenta con l'inibizione del proteasoma, abbiamo trattato GFP-dgn fibroblasti trasfettati con un inibitore di proteasoma di vedere l'accumulo di GPF dopo inibizione. Come un terzo controllo abbiamo utilizzato GFP-dgnFS. Con questo costrutto possiamo dimostrare la overaefficienza di trasfezione ll che può differire da ceppo a ceppo cella cella e con tutti i tre controlli abbiamo una panoramica del tasso sintesi dei costrutti all'interno della cellula.
Il metodo qui presentato permette di misurare facilmente e rapidamente l'ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi. Una sovraespressione stabile del substrato reporter GFP può essere realizzato con tecniche diverse 17. In questa pubblicazione, la trasfezione del cDNA GFP-dgn nelle cellule è ottenuta lentivirale sistema che fornisce una espressione stabile. Inoltre, l'uso di questo sistema consente un'elevata efficienza di transfezione indipendenti dal tipo cellulare, condizione metabolica cellulare o età del donatore 7. Abbiamo usato con successo questo protocollo per introdurre DNA alle cellule endoteliali in cui altri metodi di trasfezione falliti 18. Tuttavia, gli esperimenti precedenti hanno mostrato che le cellule che sono più espanse in coltura visualizzare una fluorescenza inferioresegnale di cellule trasfettate appena possibilmente a causa della pressione di selezione più.
La precipitazione con PEG viene utilizzato per aumentare il titolo delle unità di trasformazione per ml (U / ml). Se i titoli sono raggiunti buoni (più del 5 × 10 5 TU / ml), la precipitazione con PEG può essere omesso. Un passo importante durante la PEG precipitazione è quello di evitare la sospensione vigoroso o pipettare che genera bolle d'aria. Può inattivare le particelle virali e ridurre significativamente l'efficienza di trasfezione.
Quando si utilizza inibitori del proteasoma a priori gli esperimenti devono essere eseguiti. La concentrazione finale utilizzato e il tempo di incubazione è di tipo cella dipendente e devono essere determinati sperimentalmente. Precedenti osservazioni sulla HFF-2 cellule ha rivelato che l'incubazione con 3h LLNL non deve essere superata per 1) gli effetti tossici del inibitore 2) segnale GFP troppo elevata che può essere raggiunto, o 3) effetti collaterali del proteosoma più oltre timposta periodi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da: National Research Network on Aging (NFN S93) dalla Science Foundation austriaco (FWF), Commissione europea integrata Progetti MIMAGE e PROTEOMAGE, Netherlands Genomics Initiative / Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NGI / NWO, 05040202 e 050 - 060-810 LPN), finanziato dall'UE, Rete di eccellenza Durata (6 ° PQ 036894), e il Programma Innovation Research Oriented sulla genomica (SenterNovem, IGE01014 e IGE5007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
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