Summary
O
Abstract
Com os avanços na pesquisa genômica da década passada, biologia vegetal tem visto apresentando numerosos estudos em larga escala as análises quantitativas de expressão gênica. Microarray e abordagens sequenciamento de última geração estão sendo usados para investigar processos de resposta de desenvolvimento, fisiológicos e stress, dissecar as vias epigenéticas e pequenos RNA, e construir redes de grande gene regulador 1-3. Embora essas técnicas facilitam a análise simultânea de conjuntos de genes de grande porte, que normalmente fornecem uma resolução muito limitado espaço-temporal das mudanças de expressão gênica. Esta limitação pode ser superada parcialmente usando perfis método em conjunto com lasermicrodissection ou fluorescência-ativado celular classificação 4-7. No entanto, para compreender plenamente o papel biológico de um gene, o conhecimento de seu padrão espaço-temporal de expressão em uma resolução celular é essencial. Particularmente, quando se estuda o desenvolvimento ou os efeitos de sti ambientaismuli e mutantes podem a análise detalhada do padrão de expressão de um gene tornam-se essenciais. Por exemplo, sutis diferenças quantitativas nos níveis de expressão de genes-chave de regulamentação pode levar a fenótipos dramática quando associada com a perda ou ganho de expressão, em tipos específicos de células.
Vários métodos são usados rotineiramente para a análise detalhada dos padrões de expressão gênica. Uma delas é através da análise das linhas de repórter transgênicos. Tal análise pode, no entanto, tornar-se demorado quando se analisa genes múltiplos ou trabalhando em plantas recalcitrantes a transformação. Além disso, uma validação independente para garantir que o padrão de expressão do transgene imita a do gene endógeno é normalmente necessária. Localização de proteínas imuno-histoquímica ou hibridização in situ mRNA apresentar alternativas relativamente rápido para a visualização direta da expressão do gene nas células e tecidos. Este último tem a vantagem que pode ser facilmente used em qualquer gene de interesse. A hibridização in situ permite a detecção de mRNAs em células-alvo por hibridização com um marcado sentido anti-RNA sonda obtida por transcrição in vitro do gene de interesse.
Aqui nós descrevemos um protocolo para a localização em situ da expressão gênica em plantas, que é altamente sensibilidade e específicos. Ele é otimizado para uso com paraformaldeído fixos, parafina seções, que dão excelente preservação da histologia, e sondas DIG-rotulados que são visualizados através da imuno-detecção e fosfatase alcalina-reação colorimétrica. Este protocolo tem sido aplicado com sucesso em uma série de tecidos a partir de uma ampla gama de espécies de plantas, e pode ser usado para analisar a expressão de mRNAs, assim como pequenos RNAs 8-14.
Protocol
1. Preparação de amostras
Nota: Todas as etapas até e incluindo a hibridação são sensíveis à atividade RNAse. Portanto, é essencial para o trabalho em condições limpas. Também é bastante comum para fazer todas as soluções RNase-free usando DEPC-tratada a água e copos cozido a 180 ° C por pelo menos 3 horas. Recipientes de plástico são frequentemente limpos por meio de tratamento com 0,2 N NaOH por 30 min. No entanto, nenhuma dessas precauções são essenciais e que normalmente uso regular limpa MilliQ H 2 O para todas as soluções. Fazemos manter reagentes separados, caixas e copos no hibridizações in situ e armazená-los em um armário limpo.
- Fixação da amostra
- Dia 1: Prepare frescos 4% paraformaldeído fixador (PFA). Para 500 ml, 400 ml quente 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH 7,0) a 60 ° C e dissolver dois pellets de NaOH. Em uma capela, adicione 20 g de paraformaldehyde e misture bem até dissolver. Coloque a solução em gelo e quando resfriado ajustar o pH para 7,2 com H 2 SO 4 (1-2 gotas para 100 ml). Em seguida, ajuste o volume para 500 mL com PBS 1x.
Nota: Não use HCl para ajustar o pH, pois isso irá liberar gases altamente tóxicos. Paraformaldeído é tóxico; esta solução deve ser preparada em um extractor de fumo e descartados de forma apropriada. Além disso, Paraformaldeído é armazenada a 4 ° C e deve ser comprado novo a cada 6-9 meses. - Colheita de amostras de tecido e colocá-los imediatamente em 15 mL fixador PFA fresco no gelo em frascos de cintilação de vidro. Se dissecção dos tecidos for necessário, este é o melhor feito no gelo em fixador frio.
Nota: É importante o uso de um grande excesso de fixador. O rácio recomendado é a utilização de 10 volumes de fixador para um volume de tecido. - Aplicar um vácuo (~ 500 mm Hg) para as amostras ao mesmo tempo no gelo. Segure um vácuo por 15-20 minutos; pequenas bolhas deve liberar a partir da amostras, mas o fixador não deve vir a uma fervura. Liberar o vácuo devagar, e renovar o fixador PFA para garantir o fixador permanece na concentração correta. Repita este passo até que os tecidos afundar após o lançamento do vácuo.
Nota: A fixação é necessário para corrigir e cross-link moléculas de RNA dentro do tecido. Esta etapa é fundamental como materiais mal fixa produzir um sinal de baixa. Alguns tecidos não afundar imediatamente, mas a maioria acabará por afundar durante a noite. Para melhorar a infiltração do fixador, os seguintes detergentes podem ser adicionados: Triton até 0,1% e / ou Tween até 0,1 - 0,3%. Alternativamente, o etanol baseado em fixadores, tais como formaldeído-álcool-ácido ácido (FAA), pode ser usado para tecidos que não são outra forma facilmente infiltrada 14,15. - Substituir o fixador PFA mais uma vez e manter os frascos a 4 ° C durante a noite.
- Dia 1: Prepare frescos 4% paraformaldeído fixador (PFA). Para 500 ml, 400 ml quente 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH 7,0) a 60 ° C e dissolver dois pellets de NaOH. Em uma capela, adicione 20 g de paraformaldehyde e misture bem até dissolver. Coloque a solução em gelo e quando resfriado ajustar o pH para 7,2 com H 2 SO 4 (1-2 gotas para 100 ml). Em seguida, ajuste o volume para 500 mL com PBS 1x.
- Incorporação de tecido
- Dia 2: Pré-cool 1x PBS ea série de etanol a 4 ° C.
- Lavar o twi amostrasce de 30 min cada um em 1x PBS, no gelo.
Nota: Novamente, é recomendado o uso de um grande excesso de cada solução. - Desidratar as amostras, levando-os através de uma série de etanol, no gelo, como segue:
- 10% de etanol 30 min,
- 30% de etanol 30 min,
- 50% de etanol de 1 hora,
- 70% de etanol de 1 hora,
- 85% de etanol de 1 hora,
- 95% de etanol uma hora,
- 3 mudanças de etanol a 100% para cada 1 hora
- No final do dia, substituir o etanol por Eosina 0,1% em etanol 100% durante a noite a 4 ° C. Eosina manchas da parede celular tornando as amostras mais visível durante a incorporação e de corte.
Notas: Os tempos indicados aqui foram optimizados para blocos de 3x3x3 mm, mas incubações mais longos podem ser necessários para amostras maiores.
Amostras podem ser armazenadas em etanol 70% a 4 ° C por vários meses. Dia 3: Na manhã seguinte, aquecer as amostras à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, substitua o etanol gradualmente com histoclear da seguinte forma:
- No final do dia, adicione 1 / 4 do volume de Paraplast Além disso chips e coloque o frasco em um forno de 60 C °. Também encher um copo com chips Paraplast e repor isso com freqüência, a fim de ter sempre de cera recém-fundido a mão.
Nota: A temperatura do forno de aquecimento é importante e prolongado de Paraplast acima de 60 ° C devem ser evitadas. - Dia 4: Aos poucos, substituir o histoclear com Paraplast regularmente adicionando mais fichas de parafina (a cada hora). No final do dia, com cuidado despeje a mistura histoclear / cera e imediatamente substituí-lo com cera derretida puro. Deixar as amostras a 60 ° C durante a noite.
- Dias 5 e 6: Alterar o Paraplast 3 vezes ao dia, a cada 4 horas, com a cera derretida fresco mantendo a splos a 60 ° C.
Nota: É possível mudar a cera apenas uma vez por dia, mas a preparação do tecido iria demorar alguns dias extra para completar, como a cera precisa ser mudado, pelo menos, 5 ou 6 vezes. Infiltração a vácuo das amostras de tecidos quando estes estão em / e 100% EtOH ou em cera pode melhorar ainda mais a infiltração e incorporação dos tecidos. Infiltração a vácuo de amostras de cera deve ser feito a 60 ° C. - Dia 7: Alterar a cera mais uma vez. O cheiro de histoclear deve ter desaparecido completamente, e as amostras podem ser incorporados mais tarde naquele dia.
- Configurar uma placa de aquecimento grandes a 60 ° C protegido por papel alumínio.
- O método de incorporação irá variar dependendo do tipo de tecido a ser analisado. O ponto mais importante nesta etapa é garantir que as amostras são orientados corretamente para corte depois. Uma maneira é a utilização de moldes de plástico e anéis. Aquecer os moldes sobre a placa de aquecimento e derramar cera derretida na parte inferior do molde. Transferênciauma amostra de tecido para o molde com uma pinça aquecida e orientá-la na posição desejada. Coloque o anel branco no molde e adicionar cera derretida adicionais, tais que os tecidos são cobertos completamente. Mover cuidadosamente o molde do prato para o banco. Deixe a cera esfriar gradualmente.
Outra possibilidade é distribuir todas as amostras numa placa de Petri contendo cera derretida (as amostras devem ser completamente coberto por cera), enquanto trabalhava na placa de 60 ° C aquecidos. Orientar as amostras com uma pinça quente. No final, desligue o prato. Quando a cera é solidificado, a placa de Petri pode ser movido para o banco e depois armazenar a 4 ° C. Quando estiver pronto para corte, pequenos blocos contendo uma amostra de tecido pode ser cortado da placa de Petri com uma lâmina aquecida e montado em um porta-espécime micrótomo com uma queda extra de cera derretida. Deixe a amostra endurecer por alguns minutos antes do corte.
Nota: Os blocos podemser armazenado a 4 ° C durante 1 ano ou mais. Para mais dicas úteis sobre a fixação do tecido e incorporação, ver ref. 16
2. Preparação sonda
- Clonagem
Sondas normalmente são gerados a uma ou mais regiões específicas do gene de interesse. Seqüências altamente repetitivas devem ser excluídos da sonda, mas as sequências correspondentes aos domínios de proteína conservada, como DNA-binding motivos em fatores de transcrição, tipicamente renderá padrões de expressão de genes específicos 8,9,12,15 (Fig. 1). Isto porque a RNAse Um tratamento nas etapas pós-hibridação (veja abaixo) reduz o nível de sonda de hibridação cruzada entre os membros da família de genes. RNAse A cliva a desajustes em duplexes de RNA, as sondas hibridizadas fragmentar para transcrições com complementaridade imperfeita, que será lavado em etapas subseqüentes.
Em geral, várias sondas podem precisar de ser testado para cada gene de interesse. Sondas podem ser tão curtos como 150 bases de comprimento. Although não há limite para o comprimento da sonda, os fragmentos mais curtos, em seguida, 1,5 kb normalmente transcrever melhor. Fragmentos de DNA a ser transcritos são clonados em um vetor contendo T3, T7 ou SP6 promotores (por exemplo, pCRII-TOPO, Invitrogen). Alternativamente, T3, T7 ou SP6 seqüências promotor pode ser incluído como um 5'-cauda no primer reverso usados para amplificar a região da sonda.
Em cada experimento em hibridização in situ, que incluem uma sonda controle positivo para o qual o padrão de hibridização é conhecida e que funciona de forma consistente, bem como um controle negativo (Figura 1D e H). Esta poderia ser uma sonda de RNA aleatórias que não é conhecida a hibridizar a qualquer transcrições no tecido de interesse. Embora seja comum o uso da sonda sentido do gene em análise, isso não é necessário e qualquer RNA não-hibridação irá atender o objetivo. Se estiver disponível, os tecidos de um alelo nulo de transcrição do gene de interesse serviria como um excelente controle negativo. - Linearizar o plasmídeo por digestão de aproximadamente 5 mg de DNA com uma enzima de restrição que digere no final da inserção em frente ao local do promotor. Não use enzimas de restrição que deixam uma saliência 3'-. Isso pode levar a artefatos de transcrição, pois o excesso de polimerase pode utilizar os 3 "como um substrato para continuar a transcrição. Alternativamente, a região, incluindo a sonda T3, T7 ou SP6 promotor pode ser amplificado por PCR para gerar o modelo de DNA para a reação de transcrição in vitro.
- Confira uma alíquota sobre um gel para verificar que a reação tem ido para a conclusão.
- Extrair o DNA com clorofórmio fenol /, precipitado com etanol e ressuspender o sedimento de DNA em MilliQ H 2 O a uma concentração de 1μg/μl. Alternativamente, o DNA pode ser limpo usando colunas de purificação de DNA padrão.
- Configurar a reação de transcrição in vitro através da mistura:
- 1μl purified DNA (1μg/μl)
- Tampão de transcrição 2μl 10x
- 2 mL 10x DIG RNA mix rotulagem
- 1μl RNAse OUT
- 2μl T3, T7 ou SP6 RNA polimerase (20 U / mL)
- H 2 O até 20μl.
Incubar a 37 ° C por 1 a 2 horas. Mantenha 1μl para analisar em um gel mais tarde.
Nota: as sondas de fluorescência-rotulados são preferidas em sistemas de animal, mas devido à alta auto-fluorescência de tecidos mais plantas, Na protocolos de hibridização in situ para as plantas usam sondas radiolabeled 17 ou mais comumente DIG sondas marcadas que são detectados por imuno-histoquímica. - Remover o modelo de DNA pela adição de 75 mL H 2 O MilliQ e 5 mL RQ1 DNAse (1 U / mL) para a reação de transcrição e incubar a reação a 37 ° C por 10 min.
- Purificar a reação de transcrição in vitro para eliminar não-incorporadas nucleotídeos e transcrições de pequeno porte. Uma possibilidade é usar um tamanho-exclusão Sephadex ® coluna, como o mini-colunas Giro Rápido RNA (Roche). Alternativamente, a reação de transcrição pode ser purificado por uma chuva LiCl / etanol convencional (ver ref. 14). Mantenha 1μl para verificar em um gel mais tarde.
- Sondas de mais de 250 bases de comprimento geralmente são parcialmente hidrolisado para obter moléculas de RNA de aproximadamente 150 nt e, portanto, pequeno o suficiente para penetrar de forma eficiente as secções de tecido. Adicionar um volume igual de tampão carbonato de 2x (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na 2 CO 3) para a reação de transcrição purificada e incubar a 60 ° C. O tempo de incubação deve ser calculada pela seguinte fórmula:
tempo = (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
onde Li = comprimento da sonda inicial (em kb); Lf = comprimento da sonda final (0,150 kb); K = 0,11 kb / minuto. Manter 2 mL para verificar em um gel. - Neutralizar a reação de hidrólise, adicionando 1 / 20 volume de 10% de ácido acético.
- A sonda é então puricadas pela adição de 1μl de tRNA (100mg/ml), 1 / 10 do volume NAAC 3M pH 5,2, mais 2,5 volumes de etanol 100% frio, e incubar a -80 ° C por 30 min. Precipitar o RNA por centrifugação a 13.500 rpm por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e lavar o pellet com etanol RNA 500μl de 70%. Centrifugar novamente, deixe o pellet ar seco (geralmente cerca de 15 min) e ressuspender o RNA em 50μl formamida deionizada 50%. A sonda deve ser armazenado a -80 ° C até o uso.
- Verificação de um 1% regulares TAE-agarose gel o produto final, bem como produtos intermediários das seções 2.2.4, 2.2.6 e 2.2.7 (Figura 2A). Este permite o monitoramento da eficiência da reação de transcrição in vitro.
Nota: A reação de transcrição in vitro deve render cerca de 1 mg de RNA por 1 mg de modelo. - Dot blot
A concentração da sonda e DIG-UTP incorporação pode ser avaliada por análise dot blot (Figura 2B). R SerialNA diluições são manchadas em uma membrana de hibridização padrão ao lado de um RNA controle rotulado de concentração conhecida. Por exemplo, usamos o DIG-UTP rotulados controle RNA sonda incluídos no kit de transcrição in vitro (Roche). É melhor testar várias diluições para cada sonda para estabelecer uma concentração exata.- Prepare tampão de bloqueio através da dissolução de 0,5% de reagente de bloqueio no 1x TBS buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) a 70 ° C, em seguida, deixar arrefecer a solução à temperatura ambiente.
- 1μl local de diluições em série (tipicamente 10 -1 a 10 -5) das sondas in vitro transcritas e controle em uma N + membrana de nylon. Fixar o RNA por UV cross-linking.
Nota: A superfície mínima da membrana deve ser usado para reduzir o volume de buffers necessário mais tarde. - Equilibrar a membrana no TBS 1x por 5 min à temperatura ambiente (RT) em uma plataforma de agitação.
- Bloco da membrana usando o bloqueiotampão por 30 min à temperatura ambiente em uma plataforma de agitação.
- Lave a membrana no TBS 1x por 5 min.
- Incubar a membrana com anticorpo anti-DIG, diluindo 1μl de Anti-digoxigenina-AP, em 10 ml de 1x TBS, durante 45 min à temperatura ambiente.
- Lavar a membrana duas vezes em TBS 1x por 15 min cada.
- Equilibrar a membrana em 1x TN buffer (100mM Tris-HCl pH 9.5, NaCl 100mM) por 5 min.
- Mancha da membrana por incubação com NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) em tampão 1x TN. Coloração pode demorar 5-10 minutos. Depois enxágüe com água da membrana, que pode então ser secas e guardadas como um registro.
Nota: NBT / BCIP é um substrato para a fosfatase alcalina conjugada ao anticorpo anti-DIG que após a hidrólise produz um corante azul escuro.
3. Seccionamento
- Quentes os blocos à temperatura ambiente. Se os blocos são muito frios, seções individuais podem rolar sem formar 'fita' a cera. Cortar o bloco em um trapézioforma Zoid deixando cerca de 1 milímetro de cera ao redor da amostra.
- Aquecer um slide grande mais quente a 35-37 ° C.
Nota: Muitos protocolos fazer isso passo a 42 ° C no entanto reduzir a temperatura de 35-37 º C previne a formação de bolhas nas seções. - Coloque o bloco para o micrótomo de tal forma que o mais longo dos dois faces paralelas está no fundo. Cuidadosamente levar o bloco para a frente para a lâmina e certifique-se que a superfície do bloco é paralelo ao da lâmina. Seção com uma espessura de 8 - 10μm. As fitas de cera podem ser alinhados em uma superfície não-pegajoso, tais como folha de alumínio ou papel de filtro, para selecionar seções de interesse. Isto pode ser avaliada através de um microscópio de dissecação nas proximidades.
Nota: A eosina do tecido fornece uma indicação sobre se os tecidos tenham sido devidamente infiltrado durante a incorporação. Se o centro do bloco não é corado com eosina isso geralmente indica que o tecido é mal fixo. - Mark Probe-on Além disso slides com um lápis (mais canetas ou marcadores são apagados durante o no protocolo de hibridização in situ) e distribuir 1mL de limpeza MilliQ H 2 O para ele. Cuidadosamente flutuar seções de interesse na superfície da água à temperatura ambiente (é mais fácil manipular as seções sobre a água quando se trabalha em temperatura ambiente). Garantir que o lado brilhante (na parte inferior como a fita sai do micrótomo) enfrenta a água. Em seguida, transferir a lâmina lentamente para o mais quente de slides. Aquecimento contribui para as seções espalhadas sobre a superfície da água. Após 5 min, despeje a água com cuidado, mas em um movimento suave, por isso a fita é baixada para o slide. Deixe os slides secar por pelo menos várias horas ou durante a noite a 37 ° C, de modo que o tecido adere.
Nota: o tecido a um corte podem ser armazenados em uma caixa com dessecante de sílica por alguns dias ou semanas a 4 ° C, no entanto, é melhor usar o slides o mais rapidamente possível.
4. Em híbrido situização
- Seção de pré-tratamento
O volume necessário para cada solução dependerá, obviamente, o número de slides a ser tratada e do tamanho do recipiente utilizado. As seções devem sempre estar completamente submerso. Para um rack de 25 slides e um recipiente perfeitamente adequado, 200-250 ml é suficiente. Porque muitas das etapas de incubação é muito curto, geralmente preparar todas as soluções possíveis e depois iniciar o slide pré-tratamentos. No entanto, a solução de anidrido acético deverá ser preparado imediatamente antes da utilização e protease é adicionado no momento do uso. Todas as etapas são realizadas em temperatura ambiente, a menos que indicado de outra maneira. Além disso, todos os buffers podem ser preparados na concentração 10 vezes como uma solução estoque.- Aqueça o buffer de protease (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) no recipiente a 37 ° C.
- Deparaffinize e hidratar as secções de tecido como se segue:
- histoclear - 10 min (use um prato de vidro)
- histoclear - 10 min (use umprato de vidro)
- Etanol 100% - 1 min
- Etanol a 100% - 30 sec
- Etanol a 95% - 30 sec
- 85% de etanol - 30 sec
- Etanol 70% - 30 sec
- Etanol a 50% - 30 sec
- Etanol 30% - 30 sec
- 10% de etanol - 30 sec
- MilliQ H 2 O - 1 min
- Incubar em PBS 1x por 2 min.
- Mix 625μl de protease 50mg/ml em 250 ml de buffer protease pré-aquecido a 37 ° C e incubar as lâminas por 20 min a 37 ° C.
Nota: A protease é necessária para digerir proteínas fixo e aumentar o acesso da sonda de RNAs celulares. É fundamental para controlar o tempo de incubação para maximizar o sinal de hibridização sem repartição do tecido, portanto, alguma otimização pode ser necessário para cada amostra de tecido. - Neutralizar a atividade da protease em glicina 0,2% em PBS 1x por 2 min.
- Enxaguar as lâminas uma vez em PBS 1x por 2 min.
- Tratar os slides in 4% PFA solução por 10 min para voltar a fixar o RNA que poderá ser danificada pelo tratamento protease.
- Enxaguar as lâminas duas vezes em PBS 1x por 2 min cada um.
- Enquanto os slides estão no PBS lavagens, compõem 250 ml de 0,1 M pH 8,0 trietanolamina misturando 12,5 ml de trietanolamina 2M (29.8g em 100ml MilliQ H 2 O, pH8.0 com HCl) em 236,25 ml H 2 O MilliQ em um prato de vidro. Adicionar 1,25 ml de anidrido acético para o buffer de trietanolamina imediatamente antes de colocar os slides, e mexa bem. Depois de adicionar os slides, continue a mexer lentamente por 10 minutos.
Isto requer que o porta-lâminas é elevada no recipiente de trietanolamina / anidrido acético. Usamos um sistema de fixação com suporte de apoio.
Nota: Nesta etapa, carregada positivamente grupos amino que podem levar a ligação não específica da sonda estão acetilados. Além disso, o anidrido acético é tóxico; esta solução deve ser preparada em um extractor de fumo e descartados de forma apropriada <./ Li> - Enxaguar as lâminas duas vezes em PBS 1x por 2 min.
- Desidratar as secções de tecido novamente:
- H 2 O - 1 min
- 10% de etanol - 30 sec
- Etanol 30% - 30 sec
- Etanol a 50% - 30 sec
- Etanol 70% - 30 sec
- 85% de etanol - 30 sec
- Etanol a 95% - 30 sec
- Etanol a 100% - 30 sec
- Etanol a 100% - 30 sec
- Hibridização
- Aquecer um bloco de aquecimento a 85 ° C.
- Preparar o tampão de hibridação. Para 10 ml da mistura, em um tubo Falcon 1,25 ml em sais de hibridização in situ (3M NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8,0, fosfato de sódio 100mM pH6.8, 50 mM EDTA), 5 ml formamida deionizada, 2,5 ml de sulfato de Dextran 50%, 250 mL 50x Denhardt, 125 mL 100mg/ml tRNA, e 875 mL H 2 O. <br /> Nota: sulfato de Dextran é muito viscoso, por isso é melhor para pré-aquecer a solução a 60 ° C para tornar a pipetagem mais fácil. Tampão de hibridação pode ser armazenar a -20 ° C.
- Prepare as sondas diferentes. Para cada slide, misture 1 sonda mL com 9 mL MilliQ H 2 O e 10 mL formamida deionizada. Aqueça a sonda a 85 ° C por 2-3 min, imediatamente frio no gelo, brevemente centrífuga, e adicione a sonda para Pipete 80 tampão de hibridação por slide. Misture bem por pipetagem, mas evitar fazer bolhas.
Nota: A quantidade de sonda a ser adicionada por slide precisa ser testado empiricamente. Geralmente, as sondas são usadas em uma concentração final de 0,5 complexidade sonda ng / kb / mL. Desde hibridações são realizadas com 100 l por lâmina de aproximadamente 25 ng da sonda é necessária por lâmina para detecções que são de 0,5 kb de comprimento e 50 ng da sonda por lâmina para detecções que são 1-kb de comprimento. Para simplificar, nós muitas vezes tentam 0,5, 1 e 4 mL da sonda por slide. - Colocar as lâminas em umlimpar a superfície e deixe-os secar completamente por 5-10 minutos. Pipeta a mistura de buffer sonda / hibridação para a borda direita do slide. Baixar gradualmente uma lamela sobre a lâmina, certificando-se que a solução de hibridização abrange todos os sectores, sem quaisquer bolhas. Toque na lamela levemente com o dedo onde bolhas de formulário para deslocá-los de todas as seções do tecido. Não puxe a tampa escorregar, pois isso irá danificar as seções.
Nota: Um método alternativo comumente utilizada para esta etapa é preparar "sanduíches" de duas lâminas que são incubadas com a mesma sonda. Para mais detalhes sobre este método, ver ref. 14. - Preparar uma câmara de umidade em uma caixa plástica perfeitamente plano. Cubra o fundo da caixa com papel Whatman umedecido com água MilliQ, coberto com o papel parafilme deixando os cantos descoberto; colocar o slides na caixa de plástico e feche a caixa de força.
- Incubar as lâminas à temperatura de hibridização desejada, tipicamente 50-55 ° C, fou 16-20 horas.
- Para uso na manhã seguinte, prepare um litro 0.2x SSC e armazenar esta a 55 ° C. Além disso, prepare um tampão NTE litros (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA pH8.0) e armazenar a 37 ° C.
- Pós-tratamento de hibridização
- Retirar as lamelas com cuidado para não danificar as seções. Colocar as lâminas em um rack e lavá-los duas vezes na 0.2x SSC a 55 ° C durante uma hora.
Nota: Lamelas muitas vezes caem facilmente quando os slides são colocados na posição vertical. Se a lamela permanece presa, mergulhar a lâmina em água morna 0.2x SSC para 1 ou 2 min para lavar a lamela off. Evite puxar a lamela da lâmina, pois isso pode causar danos às seções. - Nesse meio tempo, prepare 500 ml tampão de lavagem (1% BSA, triton 0,3% em TBS buffer) e 100 ml de solução de bloqueio (0,5% bloqueio reagente em TBS buffer). Agitar o pó de bloqueio em TBS que está lentamente aquecido a 70 ° C e deixe esfriar à temperatura ambiente, uma vez dissolved.
Nota: Os volumes de tampão de lavagem e solução de bloqueio necessários irão variar, dependendo do tamanho da caixa de plástico plana utilizada em medidas 4.3.8 -11. Vai levar algum tempo para dissolver completamente Triton, de modo a preparar solução suficiente antecedência. - Equilibrar as lâminas em NTE 1x por 2 min.
- Proceder à RNAse Um tratamento através da transferência de slides em 1x tampão NTE ao qual 20μg/ml RNAse A é adicionado um pouco antes use, incubar a 37 ° C por 30 min.
Nota: RNAse A cliva livre single-stranded RNA, bem como em desencontros em duplexes de RNA. Este passo ajuda a reduzir o nível de ligação não específica da sonda, como clivada fragmentos são lavados fora sondado nos últimos 0.2x SSC lavagem (ver 4.3.6). - Enxaguar as lâminas duas vezes em 1x NTE de 2 min cada um.
- Lavar as lâminas em fresco 0.2x SSC a 55 ° C durante uma hora.
- Equilibrar as lâminas em PBS 1x por 5 min à temperatura ambiente.
- Transferir as lâminas do rack para thfundo e de uma caixa plana de plástico e cobri-los com um volume mínimo de solução de bloqueio. Bloquear os slides por 45 min em uma plataforma balançar lentamente.
- Transferir as lâminas para uma caixa de plástico segunda plana e limpa e lave-os por 45 minutos com tampão de lavagem em uma plataforma de agitação.
- Proceder à incubação de anticorpos. Diluir o anticorpo anti-digoxigenina em tampão de lavagem (1:5 v / v) e quer aplicar um volume mínimo diretamente em cada slide ou colocar a lâmina em uma caixa plana de plástico e cobri-los com um volume mínimo de solução de anticorpos. Incubar as lâminas no escuro por 2-3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar as lâminas 4 vezes por 15 min cada com tampão de lavagem de agitação da plataforma. Use um volume mínimo de tampão de lavagem e uma caixa de plástico plana. Limpe a caixa de plástico entre cada uma das lavagens.
Nota: A limpeza da caixa entre as lavagens vai reduzir o contexto geral no slide. Para simplificar, vamos usar duas caixas idênticas planase transferir os slides em uma caixa limpa após cada lavagem. - Transferir as lâminas em 1x TBS por 2 min.
- Equilibrar as lâminas em tampão TN duas vezes por 2 min cada um.
- Prepare solução de coloração imediatamente antes do uso pela adição de 20 mL NBT / BCIP por um tampão TN ml. Despeje a solução de coloração em um prato de plástico pequeno e pesagem. Sanduíche de duas lâminas juntamente com as seções de frente para o outro. Dip um lado longo do sanduíche na solução, permitindo que a ação capilar para puxar para cima a solução. Escorra os slides em uma Kimwipe e preencher as lâminas com solução de anticorpos novamente. Você pode precisar tocar os slides como a solução flui para evitar bolhas. Coloque os slides em uma caixa de plástico e armazenar em temperatura ambiente no escuro.
- Dia 10 a dia 15: Atualizar a solução de coloração duas vezes por dia para 1-5 dias, enxaguando as lâminas em tampão TN e preparar sanduíches nova contendo solução de coloração fresca.
Nota: Substituir a solução de coloração em int regulareservals irá melhorar a relação sinal de fundo. Desenvolvimento do sinal pode ser monitorado em um composto ou estereomicroscópio. É possível fotografar as seções, enquanto eles estão em tampão TN entre as rodadas de coloração ou, uma vez que são transferidos para a água um pouco antes de montagem permanente.
- Retirar as lamelas com cuidado para não danificar as seções. Colocar as lâminas em um rack e lavá-los duas vezes na 0.2x SSC a 55 ° C durante uma hora.
- Montagem
- Uma vez que o sinal é óbvio, lavar as lâminas em H 2 O MilliQ e desidratar-los rapidamente através de uma série de etanol:
- 10% de etanol - 10 s
- Etanol 30% - 10 s
- Etanol a 50% - 10 s
- Etanol 70% - 5 s
- Etanol 80% - 5 s
- Etanol a 95% - 5 s
- Etanol a 100% - 5 s
- histoclear - 2 min
- histoclear - 2 min
- Montar os slides, colocando uma ou duas gotas de Tolueno baseada meio de montagem em cada deslizoue e, lentamente, diminuindo a lamela sobre a lâmina evitando a formação de bolhas. Deixar o meio de montagem endurecer durante a noite antes de analisar o resultado sob um microscópio composto. Uma vez montado, slides podem ser armazenados durante anos em temperatura ambiente.
- Uma vez que o sinal é óbvio, lavar as lâminas em H 2 O MilliQ e desidratar-los rapidamente através de uma série de etanol:
5. Resultados representativos:
Depois de 1-5 dias, um sinal vermelho-púrpura irá desenvolver nessas células, onde a sonda tem hibridizado com transcrições complementares (Figura 1). O sinal de cor, portanto, fornece uma visualização direta em resolução celular do padrão de expressão do gene de interesse. A coloração de fundo mais fraco também pode se desenvolver, resultante da ligação não específica da sonda ou a coloração dos tecidos da planta (Figura 3). Sinal de fundo como pode ser relativamente mais acentuada nas pequenas, as células menos determinado do tecido, mas a coloração de fundo também seria observado em seções hibridizado às sondas de controle negativo e positivo e nãoser reprodutível entre experimentos.
Figura 1. Resultados representativos obtidos com sondas de diferentes tecidos de Arabidopsis e milho. Em hibridizações in situ de Arabidopsis (AD) e milho (EH) de tecidos com diferentes sondas gene específico que ilustra o tipo de resultados que podem ser esperados após a conclusão bem sucedida do protocolo apresentado. (A) Localização da SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) no ápice vegetativo Arabidopsis atirar; nota a presença de sinal de azul, púrpura nas células indeterminadas do meristema ea falta de sinal nas folhas vizinhas. (BD) Seções de Arabidopsis embriões em estágio torpedo mostrando CLAVATA3 (B) expressão nas poucas células-tronco embrionárias, AtML1 expressão (C) na camada epidérmica, ea falta de sinal em seções sondadas com um random controlo negativo RNA (D). (E) Localização do knotted1 homólogo STM no embrião de milho em desenvolvimento; observe o sinal forte especificamente no meristema embrionário e raiz. (FH) seções longitudinais através do ápice vegetativo do milho disparar mostrando distintos nos padrões de hibridização in situ para arf3a (F) e ocl4 (G) e nenhum sinal de hibridação para a sonda controle negativo (H). arf3a é expressa na superfície inferior das folhas / inferior, enquanto o homólogo ocl4 AtML1 se expressa especificamente na epiderme.
Os fragmentos de gene seguir foram usados como sonda: STM: a região que engloba cDNA aminoácidos 81-382, que inclui a homeodomínio conservada; CLV3: o comprimento total cDNA; AtML1: o exon terceiros; KN1: o quadro de leitura aberto todo; arf3a: nucleotídeos 9-225 clone de cDNA HM004539; ocl4: 3 '1,7 kb de todo o comprimento cDNA, que inclui vários domínios de proteína conservada.
Figura 2. Controlo dos pontos ao fazer em sondas de transcrição in vitro. (A) Em sondas de hibridização in situ são verificados em um padrão de gel de agarose após a transcrição in vitro (a), depois de DNase tratamento e purificação subseqüente do in vitro a reação de transcrição (b), depois de carbonato de hidrólise-se necessário (c) e quando pronto para uso (d). Para sondas de mais de 250 bp de comprimento, tais como sonda 1, o carbonato de hidrólise trará uma série de fragmentos menores sonda (suporte). (B) quantificação colorimétrica de sondas por dot blot. Diluições que variam de 10 -1 a 10 -5 de uma sonda de 100 ng / mL (1) e de três recém-DIG-sondas marcadas (2-4) são vistos em uma membrana de transferência, incubadas com anticorpo anti-DIG, e analisadas utilizando o ensaio colorimétrico descrito na secção 2.3 do protocolo. A análise sugereas seguintes concentrações estimadas: sonda 2, ~ 100 ng / mL; sonda 3, ~ 10 ng / mL sonda 4, ~ 1 ng / mL. Probe 4 é pouco provável que um bom rendimento em sinal de hibridização in situ.
Figura 3. Comparação de uma sonda não-específica a uma sonda bem trabalho. Cortes longitudinais por meio do ápice vegetativo do milho disparar mostrando um sinal de fundo não-específicos (A) e um específico em sinal de hibridização in situ para a sonda OCL5 na camada celular externa (B).
Figura 4. Diagrama mostrando o cronograma de etapas no no protocolo de hibridização in situ. Passos de incorporação do tecido são indicados em verde, sonda de preparação de etapas em laranja, e em passos de hibridização in situ em azul. Este cronograma considera que o templa DNAte para a transcrição in vitro da sonda está disponível. Blocos de parafina-embedded tecido e DIG sondas marcadas pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C e -80 ° C, respectivamente, até o tempo de uso. O protocolo de hibridização in situ pode então ser concluída em menos de quatro dias.
Discussion
O método de hibridização in situ descrito aqui permite a visualização direta do padrão de expressão espaço-temporal de qualquer gene de interesse, com resolução de celular grande, de alta sensibilidade e especificidade. O protocolo não permite uma comparação quantitativa dos níveis de expressão entre os genes. No entanto, de alta sensibilidade do método e da resolução pode revelar gradientes de expressão de genes dentro de um tecido de 8, 18, que não é possível com a maioria dos outros métodos de análise de expressão gênica.
O protocolo inclui várias etapas, que podem fazer de resolução de problemas problemático. Os passos mais críticos do protocolo são a fixação do tecido e da seleção e rotulagem da sonda. Tecidos mal infiltrado e sondas com incorporação DIG baixa renderá sinais muito fracos que podem ser difíceis de detectar acima de fundo. Para cada novo gene de interesse, é aconselhável tentar algumas sondas distintas derivadas de difealugar regiões da transcrição. Ocasionalmente, duas ou três sondas de segmentação diferentes regiões menores do gene pode precisar ser combinados para obter um sinal forte e hibridização específica. Além disso, as condições de hibridização, como a temperatura ea composição do tampão de hibridação, pode ser otimizado para cada gene ou tecido para diminuir ou aumentar o rigor de hibridização. Também a etapa de tratamento protease é uma variável e pode ser alterado para adaptar o protocolo para diferentes espécies de plantas ou para a detecção de transcritos com abundância muito baixa. A inclusão de ambas as sondas de controlo positivo e negativo será útil na identificação de pontos problemáticos do protocolo.
O procedimento é otimizado para parafina cortes de tecidos vegetais, mas com pequenas modificações podem ser usados também para todo o monte de hibridização in situ. Embora amplamente utilizados em animais de pesquisa 19, montar toda a hibridização in situ será limited de tecidos vegetais que podem ser facilmente infiltrado, como embriões, raízes ou jovens tecidos meristemáticos 20,21. O protocolo também pode ser facilmente modificado para detectar simultaneamente dois mRNAs distintos ou localizar transcrições junto proteínas 15,22,23. Finalmente, é possível estender a aplicação deste método para a visualização de pequenas padrões de expressão do RNA em plantas. padrões de expressão de miRNA foram determinados utilizando este protocolo em ambos milho e Arabidopsis 8,14. Mais recentemente, o em sondas transcritos in vitro foram substituídos por comercialmente disponíveis DIG marcado bloqueado ácidos nucleicos (LNA) sondas oligo que aumentam a sensibilidade do sinal 18, 24.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa no laboratório de MT é suportado por concessões do National Science Foundation (DBI-0820610-1022102 e IOS) e do Departamento de NY da Saúde (NYSTEM-C024308). CM recebeu bolsas de pós-doutorado do Ministério espanhol da Educação e Ciência (2007-0937) e da Fundação Rafael del Pino, Espanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
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