Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

Summary

Il

Abstract

Con i progressi della ricerca genomica del decennio passato, biologia vegetale ha visto numerosi studi che presentano le analisi quantitative su larga scala dell'espressione genica. Microarray e approcci di sequenziamento prossima generazione vengono utilizzati per studiare i processi evolutivi di risposta, fisiologiche e di stress, sezionare epigenetici e piccoli percorsi di RNA, e costruire reti geniche di grandi dimensioni regolamentari ^1-3. Mentre queste tecniche di facilitare l'analisi simultanea di insiemi gene di grandi dimensioni, in genere offrono una risoluzione spazio-temporale molto limitato di cambiamenti di espressione genica. Questo limite può essere superato parzialmente utilizzando profili metodo in combinazione con lasermicrodissection o fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule ^4-7. Tuttavia, per comprendere appieno il ruolo biologico di un gene, la conoscenza del proprio modello spazio-temporale di espressione ad una risoluzione cellulare è essenziale. In particolare, quando si studia lo sviluppo o gli effetti di sti ambientaliMuli e mutanti in grado l'analisi dettagliata del pattern di espressione di un gene è diventato essenziale. Per esempio, sottili differenze quantitative nei livelli di espressione dei principali geni regolatori può portare a fenotipi drammatico se associato con la perdita o il guadagno di espressione in tipi cellulari specifici.

Diversi metodi sono abitualmente utilizzati per l'esame dettagliato dei modelli di espressione genica. Uno è attraverso l'analisi delle linee di giornalista transgeniche. Tale analisi può però diventare molto tempo quando si analizzano più geni o di lavoro negli impianti recalcitranti alla trasformazione. Inoltre, una convalida indipendente per garantire che il modello di espressione del transgene imita quella del gene endogeno è in genere necessaria. Localizzazione immunoistochimica di proteine ​​o l'mRNA di ibridazione in situ presentare alternative relativamente veloce per la visualizzazione diretta dell'espressione dei geni all'interno delle cellule e dei tessuti. Quest'ultimo ha il vantaggio che può essere facilmente used su qualsiasi gene di interesse. ibridazione in situ permette la rilevazione di mRNA bersaglio nelle cellule tramite l'ibridazione con un marcato senso anti-RNA sonda ottenuti in vitro la trascrizione del gene di interesse.

Qui delineare un protocollo per la localizzazione in situ di espressione genica nelle piante che è altamente sensibilità e specifici. È ottimizzato per l'utilizzo con fisso paraformaldeide, incluse in paraffina sezioni, che danno ottima conservazione di istologia e sonde DIG marcato che vengono visualizzati da immuno-rilevazione e alcalino-fosfatasi reazione colorimetrica. Questo protocollo è stato applicato con successo ad un certo numero di tessuti da una vasta gamma di specie vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l'espressione di mRNA e piccoli RNA ^8-14.

Protocol

1. Preparazione del campione

Nota: tutti i gradini fino ad includere l'ibridazione sono sensibili alle attività RNAsi. E 'quindi essenziale per lavorare in condizioni di pulizia. E 'anche abbastanza comune per fare tutte le soluzioni RNasi-free utilizzando DEPC trattati con acqua e bicchieri al forno a 180 ° C per almeno 3 ore. Contenitori di plastica sono spesso lavate con il trattamento con 0,2 N NaOH per 30 min. Tuttavia, nessuna di queste precauzioni sono essenziali e noi di solito uso regolare pulizia MilliQ H ₂ O per tutte le soluzioni. Facciamo tenere separati i reagenti, scatole e oggetti in vetro di ibridazioni in situ e memorizzare questi in un armadietto pulito.

1. Esempio di fissaggio
   1. Giorno 1: Preparare fresca 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Per 500 ml, 400 ml caldo 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO ₄ pH7.0) a 60 ° C e sciogliere due palline di NaOH. In una cappa, aggiungere 20 g di paraformaldehyde e mescolare bene fino alla dissoluzione. Posizionare la soluzione su ghiaccio e una volta raffreddato il pH a 7,2 con H ₂ SO ₄ (1-2 gocce per 100ml). Quindi regolare il volume a 500 ml con PBS 1x.
      Nota: Non usare HCl per regolare il pH in quanto questo rilascio fumi altamente tossici. Paraformaldeide è tossico, questa soluzione dovrebbe quindi essere preparati in una cappa aspirante e smaltiti correttamente. Inoltre, paraformaldeide si è conservato a 4 ° C e va acquistato nuovo ogni 6 - 9 mesi.
   2. Raccolta di campioni di tessuto e li posto immediatamente in 15 ml di fissativo fresco PFA sul ghiaccio in fiale di vetro a scintillazione. Se la dissezione dei tessuti è necessario, questo è fatto meglio sul ghiaccio in fissativo freddo.
      Nota: è importante utilizzare un largo eccesso di fissativo. Il rapporto generale consiglia di utilizzare 10 volumi di fissativo a 1 volume di tessuto.
   3. Applicare un vuoto (~ 500 mm Hg) per i campioni, mentre sul ghiaccio. Tenere un vuoto per 15-20 minuti; piccole bolle dovrebbe liberare dal campiones ma il fissativo non dovrebbe venire a ebollizione. Interrompere il vuoto lentamente, e rinnovare il fissativo PFA per garantire il fissativo rimane alla giusta concentrazione. Ripetere questa operazione finché i tessuti lavandino dopo il rilascio del vuoto.
      Nota: La fissazione è tenuto a fissare e cross-link molecole di RNA all'interno del tessuto. Questo passaggio è fondamentale come materiali poco rendimento stabilito un segnale basso. Alcuni tessuti non affondare subito, ma la maggior parte finirà per affondare durante la notte. Per migliorare l'infiltrazione del fissativo, i detergenti possono aggiungersi: Triton fino a 0,1% e / o Tween fino a 0,1 - 0,3%. In alternativa, a base di etanolo fissativi, come la formaldeide, alcool-acido acido (FAA), può essere utilizzato per tessuti che altrimenti non facilmente infiltrati ^14,15.
   4. Sostituire il fissativo PFA ancora una volta e mantenere le fiale a 4 ° C durante la notte.
2. Tessuto embedding
   1. Giorno 2: Pre-cool 1x PBS e la serie di etanolo a 4 ° C.
   2. Sciacquare il TWI campionice per 30 minuti in ciascuna delle 1x PBS, sul ghiaccio.
      Nota: Anche in questo caso si consiglia di utilizzare un grande eccesso di ciascuna soluzione.
   3. Disidratare i campioni prendendoli attraverso una serie di etanolo, sul ghiaccio, come segue:
      • 10% di etanolo 30 minuti,
      • 30% di etanolo 30 min,
      • Etanolo al 50% 1 ora,
      • Etanolo al 70% 1 ora,
      • 85% di etanolo 1 ora,
      • 1 ora al 95% etanolo,
      • 3 cambi di etanolo 100% per 1 ora ogni
   4. Alla fine della giornata, sostituire l'etanolo mediante eosina 0,1% in 100% etanolo notte a 4 ° C. Eosina macchie la parete cellulare rendendo i campioni più visibile durante l'inclusione e sezionamento.
      Note: I tempi qui indicati sono stati ottimizzati per i blocchi di 3x3x3 mm, ma più lunga incubazione può essere richiesto per i più grandi campioni.
      I campioni possono essere conservati in etanolo al 70% a 4 ° C per diversi mesi. 3 ° giorno: La mattina seguente, caldo i campioni a temperatura ambiente per un'ora. Poi sostituire gradualmente con l'etanolo histoclear come segue:
      
   5. Alla fine della giornata, aggiungere volume 1 / 4 di Paraplast Plus. chip e posto la fiala in un forno a 60 ° C. Anche riempire un bicchiere con chip Paraplast e riempire questo frequentemente in modo da avere sempre cera fusa di fresco a portata di mano.
      Nota: La temperatura del forno si riscalda importante e prolungato di Paraplast superiori a 60 ° C dovrebbe essere evitato.
   6. Giorno 4: Sostituire gradualmente i histoclear Paraplast regolarmente con l'aggiunta di trucioli di paraffina più (ogni ora). Alla fine della giornata, con attenzione versare al largo della histoclear / miscela di cera e subito sostituirlo con pura cera fusa. Lasciare i campioni a 60 ° C durante la notte.
   7. Giorni 5 e 6: Cambiare il Paraplast 3 volte al giorno, circa ogni 4 ore, con fresca cera fusa mantenendo la sAMPIONI a 60 ° C.
      Nota: è possibile cambiare la cera solo una volta al giorno, ma la preparazione dei tessuti potrebbe richiedere qualche giorno in più per completare, come la cera deve essere cambiato almeno 5 o 6 volte. Infiltrazione vuoto dei campioni di tessuto, quando questi sono in 100% EtOH e / o in cera può migliorare ulteriormente l'infiltrazione e l'inclusione dei tessuti. Infiltrazione vuoto dei campioni in cera dovrebbe essere fatto a 60 ° C.
   8. Giorno 7: Cambia la cera ancora una volta. L'odore di histoclear dovrebbe essere andato completamente ed i campioni possono essere incorporati in seguito quel giorno.
   9. Impostare un grande piatto il riscaldamento a 60 ° C, al riparo da un foglio di alluminio.
   10. Il metodo di inclusione variano a seconda del tipo di tessuto da analizzare. Il punto più importante in questa fase è quello di garantire che i campioni siano orientati correttamente per sezionamento in seguito. Un modo è quello di utilizzare stampi di plastica e anelli. Scaldare gli stampi sulla piastra riscaldante e versare cera fusa nella parte inferiore dello stampo. Trasferimentoun campione di tessuto nello stampo con una pinza riscaldata e orientarla nella posizione desiderata. Posizionare l'anello bianco sopra lo stampo e aggiungere ulteriori cera fusa in modo tale che i tessuti sono completamente coperti. Muovere con cautela lo stampo dalla piastra al banco. Lasciate raffreddare la cera gradualmente.

Un'altra possibilità è quella di distribuire tutti i campioni in una capsula di Petri contenente cera fusa (i campioni devono essere completamente coperta da cera) mentre si lavora sul piatto 60 ° C riscaldata. Orientare i campioni con una pinza calda. Al termine, spegnere la piastra. Quando la cera è solidificato, la capsula di Petri può essere spostato al banco e poi conservare a 4 ° C. Quando è pronto per il sezionamento, piccoli blocchi contenente un campione di tessuto può essere tagliato fuori dalla capsula di Petri con una lama riscaldata e montata su un portacampioni microtomo con un calo ulteriore di cera fusa. Lasciare riposare il campione indurire per qualche minuto prima di sezionamento.

Nota: I blocchi possonoessere conservati a 4 ° C per 1 anno o più. Per ulteriori suggerimenti utili sulla fissazione dei tessuti e l'inclusione, vedi rif. 16

2. Sonda preparazione

1. Clonazione
   Le sonde sono di solito generati da una o più specifiche regioni del gene di interesse. Sequenze altamente ripetitive dovrebbero essere esclusi dalla sonda, ma le sequenze corrispondenti a domini proteici conservati, come il DNA-binding motivi di fattori di trascrizione, di solito produrrà modelli di espressione genica specifici ^8,9,12,15 (Fig. 1). Questo perché la RNAsi Un trattamento in post-ibridazione passi (vedi sotto) riduce il livello della sonda cross-ibridazione tra i membri della famiglia genica. Un RNAse si unirà a loro inadeguatezza rispetto ai duplex RNA, frammentando le sonde ibridate con le trascrizioni di complementarietà imperfetta, che verrà lavato via nei passaggi successivi.
   In generale, le sonde diverse aver bisogno di essere testati per ogni gene di interesse. Sonde possono essere il più breve, fino a 150 basi di lunghezza. Although non c'è limite alla lunghezza della sonda, brevi frammenti poi 1,5 kb di solito trascrivere migliore. Frammenti di DNA da trascrivere vengono clonati in un vettore contenente T3, T7 o SP6 promotori (ad esempio pCRII-TOPO, Invitrogen). In alternativa, T3, T7 o SP6 sequenze promotore può essere inclusa come 5'-coda sul fondo inverso utilizzato per amplificare la regione sonda.
   In ogni esperimento di ibridazione in situ, che includono una sonda di controllo positivo per il quale è noto il modello di ibridazione e che lavora costantemente, così come un controllo negativo (Figura 1D e H). Quest'ultima potrebbe essere una sonda casuale RNA che è nota per non ibridare a qualsiasi trascrizioni nel tessuto di interesse. Anche se è comune utilizzare la sonda senso del gene in esame, questo non è necessario e qualsiasi non-ibridazione RNA si adatta allo scopo. Se disponibile, tessuti da un allele nullo trascrizione del gene di interesse potrebbe servire come un eccellente controllo negativo.
   
Nella trascrizione in vitro
1. Linearizzare il plasmide da digerire circa 5 mg di DNA con un enzima di restrizione che digerisce alla fine dell'inserto di fronte al sito del promotore. Non utilizzare gli enzimi di restrizione che lasciano un 3'-sbalzo. Questo può portare ad artefatti trascrizione perché la polimerasi può utilizzare sbalzo 3 'come substrato per proseguire la trascrizione. In alternativa, la regione tra cui la sonda T3, T7 o SP6 promotore possono essere amplificati da PCR per generare il modello di DNA per la reazione di trascrizione in vitro.
2. Controllare un'aliquota su un gel per verificare che la reazione è andata a compimento.
3. Estrarre il DNA con fenolo / cloroformio, precipitato con etanolo e risospendere il pellet di DNA in MilliQ H ₂ O ad una concentrazione di 1μg/μl. In alternativa, il DNA può essere pulito utilizzando le normali colonne di purificazione del DNA.
4. Impostare la reazione di trascrizione in vitro mescolando:
   • 1ml purified DNA (1μg/μl)
   • 2μl tampone trascrizione 10x
   • 2 microlitri 10x DIG RNA etichettatura mix
   • 1ml RNAse OUT
   • 2μl T3, T7 o SP6 RNA polimerasi (20 U / mL)
   • H ₂ O fino a 20μl.
   
   Incubare a 37 ° C per 1 a 2 ore. Tenere 1ml di analizzare su un gel più tardi.
   Nota: le sonde a fluorescenza marcata sono preferite nei sistemi animali, ma a causa delle alte auto-fluorescenza della maggior parte dei tessuti vegetali, in protocolli di ibridazione in situ per le piante usano sonde radiomarcato ¹⁷ o più comunemente etichettati DIG-sonde che vengono rilevati mediante immunoistochimica.
5. Rimuovere il modello di DNA con l'aggiunta di 75 microlitri MilliQ H ₂ O e 5 microlitri RQ1 DNAsi (1 U / mL) per la reazione di trascrizione e la reazione di incubazione a 37 ° C per 10 min.
6. Purificare la reazione di trascrizione in vitro per eliminare non incorporate nucleotidi e trascrizioni di piccole dimensioni. Una possibilitàlità è quella di utilizzare una dimensione di esclusione Sephadex colonna ®, come le Colonne Spin mini rapida RNA (Roche). In alternativa, la reazione di trascrizione può essere purificato da una convenzionale LiCl / etanolo precipitazioni (vedi rif. 14). Tenere 1ml di verificare su un gel più tardi.
7. Sonde di oltre 250 basi in lunghezza sono di solito parzialmente idrolizzato di ottenere molecole di RNA di circa 150 nt e, pertanto, abbastanza piccole da penetrare in modo efficiente le sezioni di tessuto. Aggiungere un volume equivalente di tampone carbonato 2x (80 mM NaHCO _3, 120 mM Na ₂ CO ₃₎ per la reazione di trascrizione purificata e incubare a 60 ° C. Il tempo di incubazione deve essere calcolato con la seguente formula:
   tempo = (Li - Lf) / (K x x Li Lf)
   dove Li = lunghezza della sonda iniziale (in kb); Lf = lunghezza della sonda finale (0,150 kb), K = 0,11 kb / minuto. Mantenere 2 microlitri di verificare su un gel.
8. Neutralizzare la reazione di idrolisi con l'aggiunta di volume di 1 / 20 del 10% di acido acetico.
9. La sonda viene poi puricato con l'aggiunta di 1ml di tRNA (100mg/ml), 1 / 10 del volume 3M NaAc pH 5,2, più 2,5 volumi di etanolo freddo al 100%, e incubando a -80 ° C per 30 min. Precipitare l'RNA mediante centrifugazione a 13.500 rpm per 20 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 500μl etanolo al 70%. Centrifuga di nuovo, lasciare che il pellet aria secca (in genere circa 15 minuti), e risospendere l'RNA in 50μl formammide 50% deionizzata. La sonda deve essere conservato a -80 ° C fino al momento dell'uso.
10. Controllo su un normale 1% TAE-gel di agarosio il prodotto finale così come prodotti intermedi dalle sezioni 2.2.4, 2.2.6 e 2.2.7 (Figura 2A). Questo permette di monitorare l'efficienza della reazione di trascrizione in vitro.
    Nota: La reazione di trascrizione in vitro dovrebbe produrre circa 1 mg di RNA per 1 mg di modello.
2. Dot Blot analisi
   La concentrazione della sonda e DIG-UTP incorporazione può essere valutata mediante dot blot analisi (Figura 2B). Serie RDiluizioni NA sono macchiati su una membrana di ibridazione standard di controllo a fianco di un RNA etichetta di concentrazione nota. Per esempio, usiamo il DIG-UTP etichettati controllo RNA sonda inclusa nel kit di trascrizione in vitro (Roche). E 'meglio per testare diluizioni multiple per ogni sonda per stabilire una concentrazione accurata.
   1. Preparare un tampone di bloccaggio, sciogliendo 0,5% del reagente di blocco in 1x tampone TBS (100 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl) a 70 ° C, poi lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
   2. 1ml posto di diluizioni in serie (tipicamente 10 ^-1 a 10 ^-5) delle sonde trascritto in vitro e il controllo su una membrana di nylon N +. Fissare l'RNA da UV cross-linking.
      Nota: Una superficie minima della membrana deve essere utilizzato per ridurre il volume di buffer necessaria in seguito.
   3. Equilibrare la membrana in 1x TBS per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) su una piattaforma di agitazione.
   4. Bloccare la membrana utilizzando il bloccobuffer per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.
   5. Sciacquare la membrana in 1x TBS per 5 minuti.
   6. Incubare la membrana con anticorpi anti-DIG, diluire 1ml di anti-digossigenina-AP in 10 ml di TBS 1x, per 45 minuti a temperatura ambiente.
   7. Lavare la membrana due volte in 1x TBS per 15 minuti ciascuno.
   8. Equilibrare la membrana in 1x TN buffer (100mM Tris-HCl pH 9,5, 100mM NaCl) per 5 min.
   9. Macchia la membrana incubando con NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) in tampone 1x TN. La colorazione può prendere 5-10 min. Successivamente risciacquare la membrana con acqua, può poi essere essiccati e conservati come un record.
      Nota: NBT / BCIP è un substrato per la fosfatasi alcalina coniugato con l'anticorpo anti-DIG che dopo idrolisi produce un colorante blu scuro.

3. Sezionamento

1. Calda i blocchi a temperatura ambiente. Se i blocchi sono troppo freddi, singole sezioni possono rotolare senza formare 'nastro' una cera. Tagliare il blocco in un trapezoidaliforma Zoid lasciando circa 1 mm di cera intorno al campione.
2. Riscaldare una diapositiva grande caldo a 35-37 ° C.
   Nota: Molti protocolli fare questo passo a 42 ° C invece riducendo la temperatura a 35-37 ° C previene la formazione di bolle nelle sezioni.
3. Posizionare il blocco sul microtomo in modo che il più delle due facce parallele è in basso. Cura portare il blocco avanti per la lama e assicurarsi che la superficie del blocco è parallelo alla lama. Sezione ad uno spessore di 8 - 10μm. I nastri cera può essere allineato in modo non superficiale appiccicoso, come un foglio di alluminio o carta da filtro, per selezionare le sezioni di interesse. Questo può essere valutato utilizzando un microscopio vicino dissezione.
   Nota: La colorazione eosina del tessuto fornisce un'indicazione se i tessuti sono state correttamente infiltrati durante l'incorporamento. Se il centro del blocco non è colorato con eosina questo di solito indica che il tessuto è scarsamente fisso.
4. Segna Probe-su Plus slridi con una matita (la maggior parte penne o marcatori sono cancellati durante il protocollo di ibridazione in situ) e distribuire 1 ml di pulizia MilliQ H ₂ O su di esso. Attentamente galleggiante sezioni di interesse sulla superficie dell'acqua a temperatura ambiente (è più facile manipolare le sezioni in acqua quando si lavora a temperatura ambiente). Assicurarsi che il lato lucido (lato inferiore, come il nastro si stacca del microtomo) affaccia sulle acque. Poi il trasferimento scivolare lentamente sul vetrino più caldi. Riscaldamento aiuta le sezioni a diffondere sulla superficie dell'acqua. Dopo 5 minuti, versare l'acqua con attenzione, ma in un movimento fluido, in modo che il nastro è abbassato sulla diapositiva. Lasciate le diapositive asciugare per almeno alcune ore o tutta la notte a 37 ° C, in modo che il tessuto aderisce.
   Nota: il tessuto sezionato possono essere memorizzati in una scatola con silice come essiccante per alcuni giorni o settimane a 4 ° C, tuttavia, è meglio usare le diapositive nel più breve tempo possibile.

4. Hybrid In situzazione

1. Sezione di pre-trattamento
   Il volume richiesto per ogni soluzione dipenderà ovviamente il numero di diapositive da trattare e la dimensione del contenitore utilizzato. Le sezioni devono essere sempre completamente sommerse. Per un 25-scivolo rack e un contenitore ben montaggio, 200-250 ml è sufficiente. Perché molte delle fasi di incubazione è molto breve, di solito preparare tutte le soluzioni possibili prima di iniziare la diapositiva di pre-trattamenti. Tuttavia, la soluzione di anidride acetica dovrà essere preparata immediatamente prima dell'uso e della proteasi viene aggiunto al tempo di utilizzo. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente specificato. Inoltre, tutti i buffer possono essere preparati ad una concentrazione 10 volte come una soluzione stock.
   1. Caldo il buffer della proteasi (100 mM Tris pH 8.0, 50 mM EDTA) nel contenitore a 37 ° C.
   2. Sparaffinare e reidratare le sezioni di tessuto come segue:
      
      • histoclear - 10 min (usare un piatto di vetro)
      • histoclear - 10 min (usare unpiatto di vetro)
      • 100% di etanolo - 1 min
      • 100% etanolo - 30 sec
      • 95% etanolo - 30 sec
      • 85% etanolo - 30 sec
      • Etanolo al 70% - 30 sec
      • Etanolo al 50% - 30 sec
      • 30% etanolo - 30 sec
      • 10% di etanolo - 30 sec
      • MilliQ H ₂ O - 1 min
   3. Incubare in 1x PBS per 2 min.
   4. Mix 625μl di proteasi 50mg/ml in 250 ml di tampone proteasi pre-riscaldato a 37 ° C e incubare le diapositive per 20 minuti a 37 ° C.
      Nota: La proteasi è necessario per digerire le proteine ​​fisse e aumentare l'accesso della sonda a RNA cellulare. E 'fondamentale per controllare il tempo di incubazione di massimizzare il segnale di ibridazione senza ripartizione del tessuto, così alcuni di ottimizzazione può essere richiesto per ogni campione di tessuto.
   5. Neutralizzare l'attività della proteasi nello 0,2% glicina in PBS 1x per 2 min.
   6. Sciacquare i vetrini in una volta 1x PBS per 2 min.
   7. Trattare le diapositive in soluzione 4% PFA per 10 minuti di ri-fissare l'RNA che potrebbero essere danneggiati dal trattamento della proteasi.
   8. Sciacquare i vetrini due volte in PBS 1x per 2 minuti ciascuna.
   9. Mentre le diapositive sono in PBS lava, formano 250 ml di soluzione 0,1 M pH 8,0 trietanolammina mescolando 12,5 ml di trietanolammina 2M (29.8g in 100ml MilliQ H ₂ O, pH8.0 con HCl) in 236,25 ml MilliQ H ₂ O in un piatto di vetro. Aggiungere 1,25 ml di anidride acetica nel buffer trietanolammina immediatamente prima di mettere le diapositive, e mescolare bene. Dopo aver aggiunto le diapositive, continuare a mescolare lentamente per 10 minuti.
      Ciò richiede che il rack scivolare è alto nel contenitore di trietanolammina / anidride acetica. Usiamo un sistema di bloccaggio con cavalletto di sostegno.
      Nota: In questo passaggio, carica positiva gruppi amminici che possono portare a legame non specifico della sonda è acetilato. Inoltre, l'anidride acetica è tossico, questa soluzione dovrebbe quindi essere preparati in una cappa aspirante e smaltiti correttamente <./ Li>
   10. Sciacquare i vetrini due volte in 1x PBS per 2 min.
   11. Disidratano le sezioni di tessuto di nuovo:
       
       • H ₂ O - 1 min
       • 10% di etanolo - 30 sec
       • 30% etanolo - 30 sec
       • Etanolo al 50% - 30 sec
       • Etanolo al 70% - 30 sec
       • 85% etanolo - 30 sec
       • 95% etanolo - 30 sec
       • 100% etanolo - 30 sec
       • 100% etanolo - 30 sec
       Nota: Le diapositive possono essere conservati in un contenitore con una piccola quantità di etanolo 100% sul fondo per diverse ore a 4 ° C.
2. Ibridazione
   1. Caldo di un blocco di riscaldamento a 85 ° C.
   2. Preparare il tampone di ibridazione. Per 10 ml, mescolare in un tubo Falcon 1,25 ml di sali ibridazione in situ (3M di NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM fosfato Na pH6.8, 50 mM EDTA), 5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml di solfato di destrano 50%, 250 microlitri 50x Denhardt, 125 microlitri 100mg/ml tRNA, e 875 microlitri di H ₂ O. <br /> Nota: Solfato di Destrano è molto viscoso, quindi è meglio per preriscaldare la soluzione a 60 ° C per pipettaggio più facile. Buffer di ibridazione può conservare a -20 ° C.
   3. Preparare le sonde diverse. Per ogni diapositiva, miscelare 1 sonda microlitri con 9 microlitri MilliQ H ₂ O e 10 microlitri formammide deionizzata. Calore la sonda a 85 ° C per 2-3 minuti, raffreddare immediatamente su ghiaccio, centrifugare brevemente e aggiungere la sonda a 80μl buffer di ibridazione per vetrino. Mescolare bene pipettando, ma evitare di fare bolle.
      Nota: la quantità di sonda da aggiungere ad ogni scivolo ha bisogno di essere testati empiricamente. In generale, le sonde sono utilizzati ad una concentrazione finale di 0,5 sonda complessità ng / kb / mL. Dal momento che ibridazioni sono eseguite con 100 ul per vetrino, circa 25 ng di sonda è necessaria per vetrino per le sonde che sono 0,5 kb di lunghezza e 50 ng di sonda per vetrino per le sonde che sono 1-kb lungo. Per semplicità, spesso cercano di 0,5, 1, e 4 sonda microlitri per vetrino.
   4. Porre i vetrini in unapulire la superficie e lasciarli asciugare completamente per 5-10 min. Preparare la sonda / ibridazione mix tampone sul bordo destro della diapositiva. A poco a poco inferiore un coprioggetto sul vetrino, facendo attenzione che la soluzione di ibridazione copre tutte le sezioni senza bollicine. Toccare il coprioggetto leggermente con il dito dove si formano le bolle di spostare li da tutte le sezioni di tessuto. Non tirare il coperchio sfilare, per non danneggiare le sezioni.
      Nota: Un metodo alternativo comunemente utilizzata in questa fase è quello di preparare "sandwich" di due diapositive che vengono incubate con la sonda stessa. Per maggiori dettagli su questo metodo, vedere rif. 14.
   5. Preparare una camera umida in una scatola di plastica perfettamente piatto. Coprire il fondo della scatola con carta Whatman inumidito con acqua MilliQ, coperto la carta con parafilm lasciando angoli scoperti, posto le diapositive nella scatola di plastica e sigillare la scatola ermeticamente.
   6. Incubare i vetrini alla temperatura desiderata ibridazione, tipicamente 50 - 55 ° C, fo 16-20 ore.
   7. Per utilizzare la mattina dopo, preparare 1 litro 0.2x SSC e conservare questo a 55 ° C. Inoltre, preparare buffer di 1 litro NTE (0,5 M di NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) e conservare a 37 ° C.
3. Post-ibridazione trattamento
   1. Togliere i coprioggetti con attenzione per non danneggiare le sezioni. Porre i vetrini in un rack e lavarli due volte a 0.2x SSC a 55 ° C per un'ora.
      Nota: Vetrini coprioggetto spesso cadono facilmente quando le diapositive sono posti in posizione verticale. Se il coprioggetto rimane attaccato, immergere il vetrino in caldo 0.2x SSC per 1 o 2 minuti per lavare i coprioggetto off. Evitare di tirare il vetrino della diapositiva, in quanto ciò può causare danni alle sezioni.
   2. Nel frattempo, preparare 500 ml di tampone di lavaggio (1% di BSA, Triton 0,3% in tampone TBS) e 100 ml di soluzione bloccante (0,5% il blocco del reagente in tampone TBS). Mescolate la polvere di blocco in TBS che sta lentamente riscaldato a 70 ° C e lasciate raffreddare a temperatura ambiente una volta dissolved.
      Nota: I volumi di tampone di lavaggio e bloccando soluzione doveva varierà a seconda delle dimensioni della scatola di plastica piatto utilizzati nei passaggi 4.3.8 -11. Ci vorrà del tempo per sciogliere completamente Triton, in modo da preparare una soluzione abbastanza in anticipo.
   3. Equilibrare le diapositive NTE 1x per 2 min.
   4. Procedere alla RNAse Un trattamento trasferendo i vetrini in 1x tampone NTE a cui 20μg/ml RNAsi A è aggiunto appena prima l'uso, incubare a 37 ° C per 30 min.
      Nota: RNasi A unirà libero a singolo filamento di RNA come pure a disallineamenti di duplex RNA. Questo passaggio consente di ridurre il livello di legame non specifico della sonda, come spaccati frammenti sondato sono lavati via negli ultimi 0.2x SSC lavaggio (vedi 4.3.6).
   5. Sciacquare i vetrini due volte in 1x NTE per 2 minuti ciascuna.
   6. Lavare i vetrini in fresco 0.2x SSC a 55 ° C per un'ora.
   7. Equilibrare le diapositive in 1x PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
   8. Trasferire i vetrini dal rack su °fondo e di una scatola piatta di plastica e coprire con un volume minimo di soluzione di blocco. Bloccare le diapositive per 45 minuti su una piattaforma scuotendo lentamente.
   9. Trasferire i vetrini in una seconda scatola di plastica piatta e pulita lavarli per 45 min con tampone di lavaggio su una piattaforma di agitazione.
   10. Procedere alla incubazione degli anticorpi. Diluire l'anticorpo anti-digossigenina in tampone di lavaggio (1:5 v / v) e sia applicare un volume minimo direttamente su ogni diapositiva o posto la diapositiva in una scatola piatta di plastica e coprire con un volume minimo di soluzione di anticorpi. Incubare i vetrini al buio per 2-3 ore a temperatura ambiente o una notte a 4 ° C.
   11. Lavare le diapositive 4 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio a scuotere piattaforma. Utilizzare un volume minimo di tampone di lavaggio e una scatola di plastica piatta. Pulire la scatola di plastica tra ciascuno dei lavaggi.
       Nota: Pulizia del box tra un lavaggio e verrà ridotto il contesto generale della diapositiva. Per semplificare questo, usiamo due scatole identiche piattoe trasferire le diapositive in una scatola pulita dopo ogni lavaggio.
   12. Trasferire i vetrini in TBS 1x per 2 min.
   13. Equilibrare le diapositive TN buffer di due volte per 2 minuti ciascuna.
   14. Preparare la soluzione colorante immediatamente prima dell'uso con l'aggiunta di 20 microlitri NBT / BCIP per 1 ml di tampone TN. Versare la soluzione colorante in un piatto di plastica del peso. Sandwich due diapositive con le sezioni di fronte all'altro. Immergere un lato lungo del panino nella soluzione, consentendo un'azione capillare per tirare su la soluzione. Scolate le diapositive su un Kimwipe e riempire le diapositive con soluzione di anticorpi di nuovo. Potrebbe essere necessario selezionare le diapositive come la soluzione per evitare flussi di bolle. Porre i vetrini in una scatola di plastica e conservare a temperatura ambiente al buio.
   15. Giorno 10 al Giorno 15: Aggiornare la soluzione colorante volte al giorno per 1-5 giorni dal lavaggio i vetrini in TN tampone e preparare panini nuovi contenente soluzione fresca colorazione.
       Nota: la sostituzione della soluzione colorante per int regolariervals migliorerà il rapporto segnale fondo. Sviluppo del segnale può essere monitorato in un composto o stereo-microscopio. E 'possibile fotografare le sezioni, mentre sono in un tampone TN tra turni di colorazione o una volta che sono trasferiti in acqua poco prima di montaggio permanente.
4. Montaggio
   1. Una volta che il segnale è evidente, sciacquare i vetrini in MilliQ H ₂ O e disidratare rapidamente attraverso una serie di etanolo:
      
      • 10% di etanolo - 10 s
      • 30% etanolo - 10 s
      • Etanolo al 50% - 10 s
      • Etanolo al 70% - 5 s
      • 80% etanolo - 5 s
      • Etanolo al 95% - 5 s
      • 100% etanolo - 5 s
      • histoclear - 2 min
      • histoclear - 2 min
      Nota: Assicurarsi di mantenere ciascuno di questi tempi di incubazione breve, in quanto il segnale è solubile in etanolo.
   2. Montare le diapositive inserendo una o due gocce di toluene a base di medie di montaggio su ciascun scivolareee lentamente abbassando il coprioggetto sul vetrino evitando la formazione di bolle. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire durante la notte prima di analizzare il risultato al microscopio composto. Una volta montate, le diapositive possono essere conservati per anni a temperatura ambiente.

5. Rappresentante dei risultati:

Dopo 1-5 giorni, un rosso-violaceo segnale si svilupperà in quelle cellule in cui la sonda si è ibridato a trascrizioni complementari (Figura 1). Il segnale di colore fornisce quindi una visualizzazione diretta a risoluzione cellulare del pattern di espressione del gene di interesse. Una colorazione di fondo più debole può anche sviluppare, derivante dal legame non specifico della sonda o di colorazione dei tessuti vegetali (Figura 3). Segnale di fondo quali potrebbero essere relativamente più pronunciata nella piccola e meno determinato cellule del tessuto, ma la colorazione di fondo sarebbe anche osservato nelle sezioni ibridato alle sonde di controllo negativo e positivo e nonessere riproducibile tra esperimenti.

Figura 1. Risultati rappresentativi ottenuti con sonde diverse su tessuti di Arabidopsis e mais. Ibridazioni in situ di Arabidopsis (AD) e mais (EH) tessuti con distinte gene sonde specifiche che illustrano il tipo di risultati che possono essere previsti al completamento del protocollo descritto. (A) Localizzazione di SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) in Arabidopsis apice vegetativo sparare; notare la presenza di porpora segnale blu nelle cellule del meristema indeterminato e la mancanza di segnale nelle foglie circostanti. (BD) Sezioni di Arabidopsis embrioni fase siluro mostrando CLAVATA3 (B) espressione nelle cellule staminali embrionali pochi, AtML1 (C) espressione nello strato epidermico, e la mancanza di segnale nelle sezioni sondato con un controllo casuale RNA negativo (D). (E) Localizzazione del knotted1 STM omologo in embrione mais via di sviluppo; nota il segnale forte in particolare nel meristema embrionali e radice. (FH) sezioni longitudinali attraverso l'apice vegetativo riprese a partire da granturco che mostra distinti modelli di ibridazione in situ per arf3a (F) e ocl4 (G) e nessun segnale di ibridazione per la sonda di controllo negativo (H). arf3a è espressa sulla superficie del foglio abaxial / basso, mentre il AtML1 ocl4 omologo si esprime specificamente nell'epidermide.

I frammenti del gene sono stati utilizzati come sonda: STM: la regione che comprende cDNA aminoacidi 81-382, che include la omeodominio conservati; CLV3: l'intera lunghezza cDNA; AtML1: l'esone terzi; kn1: l'intera struttura di lettura aperta; arf3a: nucleotidi 9-225 di clone cDNA HM004539; ocl4: 3 '1,7 kb di tutta la lunghezza cDNA, che comprende diversi domini proteici conservati.

Figura 2. Verifica punti rendendo in sonde trascrizione in vitro. (A) In sonde di ibridazione in situ vengono controllati su uno standard di gel dopo la trascrizione in vitro (a), dopo il trattamento con DNasi e successiva purificazione della reazione di trascrizione in vitro (b), dopo carbonato di idrolisi-se necessario-(c) e quando pronto per l'uso (d). Per le sonde oltre 250 bp in lunghezza, come sonda 1, l'idrolisi carbonato produrrà una serie di frammenti sonda più piccola (staffa). (B) quantificazione colorimetrica di sonde attraverso l'analisi dot blot. Diluizioni che vanno da 10 ^-1 a 10 ^-5 di un ng / mL 100 sonda di controllo (1) e di tre nuovi DIG-sonde marcate (2-4) sono macchiati su una membrana di trasferimento, incubate con anticorpi anti-DIG, e analizzati utilizzando il test colorimetrico di cui al punto 2.3 del protocollo. L'analisi suggeriscele seguenti concentrazioni stimata: sonda 2, ~ 100 ng / mL; sonda 3, ~ 10 ng / mL sonda 4, ~ 1 ng / mL. Sonda 4 è improbabile che produrre un buon segnale di ibridazione in situ.

Figura 3. Confronto di un non-sonda specifica per un ben di lavoro della sonda. Sezioni longitudinali attraverso l'apice vegetativo riprese dal mais mostrano un non-specifico segnale di fondo (A) e uno specifico segnale di ibridazione in situ per la sonda OCL5 nello strato esterno delle cellule (B).

Figura 4. Diagramma che mostra la sequenza temporale delle fasi del protocollo di ibridazione in situ. Passi embedding dei tessuti sono indicati in verde, sonda-preparazione passi in arancione, e le fasi di ibridazione in situ in blu. Questa timeline ritiene che il DNA template per la trascrizione in vitro della sonda è disponibile. Paraffina-embedded blocchi di tessuti e DIG-sonde marcate possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C e -80 ° C, rispettivamente, fino al tempo di utilizzo. Il protocollo di ibridazione in situ può essere completato in appena quattro giorni.

Discussion

Il metodo di ibridazione in situ qui delineato permette la visualizzazione diretta del pattern di espressione spazio-temporale di un gene di interesse con grande risoluzione cellulare, elevata sensibilità e specificità. Il protocollo non consente un confronto quantitativo dei livelli di espressione tra geni. Tuttavia, elevata sensibilità del metodo e la risoluzione può rivelare gradienti di espressione genica in un tessuto ^{8, 18,} ​​che non è possibile con la maggior parte di altri metodi di analisi di espressione genica.

Il protocollo comprende molte tappe, che può rendere problematica la risoluzione dei problemi. Le fasi più critiche del protocollo sono la fissazione dei tessuti e la selezione e l'etichettatura della sonda. Scarsamente nei tessuti infiltrati e sonde con l'incorporazione DIG bassa darà segnali molto deboli che potrebbero essere difficili da rilevare sopra di fondo. Per ogni nuovo gene di interesse, si consiglia di provare un paio di sonde distinte derivanti da diveraffitto regioni della trascrizione. A volte, due o tre sonde targeting diverse regioni più piccole del gene potrebbe essere necessario essere combinati per ottenere un segnale di ibridazione forte e specifico. Inoltre, le condizioni di ibridazione, come la temperatura e la composizione del buffer di ibridazione, può essere ottimizzato per ogni gene o tessuto per abbassare o aumentare la severità ibridazione. Anche la fase di trattamento della proteasi è una variabile e può essere modificato per adattare il protocollo per diverse specie di piante o per la rilevazione delle trascrizioni con abbondanza molto basso. L'inclusione di entrambe le sonde di controllo positivo e negativo sarà utile per identificare i punti problematici del protocollo.

La procedura è ottimizzata per paraffina sezioni di impianto di tessuto, ma con piccole modifiche può essere utilizzato anche per tutto il montaggio di ibridazione in situ. Benché ampiamente utilizzati nella ricerca animale ^19, montare tutto ibridazione in situ è limited di tessuti vegetali che possono essere facilmente infiltrati, come gli embrioni, radici o giovani tessuti meristematici ^20,21. Il protocollo può anche essere facilmente modificato per determinare simultaneamente due distinte o localizzare mRNA trascritti a fianco delle proteine ^{​​15,22,23.} Infine, è possibile estendere l'applicazione di questo metodo per la visualizzazione di piccoli pattern di espressione di RNA nelle piante. pattern di espressione di miRNA sono stati determinati utilizzando questo protocollo sia in mais e Arabidopsis ^8,14. Più recentemente, il sonde in vitro trascritto sono stati sostituiti da commercialmente disponibile DIG marcato blocco degli acidi nucleici (LNA) sonde oligo che aumentare la sensibilità del segnale ^{18, 24.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytoseal 60 4oz	Fisher Scientific	23-244-256	Toluene-based 8310-4
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus	Fisher Scientific	23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+	GE Healthcare	RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL	Invitrogen	10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl	Promega Corp.	M6101
DIG-labeled Control RNA	Roche Group	11585746910
DIG RNA labeling mix	Roche Group	11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U	Roche Group	10881767001
RNase-A	Roche Group	109142	dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent	Roche Group	1 096 176	Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U	Roche Group	1 093 274
NBT/BCIP stock solution	Roche Group	1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Group	11814427001
tRNA from E. coli	Roche Group	109541
Triton®X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Deionized formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV	Sigma-Aldrich	P5147	Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8906-5G	Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate	Sigma-Aldrich	D2532
Albumin from bovine serum - ≥98%	Sigma-Aldrich	A7906
Eosin Y disodium salt	Sigma-Aldrich	E4382	Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds	Electron Microscopy Sciences	62352-15
Embedding rings	Fisher Scientific	22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps	VWR international	66020-326
Probe-on-plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm	VWR international	48404-452
Whatman paper 3mm	VWR international	89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack	Electron Microscopy Sciences	71420-25	Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers	Electron Microscopy Sciences	71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids			required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes			Help handing wax ribbons
Microtome			Leica
Self-cleaning dry vacuum system	Welch Allyn	2025
Slide warmer	Fisher Scientific
Heating block			needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C	Fisher Scientific		For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C	Fisher Scientific		Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood