Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

Published: November 10, 2012 doi: 10.3791/3327

Summary

생활 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.

Abstract

Proteasome은 이상, misfolded, 손상되었거나 산화 단백질 1, 2의 proteolytic 저하에 관련된 주요 세포 세포 기관입니다. proteasome 활동의 유지 보수는 세포의 스트레스 반응 3, 세포주기 조절과 세포 분화 4 면역 체계의 반응 5와 같은 많은 주요 세포 프로세스에 연루되었습니다. ubiquitin proteasome - 시스템의 장애는 종양 및 neurodegenerative 질병 4, 6의 개발에 관한되었습니다. 또한, proteasome 활동에 감소는 세포 노화 및 노화 organismal 7, 8, 9, 10의 기능으로 발견되었다. 여기, 우리는 GFP-dgn 융합 단백질을 사용하여 생활 세포에 ubiquitin-proteasome 활동을 측정하는 방법을 제시한다. 기본 세포를 생활에 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 있도록, 보완 DNA는 (녹색 형광 단백질 (GFP) dgn 융합 단백질에 대한 코딩 구성합니다 GFP-dgn, 불안정)과 frameshift 변이 (GFP-dgnFS, 안정적 11) 운반 변종 lentiviral 표현 벡터에 삽입되어 있습니다. 이 셀 형식이나 기증자의 나이와 무관 한 매우 높은 transfection 효율을 보장하기 때문에 우리는 기존의 transfection 기술을 통해이 기술을 선호합니다. GFP-dgnFS (안정적) 단백질과 proteasome 억제제의 부재 또는 존재의 불안정 단백질 (GFP-dgn)에 의해 표시되는 형광의 차이점은 각 특정 세포 변형에 ubiquitin-proteasome 활동을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 epifluorescence 현미경에 의해 모니터링 될 수 있거나 유동 세포 계측법에 의해 측정 할 수 있습니다.

Protocol

1. 플라스미드 건설

  1. 주문 맞춤 oligo-세포핵의 dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) 및 dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE)에 대한 인코딩 및 dgn / dgnFS (그림 1)과 함께 GFP의 융합을 얻기 위해 pEGFP-C1 벡터로를 ligate.
  2. pENTR 방향 TOPO의 복제 키트의 프로토콜과 pLenti6/V5 방향 TOPO 복제 키트 (그림 6)를 계속에 따라 PCR에 의해 GFP-dgn과 GFP-dgnFS의 코딩 순서를 증폭.

2. 바이러스 제작

  1. 그들은 transfection의 날에 90~95%의 합류 될 수 있도록 T75 플라스크에 HEK 293FT 세포에서 transfection 전날 (1 일) 씨.
  2. transfection의 날 혈청과 15 ML 매의 항생제없이 DMEM의 1.5 ML에 lipofectamine 2,000 시약 36 μl를 희석. 또 다른 15 ML 매를 사용하여 두 GFP에 대한 보완 DNA가 구축 들고 3 μg pLenti6/V5을 희석 - dgn 또는 GFP-dgnFS, 혈청과 항생제가없는 DMEM의 1.5 ML의 2.5 μg 봉투 인코딩 플라스미드 pMD2.G와 7.5 μg 벡터 백본 psPAX2. 5 분 후에 희석 된 DNA가 희석 lipofectamine 2,000 시약과 결합되어 있습니다.
  3. 양식에 DNA-lipofectamine 단지를 허용하도록 실온에서 20 분의 혼합물을 품다.
  4. HEK 293FT 세포의 매체를 제거 중 7 ML (항생제 제외)으로 조심스럽게 교체하고 혼합에 대한 술병과 앞뒤로 바위를 (2 일)에 DNA-lipofectamine 혼합물을 추가합니다. humidified 5% CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 술병을 품다.
  5. 중간 다음 날 (; 3 일 항생제없이 10 ML 매체) 변경합니다.
  6. 48 시간 후 (5 일) 수확 표면에 뜨는, 룸 온도에서 5 분 300 XG에서 원심 분리기와 0.45 μm PVDF 필터를 통해 표면에 뜨는을 필터링합니다.

문화 매체 - DMEM (HEK 293FT)

십t "> DMEM
10% FBS
0.1 MM 가상 NEAA
6 MM L-글루타민
1 ㎜의 가상 나트륨 Pyruvate
1퍼센트 펜 - 패 혈성 (선택 사항)
500 μg / ML Geneticin (선택 사항)

3. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 강수량의 바이러스 농도

  1. 4의 표면에 뜨는과 2 시간에 품다 ° C. 네 개의 볼륨, 하나의 볼륨 폴리에틸렌 글리콜 솔루션을 (PEG 50 ㎜의 폴리에틸렌 글리콜, 41 MM NaCl, 압력솥, 산도 = 7.2)를 추가 조심스럽게 그것을 반전으로 모든 20-30 분 섞는다.
  2. 4 ° C.에 30 분에 1,500 XG에 스핀 다운 흰색 펠렛이 표시됩니다.
  3. 표면에 뜨는을 대기음, 4 ° C.에서 5 분 1500 XG에서 다시 원심 분리기 나머지 PEG 솔루션을 기음.
  4. 중간하거나 펠렛을 Resuspend 인산염 버퍼 생리 (PBS)를 pipetting 아래에서 20 명 정도로 30 초 힘차게 소용돌이에 의해. 가이드 라인은 한 T75 술병과 나누어지는 그 100 μl에 500 μl를 사용하여 있습니다. -80에서 바이러스를 저장 ° C.

  1. 5 아웃 씨 × 6 잘 판 transfection 전날의 각 잘에 10 4 U2-OS 세포.
  2. transfection의 날 문화 매체를 제거하고 DMEM 8 μg / ML polybrene (hexadimethrine 브롬화)를 포함하는 1 ML하여 교체하십시오. 농축 바이러스에게 표면에 뜨는 1시 10분과 1:100을 희석 잘 하나에 각각 1 μl를 추가합니다. 높은 바이러스 농도는 1 μl, 5 μl하고 나머지 우물에 집중 바이러스 표면에 뜨는 10 μl를 사용합니다. 하나는 잘 긍정적 인 제어로 남아 있습니다.
  3. 다음 날 DMEM 2 ML하여 매체를 교체하십시오.
  4. 선택 다음날로 시작합니다. 각도에 10 μg / ML Blasticidin을 적용합니다. 매초마다 하루 항생제 포함하는 매체를 교체하십시오.
  5. 약 6-7일 선택을 시작한 후 untransduced 세포가 죽었어요. 착색은 PBS로 세포를 세 번 씻고 크리스탈 바이올렛 (10 MG / L 크리스탈 바이올렛과 ​​세포를 표지20 % 에탄올)과 상온에서 5-10 분에 품다 인치 기음 크리스탈 바이올렛은 (몇 번 재사용 할 수)와 ddH 2 O와 두 번 우물을 씻어 판을 건조.
  6. 식민지을 계산하고, 1,000 해당 희석 (그림 7)에 곱합니다. 이 절차는 바이러스 / ML의 transfection 단위 (TU)를 계산 할 수 있습니다.

문화 매체 - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6mM L-글루타민
1퍼센트 펜 - 패 혈성

5. 인간 Diploid의 섬유 아세포의 도입 (이 절차는 모든 세포 유형에 대해 사용할 수 있습니다.)

  1. 5 아웃 씨 × 10 4 인간의 diploid의 섬유 아세포 (HDFs) 6 - 잘 접시에 전달 전날.
  2. 한 밀리리터의 총 8 μg / 전달 증강 등의 ML의 polybrene과 함께 두 감염의 다중성을 사용합니다.
  3. 다음 날 중간 변경합니다.
  4. 언제세포가 confluency 시작 10 μg / ML blasticidin로 선택의 70~80% 이용하실 수 있습니다. 선택이 완료되면 (더 이상 untransfected 세포가 죽는 없음) 세포의 확장이 시작 수 있으며, 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다. blasticidin과 만성 선택은 안정적인 세포 라인 overexpressing GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 융합 단백질, proteasome 활동을 측정 할 준비를 생성 할 수 있습니다. 이 절차는 셀 타입의 독립적 인 매우 높은 transfection 효율을 보장합니다.

6. 유동 세포 계측법에 의한 측정

  1. 1 아웃 씨 × 10 5 세포 (GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 중 하나를 들고) 실험 전날.
  2. 제어 세포에게 사전에 3 시간 proteasome 억제제와 측정, 예를 들어 100 μg / ML의 LLnL을 취급합니다.
  3. PBS로 두 번 세척하고 트​​립신의 0.5 ML를 사용하여 세포를 수확. trypsinisation 문화 매체의 4.5 ML을 사용하고 15 ML 팔콘로 셀을 전송 중지합니다.
  4. 스핀 t상온에서 5 분 300 XG에서 그는 세포.
  5. 37, 매체를 대기음 PBS에있는 세포를 resuspend 5 분 300 XG에서 다시 스핀 다운 ° C.
  6. FACS 버퍼 (10 MM의 Hepes, 140 MM NaCl, 2.5 MM CaCl 2, 산도 = 7.4) 400 μl에 resuspend PBS를 대기음 및 FACS 튜브에 세포를 전송합니다.
  7. 유동 세포 계측법에 의해 얼음과 측정 샘플에있는 세포를 유지. 셀은 4 ° C.에 이상 30 분에 저장하지 않아야합니다

7. 대표 결과

GFP-dgn 융합 단백질은 proteasome 따라서 단백질이 즉시 타락을 타겟으로하는 시퀀스를 수행, 그것은 GFP 형광 신호의 감소에 해당합니다. frameshift 돌연변이 (GFP-dgnFS)이 순서의 변형 버전을 들고 proteasome에 의해 저하가 아니라 높은 녹색 형광로 연결됩니다. 이러한 이유로, 젊은 예상 높은 proteasome 활동으로 HDFs하고 GFP-DG와 transducedN 유동 세포 계측법 측정 모두와 epifluorescence (그림 2A와 B, 그림 3)의 낮은 (6 % 긍정적 인 세포) 형광 신호를 보여줍니다. 같은 HDFs 긍정적 인 세포의 39.7 %를 표시 GFP-dgnFS와 transduced. proteasome 억제제를 LLnL (N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal)과 세포의 치료, GFP-dgn과 GFP-dgnFS 세포 (그림 2A와 B 모두에서 62.9 %의 최대 신호를 제기 ).

고령자 인간의 피부 샘플에 proteasome 활동에 가능한 감소를 확인하려면, 젊은 중년 및 이전 기증자로부터 격리 피부 섬유 아세포는 GFP-dgn과 GFP-dgnFS 감염된 위의 설명 및 유동에 의한 분석을하기 전에 동일한 통로 번호로 재배 세포 계측법. 이 실험에서, 젊은 사람들 사이 GFP 신호의 분명한 증가 (11.2 ± 0.88 % GFP 양성 세포)와 중년이 기증자는 (20.4 ± 2.27 % GFP 양성 세포, P = 0.003)을 나타내는, 관찰되었습니다 프로 티어 식물 감소노인 기증자 7 (그림 4)에서 얻은 샘플에 ome 활동. proteasome 활동에 더 감소는 오래된 개인 (그림 4)에서 분리 섬유 아세포에서 관찰되지 않았습니다. GFP-dgnFS에 대한 형광 강도는 모든 경우에 있었어요 ~ 90 % (데이터가 게재되지 않음) 세 가지 다른 연령 그룹에 대한 높은 transfection 효율을 나타냅니다된다.

그림 1
1 그림. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 순서. 표시는 GFP (녹색) pEGFP-CL1 벡터 (회색)과 dgn / dgnFS 순서 (빨간색)의 여러 복제 사이트의 3' 엔드입니다.

그림 2
그림 2. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 인간의 diploid의 섬유 아세포의 유동 세포 계측법 분석. A. 젊은 사람의 포피의 섬유 아세포 (HFF-2)은 녹색 형광 단백질을 운반 lentiviral 벡터에 감염되었다 (GFP) dgn 유전자 또는 GFP-dgnFS (frameshift)는 등의 표시 및 유동 세포 계측법을 (FACS 캔토 II, Becton 디킨슨)를 사용하여 GFP 형광에 대한 분석 구성합니다. 표시 할 경우, 세포는 proteasome 억제제 N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLnL)로 3h 치료를했다. 감염되지 않은 세포는 제어로 사용되었습니다. 실험은 triplicates에서 수행되었다. B. 데이터 세 독립적 인 실험을 대표합니다. 번호는 GFP 양성 세포의 양을 반영합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. GFP-dgn과 GFP-dgnFS HFF-2 세포의 형광 현미경 분석. HFF-2 영은 그림 2에서와 같이 취급되었다. 감염 후 구일에서 셀은 V 있었다형광과 위상 대비 현미경으로 isualized.

그림 4
4 그림. 인간의 피부 노화에 proteasome 활동의 변화. 지정된 연령 그룹의 9 개 다른 기증자로부터 인간의 포피의 섬유 아세포는 최소한 확장과 GFP-dgn에 대한 코딩 lentiviral 구조에 감염되었습니다. 감염 후 구일에서, 셀 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 중복의 연령 그룹 당 3 샘플 (± SE)에 취득했다.

그림 5
그림 5. 실험 방법은. dgn와 dgnFS에 대한 사용자 정의 - oligo 세포핵은 pEGFP-C1 벡터로 복제되어 바이러스는 HEK 293FT 세포를 사용하여 각 구조에 대한 생산됩니다. 바이러스의 titer가 결정된다. 세포는 바이러스에 transduced 및 확장하고 있습니다. 선호 치료 후 세포 분석유동 세포 계측법에 의한 형광 신호.

그림 6
6 그림. pLenti GFP-dgn의지도는. GFP-dgn 시퀀스를 포함하여 pLenti6/V5-DEST 벡터의지도가 표시됩니다. 약어 : PCMV (CMV 프로모터), GFP-dgn (GFP-dgn의 순서), P SV40 (SV40 초기 발기인), EM7 (EM7 발기인), Blasticidin (Blasticidin 저항 유전자), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR로 삭제 U3 지역), SV40 PA (SV40 polyadenylation 신호), 암피실린 (암피실린 저항 유전자), pUC 오라 (pUC 원본), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR 하이브리드 발기인), Ψ (HIV-1 Ψ 포장 신호 ), RRE (HIV-1 수익 응답 요소).

그림 7
그림 7. U2-OS의 titering 판. U2-OS는 6 잘 판에 나가 놓는하고 다른 바이러스 농도 (1백분의 1과 1 / 10의 희석, 1, 5 및 공동 10 μl와 transfected되었습니다) 바이러스 표면에 뜨는을 ncentrated. 하나는 잘 untransfected 제어 (NT)로 사용되었다. 6-7일 후, 전지 크리스탈 바이올렛, 공기 건조 물들했다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ubiquitin proteasome - 활동 기자 기판으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 첫 번째 출판 2000 12 년에 출판되었다. 그 후, GFP 세포 활동, 특히 ubiquitin-proteasome 프로세스를 시각화 할 수있는 일반적인 도구가되었습니다. 생체 내 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 GFP 기반 기자와 유전자 변형 마우스 모델은 13 도입되었습니다. 생체 연구에 추가이 간행물 14에서 사용하는 비슷한 degron-불안정 GFP 기자와 다른 유전자 변형 마우스 모델을 만들었습니다.

불행하게도, 기자 등 GFP는 Dantuma 외에 의해 게재 된 일부 결함이 있습니다.와 보먼 외. 12,15. 첫째, 불안정 GFP 인해 알 수없는 이유로 proteasome의 억제없이 누적 될 수 있습니다. ubiquitin proteasome - 기계는 해당 기능을 여러 단계에 따라 달라집니다 시스템, 광고이기 때문에열화하기 전에 isturbance는 기자 기판과 거짓 - 긍정적 인 효과와 12 결과의 축적 될 수 있습니다. 둘째, GFP 기반 기자 기판은 전사 및 번역의 변화에​​ 민감 절반 - 생활의 짧은으로 인해 수 있습니다. GFP 형광의 모든 변화는 따라서 감소 또는 증가 합성 및 번역 15의 결과가 될 수 있습니다. 이러한 문제는 다음과 같은 GFP의 수정 사항에 의해 다른 연구에서 해결되었습니다 :

Proteasome 활동은 세포의 노화 및 노화 organismal 7, 8, 9, 10에 감소 될 수있는 것으로 확인되었습니다. 연구를 노화의 분야에서 초점은 주로 proteasome에 중요한 역할을 산화 단백질의 제거에 있으며, 단백질 ubiquitylation이 경우 2 저하를 앞에 있다는 결정적인 증거는 없습니다. 이전 작업은 또한 변이 uncleavable ubiquitin 잔기와 GFP의 사용 P의 복잡한 과정을 공부하기에 적합한 것으로 판명rotein 저하 16. 이 GFP-구조는 ubiquitin 기계에 장애를 통해 그 활동의 가능성 영향없이 proteasome 활동을 모니터링 할 수있는 가능성을 제공합니다.

이 작품에서 우리는 인간의 diploid의 섬유 아세포 생활에 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 degron-불안정 GFP 기반 기자 단백질을 (GFP-dgn)를 사용. transfection 효율, 기능과 GFP-dgn 기자의 전사 / 번역 수준의 개요를하려면, 몇 가지 적절한 컨트롤이 포함되었습니다. 우리는 거의 녹색 형광 표시와 proteasome 기능이 영향을받지는없는 것으로 보여 젊은 치료 GFP-dgn transfected 섬유 아세포를 사용했습니다. proteasome의 억제와 신호 증가, 우리는 억제 후 GPF의 축적을 볼 수 proteasome 억제제 GFP-dgn transfected 섬유 아세포를 치료하는, 유효성을 검사합니다. 삼분의 일 제어로 우리는 GFP-dgnFS를 사용했습니다. 이 구조를 통해 우리는 overa에게 표시 할 수 있습니다세포 변형의 세포 변형과 우리가 세포 내 구조의 합성 속도 이상에 대한 개요를 세 가지 컨트롤 다를 수 있습니다 붙인다 transfection 효율.

여기에 제시된 방법은 사용자가 쉽고 빠르게 살아있는 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 측정 할 수 있습니다. GFP의 기자 기판의 안정적인 overexpression은 서로 다른 기술을 17 달성 될 수있다. 본 자료에서 세포에 GFP-dgn cDNA의 transfection은 안정적인 표현을 제공합니다 lentiviral 시스템에 의해 달성된다. 또한,이 시스템의 사용은 세포 유형, 세포 신진 대사 상태 또는 기증자의 연령 7 독립 높은 transfection 효율을 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 transfection의 다른 방법 18 실패하는 내피 세포에 DNA를 도입하려면이 프로토콜을 사용했습니다. 그럼에도 불구하고, 이전 실험 문화에 더 이상 확장되는 세포가 낮은 형광을 표시했다더 이상 선택의 압력으로 인해 갓 transfected 세포보다 신호.

PEG 침전은 ML (TU / ML) 당 변환 단위의 titer를 증가하는 데 사용됩니다. 좋은 titers는 (5 × 10 5 TU / ML 이상)에 도달하는 경우, PEG 침전 생략 할 수 있습니다. PEG 강수량 중 중요한 단계는 활발한 일시 중단 또는 공기 거품을 생성하는 pipetting을 방지하는 것입니다. 이 바이러스 입자를 비활성화하고 크게 transfection 효율을 줄일 수 있습니다.

proteasome 억제제를 사용하는 경우 사전 실험이 수행해야합니다. 최종 농도를 사용하고 부화 시간은 세포 유형에 의존하고 실험적 결정해야합니다. HFF-2 세포에서 이전 관측 LLnL과 3h의 부화는 더 이상 팀을 통해 proteasome 억제의 부작용)이 때문에 1의 독성 도달 할 수 너무 높은 GFP 신호 억제제를 2 효과), 또는 3)를 초과하지 않아야 공개전자 기간.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는이 지원되었습니다 오스트리아 과학 재단 (FWF), 유럽위원회 (European Commission) 통합 프로젝트 MiMAGE과 PROTEOMAGE, 네덜란드 이​​니셔티브 유전체학에 의한 노화 (NFN S93)에서 국립 연구 네트워크 / 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (NGI / NWO, 05040202과 050 - 060-810 NCHA), 유럽 연합 (EU)은 우수 수명 (FP6 036894)의 네트워크를 재정 지원하고, 유전체학에 대한 혁신 지향 연구 프로그램 (SenterNovem, IGE01014 및 IGE5007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 Vector BD Bioscience Clontech 6084-1
pENTR Directional TOPO Cloning Kit Invitrogen K2400-20
pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit Invitrogen V496-10
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668019
DMEM Sigma-Aldrich D5546
PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) Carl Roth Gmbh P667.1
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P2139
NaCl Merck & Co., Inc. 1.06404.1000
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) Invitrogen 14190
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 10,768-9
Blasticidin Invitrogen R21001
Crystal violet Sigma-Aldrich C3886
FACS tubes BD Biosciences
Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) Invitrogen 15140130
L-glutamine 200 mM Invitrogen 25030024
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom AG S0115
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x Invitrogen 11140035
MEM Sodium Pyruvate 100 mM Invitrogen 11360039
D-(+)-Glucose (45%) Sigma-Aldrich G8769
Geneticin Invitrogen 11811023
CaCl2 Merck & Co., Inc. C5080
Hepes Sigma-Aldrich H3375
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
  2. Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
  3. Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
  4. Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
  5. Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
  6. Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
  7. Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
  8. Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
  9. Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
  10. Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
  11. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  12. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  13. Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
  14. Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
  15. Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
  16. Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
  17. Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
  18. Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).

Tags

세포 생물학 문제 69 분자 생물학 의학 생명 공학 바이러스학 proteasome 활동 lentiviral 입자 GFP-dgn GFP-dgnFS GFP 인간 diploid의 섬유 아세포 유동 세포 계측법 플라스미드 벡터
살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greussing, R., Unterluggauer, H.,More

Greussing, R., Unterluggauer, H., Koziel, R., Maier, A. B., Jansen-Dürr, P. Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein. J. Vis. Exp. (69), e3327, doi:10.3791/3327 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter