Summary
Den
Abstract
Med fremskridt inden for genomforskning af det seneste årti, har Plantebiologi set talrige undersøgelser præsentere store kvantitative analyser af genekspression. Microarray og næste generation sekventering metoder bliver brugt til at undersøge udviklingsmæssige, fysiologiske og stress respons processer, dissekere epigenetisk og små RNA veje, og bygge store gen-regulatoriske netværk 1-3. Mens disse teknikker lette den samtidige analyse af store gen sæt, de typisk give en meget begrænset Spatiotemporal opløsning af genekspression ændringer. Denne begrænsning kan delvist løses ved hjælp af enten profilering metode sammen med lasermicrodissection eller fluorescens-aktiveret celle sortering 4-7. Men for fuldt ud at forstå den biologiske rolle af et gen, viden om dens Spatiotemporal mønster af udtryk på et cellulært opløsning er afgørende. Især, når man undersøger udvikling eller til effekterne af miljøbetinget stiMuli og mutanter kan den detaljerede analyse af et gen er udtryk mønster bliver afgørende. For eksempel kan subtile kvantitative forskelle i udtrykket niveauer af vigtige regulerende gener fører til dramatiske fænotyper, når der er forbundet med tab eller gevinst på udtryk i bestemte celletyper.
Flere metoder anvendes rutinemæssigt til den detaljerede gennemgang af genekspression mønstre. Den ene er gennem analyser af transgene reporter linjer. En sådan analyse kan imidlertid blive tidskrævende, når man analyserer flere gener eller arbejder i planter genstridige til transformation. Desuden er en uafhængig validering, til at sikre, at transgenet udtryk mønster efterligner, at af de endogene genet typisk kræves. Immunhistokemisk protein lokalisering eller mRNA in situ hybridisering nuværende relativt hurtigt alternativer til direkte visualisering af genekspression i celler og væv. Sidstnævnte har den klare fordel, at det kan være let used på ethvert gen af interesse. In-situ hybridisering tillader detektering af target mRNA i celler ved hybridisering med mærkede anti-sense RNA sonde opnås ved in vitro-transskription af genet af interesse.
Her har vi skitsere en protokol for in situ lokalisering af genekspression i planter, der er yderst følsom og specifik. Det er optimeret til brug med paraformaldehyd, paraffinindstøbte vævssnit, som giver fremragende bevarelse af histologi, og DIG-mærkede prober, der er visualiseret af immuno-afsløring og alkaliske fosfatase kolorimetriske reaktion. Denne protokol er blevet anvendt med succes på en række væv fra en bred vifte af plantearter, og kan bruges til at analysere udtryk for mRNA såvel som små RNA 8-14.
Protocol
1. Prøveforberedelse
Bemærk: Alle trin op til og med hybridisering skridt er følsomme over for RNAse aktivitet. Det er derfor vigtigt at arbejde i rene forhold. Det er også ret almindeligt at gøre alle løsninger RNase-fri ved hjælp DEPC-behandlet vand og glasvarer bages ved 180 ° C i mindst 3 timer. Plastbeholdere er ofte renses ved hjælp af behandling med 0,2 N NaOH i 30 min. Men ingen af disse forholdsregler er vigtige, og vi bruger typisk regelmæssigt rengøre milliQ H 2 O for alle løsninger. Vi gør føre separate reagenser, dåser og glas til in situ hybridizations og gemme disse i et rent kabinet.
- Prøve fiksering
- Dag 1: Forbered frisk 4% paraformaldehyd (PFA) fiksativ. For 500 ml, varme 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH7.0) til 60 ° C og opløse to pellets af NaOH. I et stinkskab tilsættes 20 g paraformaldehyde og bland grundigt indtil den er opløst. Placer løsning på isen, og når afkølet justere pH til 7,2 med H 2 SO 4 (1-2 dråber i 100 ml). Derefter justere lydstyrken til 500 mL med 1x PBS.
Bemærk: Brug ikke HCl for at justere pH-værdien, da dette vil frigøre meget giftige dampe. Paraformaldehyd er giftigt; denne løsning bør derfor være forberedt i et stinkskab og bortskaffes korrekt. Også, Paraformaldehyd opbevares ved 4 ° C og bør købes nyt hver 6 - 9 måneder. - Harvest vævsprøver og læg dem straks i 15 ml frisk PFA fiksativ på is i glas scintillationsglas. Hvis væv dissektion er påkrævet, at dette bedst gøres på is i kolde fiksativ.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge et stort overskud af fiksativ. Den almindelige anbefalede forhold er at bruge 10-diskenheder af fiksativ til 1 volumen af væv. - Påfør et vakuum (~ 500 mm Hg) til prøverne, mens på is. Hold et vakuum i 15-20 minutter, små bobler bør frigive fra prøvens men fiksativ bør ikke komme i kog. Slip vakuum langsomt, og forny PFA fixativ for at sikre fiksativet forbliver på den rigtige koncentration. Gentag dette trin, indtil væv vasken efter frigivelsen af vakuum.
Bemærk: Fiksering er forpligtet til at fastsætte og cross-link RNA-molekyler i vævet. Dette trin er kritisk så dårligt faste materialer giver et lavt signal. Nogle væv ikke synke det samme, men de fleste vil efterhånden synke natten over. For at forbedre infiltration af fiksativ, kan følgende rengøringsmidler tilføjes: Triton op til 0,1% og / eller Tween op til 0,1 - 0,3%. Alternativt ethanol-baseret fikseringsmidler, som formaldehyd-alkohol-sure syre (FAA), kan bruges til væv, som der ellers ikke let infiltreret 14,15. - Udskift PFA fiksativ igen og holde glassene ved 4 ° C natten over.
- Dag 1: Forbered frisk 4% paraformaldehyd (PFA) fiksativ. For 500 ml, varme 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH7.0) til 60 ° C og opløse to pellets af NaOH. I et stinkskab tilsættes 20 g paraformaldehyde og bland grundigt indtil den er opløst. Placer løsning på isen, og når afkølet justere pH til 7,2 med H 2 SO 4 (1-2 dråber i 100 ml). Derefter justere lydstyrken til 500 mL med 1x PBS.
- Tissue indlejring
- Dag 2: Pre-cool 1x PBS og ethanol-serien ved 4 ° C.
- Skyl prøver TWIce i 30 min hver i 1x PBS, på is.
Bemærk: Igen er det anbefales at bruge et stort overskud af hver løsning. - Dehydreres prøverne ved at tage dem gennem en ethanol-serien, på is, som følger:
- 10% ethanol 30 min,
- 30% ethanol 30 min,
- 50% ethanol 1 time,
- 70% ethanol 1 time,
- 85% ethanol 1 time,
- 95% ethanol en time,
- 3 Ændringer på 100% ethanol i en time hver
- I slutningen af dagen, erstatte ethanol med 0,1% Eosine i 100% ethanol natten over ved 4 ° C. Eosine pletter cellevæggen gøre prøverne mere synlige under indlejring og sektionering.
Bemærkninger: Alle tidspunkter er angivet her, er blevet optimeret til blokke af 3x3x3 mm, men længere inkubationer kan være nødvendig for større prøver.
Prøver kan opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C i flere måneder. Dag 3: Den følgende morgen, varme prøverne til stuetemperatur i en time. Så erstatte ethanol gradvist med histoclear som følger:
- I slutningen af dagen, tilsættes 1 / 4 volumen Paraplast Plus chips og sted hætteglasset i en 60 ° C ovn. Også fylde et bæger med Paraplast chips og genopbygge dette ofte for altid at have frisk smeltet voks ved hånden.
Bemærk: Temperaturen i ovnen er vigtig og langvarig opvarmning af Paraplast over 60 ° C bør undgås. - Dag 4: Gradvis erstatte histoclear med Paraplast ved jævnligt at tilføje mere paraffin chips (hver time). I slutningen af dagen, hæld forsigtigt fra histoclear / voks blandingen og straks erstatte det med ren smeltet voks. Lad prøverne ved 60 ° C natten over.
- Dag 5 og 6: Skift Paraplast 3 gange dagligt, ca hver 4 timer, med frisk smeltet voks holde seksempler ved 60 ° C.
Bemærk: Det er muligt at ændre voks kun en gang om dagen, men det væv forberedelse ville tage et par ekstra dage til at fuldføre, som voks skal skiftes mindst 5 eller 6 gange. Vacuum infiltration af vævsprøver, når disse er i 100% EtOH og / eller i voks kan yderligere forbedre infiltration og forankring af væv. Vacuum infiltration af prøver i voks bør ske ved 60 ° C. - Dag 7: Skift voks en gang mere. Lugten af histoclear bør nu være forsvundet helt, og prøverne kan indlejres senere samme dag.
- Opsæt en stor opvarmning plade ved 60 ° C beskyttet af aluminiumsfolie.
- Metoden med at inkorporere vil variere afhængigt af den type væv, der skal analyseres. Det vigtigste punkt på dette trin er at sikre, at prøverne er orienteret korrekt for sektionering senere. En måde er at bruge plastik forme og ringe. Varm op i forme på varmepladen og hæld smeltet voks i den nederste del af formen. Overføren vævsprøve i formen med varmede pincet og orientere den i den ønskede position. Placer den hvide ring på formen og tilføje yderligere smeltet voks sådan at væv er dækket helt. Forsigtigt flytte formen fra pladen til bænken. Lad voks køle gradvist.
En anden mulighed er at fordele alle de prøver i en petriskål, som indeholder smeltet voks (prøverne skal være helt dækket af voks), mens du arbejder på 60 ° C opvarmet plade. Orientere prøverne med varme pincet. I slutningen, skal du slukke pladen. Når voks er stivnet, kan petriskålen blive flyttet til bænken, og derefter opbevares ved 4 ° C. Når du er klar til sektionering, kan små blokke, der indeholder en vævsprøve være skåret ud af petriskålen med en opvarmet kniv og monteret på en microtome prøveholder med en ekstra dråbe smeltet voks. Lad prøven hærde i et par minutter før udskæring.
Bemærk: Blocks kanopbevares ved 4 ° C i 1 år eller længere. For yderligere nyttige tips om væv fiksering og indstøbning, se ref. 16
2. Probe forberedelse
- Kloning
Sonder er normalt genereret til en eller flere bestemte områder af genet af interesse. Meget repetitive sekvenser bør udelukkes fra sonden, men sekvenser svarende til bevares protein domæner, såsom DNA-bindende motiver i transskription faktorer, der typisk vil give genet særligt udtryk mønstre 8,9,12,15 (fig. 1). Dette fordi RNAse En behandling i post-hybridisering trin (se nedenfor) reducerer niveauet af sonden på tværs af hybridisering mellem geners familiemedlemmer. RNAse En spalter på uoverensstemmelser i RNA rækkehuse, fragmentering sonder hybridiseret til udskrifter med ufuldkommen komplementaritet, som vil blive vasket ud i de efterfølgende trin.
Generelt kan flere sonder skal testes for hvert gen af interesse. Sonder kan være så kort som 150 baser i længden. Although er der ingen grænse for længden af sonden, fragmenter kortere end 1,5 kb typisk transskribere bedre. DNA-fragmenter, der skal omskrives, er klonet til en vektor indeholdende T3, T7 eller SP6 initiativtagere (f.eks pCRII-TOPO, Invitrogen). Alternativt, kan T3, T7 eller SP6 promotor sekvenser indgå som en 5'-hale på bagsiden primer, der anvendes til forstærkning sonden regionen.
I hver in situ hybridisering eksperiment, inkluderer vi en positiv kontrol sonde, som hybridisering mønster er kendt, og som arbejder konsekvent, samt en negativ kontrol (Figur 1D og H). Sidstnævnte kunne være en tilfældig RNA sonde, der vides ikke at hybridisere til nogen udskrifter i vævet af interesse. Selv om det er almindeligt at bruge den forstand sonden af genet, der analyseres, er dette ikke nødvendigt, og enhver ikke-hybridizing RNA vil passe til formålet. Hvis det er muligt, ville væv fra en transskriptionel null allel af genet af interesse tjene som en fremragende negativ kontrol. - Linearisere plasmidet ved at omsætte cirka 5 mg DNA med en begrænsning enzym, der fordøjer i slutningen af indsatsens modsatte stedet for projektlederen. Brug ikke restriktionsenzymer, der efterlader et 3'-overhæng. Dette kan føre til transskription artefakter, fordi polymerase kan udnytte 3 'udhæng som underlag for at fortsætte transskription. Alternativt kan sonden regionen, herunder T3, T7 eller SP6 promotor forstærkes ved PCR til at generere DNA-skabelon til in vitro-transskription reaktion.
- Check en alikvot på en gel til at kontrollere, at reaktionen er gået til afslutning.
- Uddrag af DNA med fenol / kloroform, udfældes med ethanol og resuspender DNA-pellet i milliQ H 2 O til en koncentration på 1μg/μl. Alternativt kan DNA renses ved hjælp af standard DNA oprensning kolonner.
- Opsætning af in vitro-transskription reaktion ved at blande:
- 1μl purified DNA (1μg/μl)
- 2μl 10x transskription buffer
- 2 μL 10x DIG RNA mærkning mix
- 1μl RNAse OUT
- 2μl T3, T7 eller SP6 RNA polymerase (20 U / mikroliter)
- H 2 O op til 20μl.
Inkuber ved 37 ° C i 1 til 2 timer. Hold 1μl at analysere på en gel senere.
Bemærk: fluorescens-mærkede prober foretrækkes i dyre systemer, men på grund af den høje auto-fluorescens af de fleste plantevæv, in situ hybridisering protokoller for planter bruger radioaktivt mærkede prober 17 eller mere almindeligt DIG-mærkede prober, der registreres af immunhistokemi. - Fjern DNA-skabelonen ved at tilsætte 75 μL MilliQ H 2 O og 5 mikroliter RQ1 DNAse (1 U / mikroliter) til transskription reaktion og inkubere reaktionen ved 37 ° C i 10 min.
- Rense in vitro-transskription reaktion at fjerne ikke-inkorporeret nukleotider og mindre udskrifter. Et muBILITET er at bruge en størrelse-udelukkelse Sephadex ® kolonne, såsom mini Quick Spin RNA Kolonner (Roche). Alternativt kan transskription reaktionen blive renset ved en konventionel LiCl / ethanol nedbør (se ref. 14). Hold 1μl at kontrollere, om en gel senere.
- Sonder over 250 baser i længden er sædvanligvis delvis hydrolyseret at få RNA molekyler af cirka 150 nt og derfor lille nok til effektivt at trænge ind i vævssnit. Tilføj en tilsvarende mængde 2x karbonat buffer (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na 2 CO 3) til de rensede transskription reaktion og inkuberes ved 60 ° C. Inkubationstiden bør beregnes efter følgende formel:
tid = (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
hvor Li = indledende probe længde (i KB) Lf = endelige probe længde (0,150 kb); K = 0,11 kb / minut. Hold 2 mikroliter med check på en gel. - Neutralisere hydrolyse reaktionen ved at tilsætte 1 / 20 volumen på 10% eddikesyre.
- Sonden er så Purificeret ved at tilføje 1μl af tRNA (100mg/ml), 1 / 10 volumen 3M NaAc pH 5,2, plus 2,5 mængder koldt 100% ethanol, og inkubere ved -80 ° C i 30 min. Bundfald RNA ved centrifugering ved 13.500 rpm i 20 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og skyl RNA pellet med 500μl 70% ethanol. Centrifuge igen, lad pillen lufttørre (typisk omkring 15 min), og resuspender RNA i 50μl 50% deioniseret formamid. Sonden skal opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Tjek på en regelmæssig 1% TAE-agarosegel det endelige produkt samt halvfabrikata fra § § 2.2.4, 2.2.6 og 2.2.7 (figur 2A). Dette tillader overvågning af effektiviteten af in vitro transkription reaktion.
Note: In vitro transkription reaktion bør give ca 1 mg af RNA per 1 mikrogram skabelon. - Dot Blot Analyse
Sonden koncentration og DIG-UTP indarbejdelsen kan vurderes ved at dot blot-analyse (figur 2B). Serial RNA fortyndinger er spottet på en standard krydsning membran ved siden af en mærket kontrol RNA med kendt koncentration. For eksempel bruger vi DIG-UTP mærkede kontrol RNA sonde inkluderet i in vitro-transskription kit (Roche). Det er bedst at teste flere fortyndinger for hvert probe til at etablere en nøjagtig koncentration.- Forbered blokerende buffer ved at opløse 0,5% af Blocking Reagent i 1x TBS buffer (100 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl) ved 70 ° C, så lad opløsningen køle ned til stuetemperatur.
- Spot 1μl af serielle fortyndinger (typisk 10 -1 til 10 -5) af in vitro transskriberede og kontrol sonder på en N + nylon membran. Fastgør RNA ved UV cross-linking.
Bemærk: En minimal overflade af membranen bør anvendes til at reducere mængden af buffere brug senere. - Ekvilibrering membranen i 1x TBS i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) på en ryste-platform.
- Bloker membranen ved hjælp af blokeringbuffer i 30 min ved RT på en ryste-platform.
- Skyl membranen i 1x TBS i 5 min.
- Inkubér membran med anti-DIG antistof, fortynde 1μl af Anti-digoxigenin-AP i 10 ml 1x TBS, i 45 min ved RT.
- Vask membranen to gange i 1x TBS i 15 min hver.
- Ekvilibrering membranen i 1x TN buffer (100mm Tris-HCl pH 9,5, 100mm NaCl) i 5 min.
- Stain membranen ved inkubation med NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) i 1x TN buffer. Farvning kan tage 5-10 min. Bagefter skylles membran med vand, og det kan derefter tørres og opbevares som en rekord.
Bemærk: NBT / BCIP er et substrat for alkalisk fosfatase konjugeret til anti-DIG antistof, der ved hydrolyse giver en mørk blå farve.
3. Sektionering
- Varm blokke til stuetemperatur. Hvis blokkene er for koldt, kan de enkelte sektioner rulle rundt uden at danne en voks 'bånd'. Trim blokken i en trapezoid form forlader omkring 1 mm af voks omkring prøven.
- Varm en stor slide varmere ved 35-37 ° C.
Bemærk: Mange protokoller udføre dette trin på 42 ° C dog reducere temperaturen til 35-37 ° C forhindrer dannelsen af bobler i afsnittene. - Placer blokken på microtome sådan, at den længste af de to parallelle ansigter er i bunden. Forsigtigt bringe blokken frem til bladet, og sørg for, at overfladen af blokken er parallelt med klingen. Sektion i en tykkelse af 8 - 10μm. Voks bånd kan justeres på et ikke-klæbende overflade, såsom aluminiumsfolie eller filtrerpapir, for at vælge dele af interesse. Dette kan vurderes ved hjælp af en nærliggende dissektionsmikroskop.
Bemærk: De eosin farvning af væv giver en indikation, om vævene er korrekt infiltreret i løbet af indlejring. Hvis midten af blokken ikke er plettet med eosin dette normalt indikerer, at vævet dårligt fast. - Mark Probe-on Plus SLIDES med en blyant (de fleste penne eller markører er slettet under in situ hybridisering protokollen) og distribuere 1ml af ren milliQ H 2 O på det. Omhyggeligt flyder dele af renter på overfladen af vandet ved stuetemperatur (det er lettere at manipulere afsnittene på vandet, når du arbejder ved stuetemperatur). Sørg for, at den blanke side (den nederste side som båndet kommer ud af microtome) vender ud mod vandet. Derefter overføre glide langsomt ind på slide varmere. Varme hjælper afsnittene til at sprede på overfladen af vandet. Efter 5 min, hæld vandet forsigtigt, men i én glidende bevægelse, så båndet sænkes ned på diaset. Lad objektglassene tørre i mindst nogle timer eller natten over ved 37 ° C, så vævet klæber.
Bemærk: Sektionsopdelte væv kan opbevares i en kasse med silica tørremiddel i et par dage til uger ved 4 ° C, men det er bedst at bruge slides så hurtigt som muligt.
4. In-situ Hybridization
- § forbehandling
Den mængde, der kræves for hver enkelt løsning vil naturligvis afhænge af antallet af dias, der skal behandles og beholderen, der skal bruges. Sektionerne skal altid være helt oversvømmet. For en 25-slide rack og et pænt fitting container, er 200-250 ml tilstrækkelig. Fordi mange af de inkubationen trin er meget kort, vi normalt forberede alle mulige løsninger først og derefter starte slide forbehandlinger. Dog vil eddikesyreanhydrid løsningen skal klargøres umiddelbart før brug og protease er tilføjet på tidspunktet for brugen. Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Desuden kan alle buffere blive forberedt på 10x koncentrationen som en stamopløsning.- Varm protease buffer (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) i beholderen til 37 ° C.
- Deparaffinize og rehydrere de vævssnit som følger:
- histoclear - 10 min (brug et glas fad)
- histoclear - 10 min (brug englas fad)
- 100% ethanol - 1 min
- 100% ethanol - 30 sek
- 95% ethanol - 30 sek
- 85% ethanol - 30 sek
- 70% ethanol - 30 sek
- 50% ethanol - 30 sek
- 30% ethanol - 30 sek
- 10% ethanol - 30 sek
- milliQ H 2 O - 1 min
- Inkuber i 1x PBS i 2 min.
- Bland 625μl af protease 50mg/ml i 250 ml protease buffer forhaand opvarmes til 37 ° C, og inkuber objektglassene i 20 min ved 37 ° C.
Bemærk: Den protease er forpligtet til at fordøje fast proteiner og øge sonde adgang til cellulære RNA. Det er afgørende at styre tidspunktet for inkubation til at maksimere hybridisering signalet uden opdeling af vævet, og dermed nogle optimering kan være påkrævet for hver vævsprøve. - Neutralisere protease aktivitet i 0,2% glycin i 1x PBS i 2 min.
- Glassene skylles en gang i 1x PBS i 2 min.
- Behandl dias in 4% PFA-løsning i 10 min til re-fix RNA, som kan blive beskadiget af de protease behandling.
- Glassene skylles to gange i 1x PBS i 2 min hver.
- Mens dias er i PBS vasker, udgør 250 ml af 0,1 M triethanolamin løsning, pH 8,0 ved at blande 12,5 ml af 2M triethanolamin (29.8g i 100ml milliQ H 2 O, pH8.0 med HCl) til 236,25 ml milliQ H 2 O i et glas fad. Tilsæt 1,25 ml eddikesyreanhydrid i triethanolamin buffer umiddelbart før sætte dias i, og rør godt. Efter tilføjelse af dias, fortsætte med at røre langsomt i 10 minutter.
Dette kræver, at slide rack er forhøjet i beholderen med triethanolamin / eddikesyreanhydrid. Vi bruger en fastspænding system med stativ.
Bemærk: I dette trin er positivt ladede amino grupper, der kan føre til ikke-specifik binding af sonden acetyleret. Også, eddikesyreanhydrid er giftigt; denne løsning bør derfor være forberedt i et stinkskab og bortskaffes korrekt <./ Li> - Glassene skylles to gange i 1x PBS i 2 min.
- Udtørring af vævssnit igen:
- H 2 O - 1 min
- 10% ethanol - 30 sek
- 30% ethanol - 30 sek
- 50% ethanol - 30 sek
- 70% ethanol - 30 sek
- 85% ethanol - 30 sek
- 95% ethanol - 30 sek
- 100% ethanol - 30 sek
- 100% ethanol - 30 sek
- Hybridisering
- Varm en varmeblok til 85 ° C.
- Forbered hybridisering buffer. For 10 ml, blandes i en Falcon rør 1,25 ml in situ hybridisering salte (3M NaCl, 100mm Tris-HCl pH 8,0, 100mm Na Phosphate pH6.8, 50mM EDTA), 5 ml deioniseret formamid, 2,5 ml 50% dextransulfat, 250 μl 50x Denhardt, 125 μl 100mg/ml tRNA, og 875 μl H 2 O. <br /> Bemærk: dextransulfat er meget tyktflydende, så det er bedst at forvarme løsningen på 60 ° C for at gøre pipettering lettere. Hybridisering buffer kan opbevares ved -20 ° C.
- Forbered forskellige sonder. For hvert dias, bland 1 ml probe med 9 μl milliQ H 2 O og 10 μl deioniseret formamid. Varm sonden ved 85 ° C i 2-3 min, straks chill på is, centrifugeres kort, og tilføj sondens 80μl hybridisering buffer pr dias. Bland godt ved pipettering, men undgå at gøre bobler.
Bemærk: Mængden af sonde, der skal tilføjes per dias skal testes empirisk. Generelt er sonder anvendes i en endelig koncentration på 0,5 ng / kb / mikroliter sonde kompleksitet. Siden hybridizations udføres med 100 μl pr dias, er cirka 25 ng af sonde nødvendige pr slide for sonder, der er 0,5-KB i længden og 50 ng af sonde per dias til sonder, som er 1-KB lang. For enkelhed, ofte forsøger vi 0,5, 1, og 4 μl sonde per dias. - Anbring objektglassene på enren overflade, og lad dem lufttørre fuldstændigt i 5-10 min. Pipette sonden / hybridisering buffer mix på højre kant af dias. Gradvist sænke en dækglas på slide; at sikre, at hybridiseringsopløsning dækker alle dele uden bobler. Tryk på dækglasset let med fingeren, hvor boblerne formular til at fortrænge dem fra alle vævssnit. Træk ikke låget glide, da dette vil beskadige sektioner.
Bemærk: En alternativ metode almindeligt anvendt til dette skridt er at udarbejde "sandwich" af to dias, der inkuberes med samme sonde. For yderligere oplysninger om denne metode, se ref. 14. - Forbered en luftfugtighed kammer i en fuldstændig flad plastboks. Dæk bunden af kassen med Whatman papir fugtet med milliQ vand, dækkede papir med parafilm forlader hjørnerne afdækket, placer objektglassene i plast kasse og forsegle kassen tæt.
- Inkuber slides på det ønskede hybridisering temperatur, typisk 50 - 55 ° C, Feller 16-20 timer.
- Til brug næste morgen, forberede 1 liter 0,2 x VSK, og opbevar det ved 55 ° C. Hertil kommer, forberede 1 liter NTE buffer (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) og opbevares ved 37 ° C.
- Post-hybridisering behandling
- Fjern dækglas forsigtigt for ikke at beskadige sektioner. Anbring objektglassene i et rack og vask dem to gange i 0,2 x SSC ved 55 ° C i en time.
Bemærk: Dækglas ofte falde let, når objektglassene anbringes i opretstående stilling. Hvis dækglasset bliver siddende, fordybe slide i varmt 0,2 x SSC til 1 eller 2 min at vaske dækglasset væk. Undgå at trække dækglasset af dias, da dette kan forårsage skade på sektioner. - I mellemtiden forbereder 500 ml vaskebuffer (1% BSA, 0,3% Triton i TBS buffer) og 100 ml blokerende opløsning (0,5% blokering reagens i TBS buffer). Rør det blokerende pulveret i TBS, der langsomt opvarmes til 70 ° C og lad den køle ned til stuetemperatur, når dissolved.
Bemærk: Mængden af vaskebuffer og blokere nødvendige løsning vil variere afhængigt af størrelsen af den flade plastboks anvendes i trin 4.3.8 -11. Det vil tage nogen tid at blive helt opløst Triton, så forbered nok løsning på forhånd. - Faa samme objektglassene i 1x NTE i 2 min.
- Fortsæt til RNAse En behandling ved at overføre de glider ind 1x Nantes buffer, som 20μg/ml RNAse A føjes lige før brug, inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
Bemærk: RNAse En spalter gratis single-strandede RNA samt på uoverensstemmelser i RNA rækkehuse. Dette trin hjælper med at reducere omfanget af ikke-specifik binding af sonden, som spaltes probed fragmenter bliver vasket ud i de sidste 0,2 x SSC vask (se 4.3.6). - Glassene skylles to gange i 1x NTE i 2 min hver.
- Vask dias i frisk 0,2 x SSC ved 55 ° C i en time.
- Faa samme objektglassene i 1x PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør dias fra den rack på the bunden af en flad plastik kasse og dække dem med en minimal mængde af blokerende opløsning. Bloker dias i 45 min på et langsomt ryste platform.
- Overfør dias til en anden ren flad plastik kasse og vaske dem i 45 min med vaskebuffer på en ryste-platform.
- Fortsæt til antistof inkubation. Fortynd anti-digoxigenin antistof i vaske buffer (1:5 v / v) og enten anvende en minimal mængde direkte på de enkelte dias eller placere dias i en flad plastik kasse og dække dem med en minimal mængde antistof løsning. Inkuber slides i mørke i 2-3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask dias 4 gange i 15 min hver med vaskebuffer på ryste-platformen. Brug en minimal mængde vaskebuffer og en flad plastboks. Rengør plastboks mellem hver af de vaske.
Bemærk: Rengøring af boks mellem vasker vil reduceret den generelle baggrund på diaset. For at forenkle dette, bruger vi to identiske flade kasserog overføre den glider ind i en ren boks efter hver vask. - Overfør objektglassene i 1x TBS i 2 min.
- Faa samme dias i TN buffer to gange i 2 minutter hver.
- Forbered farvning løsning umiddelbart før brug ved at tilsætte 20 μl NBT / BCIP per 1 ml TN buffer. Hæld farvning løsning i en lille plastik vejer fad. Sandwich to dias sammen med de sektioner vender mod hinanden. Dip én lang side af sandwich i løsningen, så kapillarvirkning til at trække op løsningen. Hæld vandet fra dias på en Kimwipe og fyld glassene med antistof løsning igen. Du kan være nødt til at trykke på dias som løsningen strømme i at undgå bobler. Anbring objektglassene i en plastik kasse og opbevares ved stuetemperatur i mørke.
- Dag 10 til Dag 15: Opdater farvning opløsning to gange dagligt i 1-5 dage ved at skylle objektglassene i TN buffer og forberede nye sandwich indeholder frisk farvning løsning.
Bemærk: Udskiftning af farvningen løsning med jævne intervals vil forbedre signal til baggrunden ratio. Udvikling af signalet kan overvåges under en forbindelse eller stereo-mikroskop. Det er muligt at fotografere afsnittene, mens de er i TN buffer i mellem runder af farvning eller når de overføres til vand lige før permanent montering.
- Fjern dækglas forsigtigt for ikke at beskadige sektioner. Anbring objektglassene i et rack og vask dem to gange i 0,2 x SSC ved 55 ° C i en time.
- Montering
- Når signalet er indlysende, skylles objektglassene i milliQ H 2 O og dehydrerer dem hurtigt gennem en ethanol-serien:
- 10% ethanol - 10 s
- 30% ethanol - 10 s
- 50% ethanol - 10 s
- 70% ethanol - 5 s
- 80% ethanol - 5 s
- 95% ethanol - 5 s
- 100% ethanol - 5 s
- histoclear - 2 min
- histoclear - 2 min
- Monter dias ved at placere en eller to dråber af toluen-baseret Mounting Medium på hver glede og langsomt sænke dækglasset på det dias undgå dannelsen af bobler. Lad Mounting Medium hærde natten over, før en analyse af resultatet under en sammensat mikroskop. Når monteret, kan slides opbevares i år ved stuetemperatur.
- Når signalet er indlysende, skylles objektglassene i milliQ H 2 O og dehydrerer dem hurtigt gennem en ethanol-serien:
5. Repræsentative resultater:
Efter 1-5 dage, vil en rød-lilla signal udvikle sig i de celler, hvor proben har hybridiseret til supplerende afskrifter (Figur 1). Farven signal giver således en direkte visualisering ved cellulære opløsning af udtrykket mønster af genet af interesse. En svagere baggrundsfarvning kan også udvikle sig, som følge af den ikke-specifikke binding af sonde eller farvning af plantevæv (Figur 3). Sådanne baggrund signal kan være relativt mere udtalt i de små, mindre bestemt celler i væv, men baggrundsfarvning ville også ses i sektioner hybridiseret til den negative og positive kontrol sonder og ville ikkevære reproducerbar mellem eksperimenter.
Figur 1. Repræsentative resultater opnået med forskellige sonder på Arabidopsis og majs væv. In-situ hybridizations fra Arabidopsis (AD) og majs (EH) væv med forskellige gen-specifikke prober illustrerer den type resultater, der kan forventes efter den vellykkede afslutning af de skitserede protokol. (A) Lokalisering af SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) i Arabidopsis vegetative skyde spids; se tilstedeværelsen af lilla blå signal i en ubestemt cellerne i meristem og den manglende signal i de omkringliggende blade. (BD) Dele af arabidopsis torpedo fase embryoner viser CLAVATA3 (B) til udtryk i de få embryonale stamceller, AtML1 (C) udtryk i de epidermale lag, og den manglende signal i sektioner probed med et tilfældigt negativ kontrol RNA (D). (E) Lokalisering af STM homolog knotted1 i udviklingslandene majs foster; Bemærk det stærke signal specifikt i embryonale meristem og rod. (FH) længdesnit gennem den vegetative skyde apex fra majs viser forskellige in situ hybridisering mønstre for arf3a (F) og ocl4 (G) og ingen hybridisering signal til den negative kontrol probe (H). arf3a udtrykkes på abaxial / nederste blade overflade, mens AtML1 homolog ocl4 udtrykkes specifikt i overhuden.
Følgende genet fragmenter blev brugt som sonde: STM: Den cDNA regionen omfatter aminosyrer fra 81 til 382, som omfatter bevares homeodomain; CLV3: den fulde længde cDNA; AtML1: tredje exon; kn1: Hele åben læseramme; arf3a: nukleotider fra 9 til 225 af cDNA klon HM004539; ocl4: de 3 '1,7 KB af den fulde længde cDNA, som omfatter flere bevarede protein domæner.
Figur 2. Kontrol punkter, samtidig med at in vitro-transskription sonder. (A) in situ hybridisering sonder kontrolleres på en standard agarose gel efter in vitro-transskription (a), efter at DNase behandling og efterfølgende rensning af in vitro-transskription reaktion (b), efter carbonat hydrolyse-hvis det er nødvendigt-(c), og når klar til brug (d). For sonder over 250 bp i længde, som føler 1, vil karbonat hydrolyse giver en række mindre sonde fragmenter (beslag). (B) farvemetrik kvantificering af sonder fra dot blot-analyse. Fortyndinger fra 10 -1 til 10 -5 af en 100 ng / mikroliter kontrol probe (1) og af tre nyligt DIG-mærkede prober (2-4) er spottet på en overførsel membran, inkuberet med anti-DIG antistof, og analyseres ved hjælp af de kolorimetriske test, der er skitseret i afsnit 2.3 i protokollen. Analysen tyder på,følgende skønnede koncentrationer: probe 2, ~ 100 ng / mikroliter, sonde 3, ~ 10 ng / mikroliter sonde 4, ~ 1 ng / mikroliter. Probe 4 er usandsynligt, at give en god in situ hybridisering signal.
Figur 3. Sammenligning af en ikke-specifik probe til et velfungerende sonde. Længdesnit gennem den vegetative skyde apex fra majs viser en ikke-specifik baggrund signal (A) og en specifik in situ hybridisering signal til OCL5 sonde i det ydre cellelag (B).
Figur 4. Diagram, der viser tidslinjen af trin i in situ hybridisering protokol. Tissue indlejring trin er angivet i grøn, probe-præparat trin i orange, og in situ hybridisering trin i blåt. Denne tidslinje mener, at DNA template til in vitro-transskription af sonden er til rådighed. Parafin-embedded væv blokke og DIG-mærkede prober kan tilberedes i forvejen og opbevares ved 4 ° C og -80 ° C, henholdsvis indtil tidspunktet for anvendelsen. In situ hybridisering protokol kan derefter være afsluttet i så lidt som fire dage.
Discussion
In situ hybridisering metoden skitseret her tillader direkte visualisering af Spatiotemporal udtryk mønster af ethvert gen af interesse med stor cellulære opløsning, høj følsomhed og specificitet. Protokollen tillader ikke en kvantitativ sammenligning af udtryk niveauer mellem gener. Dog kan metoden høje følsomhed og opløsning afslører gradienter af genekspression i et væv 8, 18, hvilket ikke er muligt med de fleste andre metoder til analyse af genekspression.
Protokollen indeholder mange skridt, som kan gøre fejlfinding problematisk. De mest kritiske trin i protokollen er fiksering af væv og udvælgelsen og mærkning af sonden. Dårligt infiltreret væv og sonder med lav DIG inkorporering vil give meget svage signaler, som kan være svære at opdage ovenstående baggrund. For hver ny gen af interesse, er det tilrådeligt at prøve et par forskellige sonder stammer fra forskelleje regioner af udskrift. Lejlighedsvis, kan to eller tre sonder henvender sig til forskellige mindre regioner af genet skal kombineres for at opnå en stærk og specifik hybridisering signal. Hertil kommer, at de hybridisering betingelser, såsom temperatur og sammensætningen af hybridisering buffer kan optimeres for hvert gen eller væv til at sænke eller øge hybridisering stringens. Også protease trinnet for behandling er en variabel og kan ændres for at tilpasse protokollen for forskellige plantearter, eller til påvisning af udskrifter med meget lav tæthed. Inddragelse af både positive og negative kontrol sonder vil være nyttigt at identificere problematiske punkter i protokollen.
Proceduren er optimeret til paraffinindstøbte plantevæv sektioner, men med mindre ændringer kan også anvendes til hel-mount in situ hybridisering. Selv om meget udbredt i dyreforsøg 19, hele montere in situ hybridisering vil blive limited at plante væv, der nemt kan infiltreret, som embryoner, rødder eller unge meristematic væv 20,21. Protokollen kan også nemt ændres, så samtidig afsløre to forskellige mRNA eller lokalisere afskrifter sammen proteiner 15,22,23. Endelig er det muligt at udvide anvendelsen af denne metode til visualisering af små RNA udtryk mønstre i planter. miRNA udtryk mønstre er blevet bestemt ved hjælp af denne protokol i både majs og Arabidopsis 8,14. For nylig har in vitro transskriberede prober blevet erstattet af kommercielt tilgængelige DIG-mærkede Locked Nucleic Acid (LNA), oligo-prober, der øger signal følsomheden 18, 24.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forskning i laboratoriet af MT er støttet af tilskud fra National Science Foundation (DBI-0820610 og IOS-1022102) og NY Department of Health (NYSTEM-C024308). CM modtaget postdoc-stipendier fra det spanske Ministerium for Undervisning og Videnskab (2007-0937) og instituttet Rafael del Pino, Spanien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
- Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
- Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
- Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
- Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
- Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
- Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
- Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
- Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
- Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
- Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
- Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
- Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
- Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
- Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
- Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
- Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
- Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
- Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
- Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
- Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
- Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).
