Summary
Protocol
1. Пробоподготовка
Примечание: Все шаги, вплоть до гибридизации шаг чувствительны к активности РНКазы. Поэтому крайне важно для работы в чистых условиях. Кроме того, довольно часто, чтобы все решения без РНКазы с помощью DEPC-очищенной воды и стекла запекать при 180 ° С в течение не менее 3 часов. Пластиковые контейнеры часто очищают с помощью лечения 0,2 N NaOH в течение 30 мин. Тем не менее, ни одна из этих мер предосторожности необходимы, и мы обычно используем регулярные чистой MilliQ H 2 O для всех решений. У нас вести раздельный реагентов, ящики и изделия из стекла для гибридизации на месте и хранить их в чистую кабинета.
- Пример фиксации
- День 1: Подготовьте свежий 4% параформальдегида (PFA) фиксатором. Для 500 мл, 400 мл теплой 1x PBS (130 мМ NaCl, 7 мМ Na 2 HPO 4, 3 мМ NaH 2 PO 4 pH7.0) до 60 ° С и растворить две гранулы NaOH. В вытяжной шкаф, добавить 20 г paraformaldehyде и тщательно перемешать до полного растворения. Место решения на льду и при охлаждении регулирования рН до 7,2 с H 2 SO 4 (1-2 капли на 100 мл). Затем отрегулировать громкость до 500 мл с 1x PBS.
Примечание: Не используйте HCl для регулирования рН, так как это релиз высокотоксичных газов. Параформальдегид является токсичным, это решение должно быть подготовлено в вытяжной шкаф и утилизировать. Кроме того, Параформальдегид хранится при температуре 4 ° C и должны быть куплены новыми каждые 6 - 9 месяцев. - Урожай образцы ткани и поместите их сразу в 15 мл свежего фиксатора PFA на льду в стеклянные флаконы сцинтилляционные. Если ткань вскрытия не требуется, это лучше всего делать на льду в холодное фиксатором.
Примечание: Очень важно использовать большой избыток фиксатором. Общая рекомендуемое соотношение является использование 10 томов фиксатором на 1 объем ткани. - Применение вакуума (~ 500 мм рт.ст.) к образцам в то время как на льду. Держите вакуум в течение 15-20 минут; маленькие пузырьки должны освободить от образцае годы, а фиксатор не должен прийти к кипению. Выпуск вакуум медленно, и возобновить фиксатором PFA для обеспечения фиксатором остается на правильное сосредоточение. Повторите этот шаг, пока ткани раковину после освобождения из вакуума.
Примечание: Фиксация требуется исправить и сшивки молекул РНК в тканях. Этот шаг является критическим, как слабо закрепленные материалы урожай низкий сигнал. Некоторые ткани не тонут сразу, но большинство из них будет в конечном итоге раковину в одночасье. Для улучшения проникновения фиксатора, следующие моющие средства могут быть добавлены: Тритон до 0,1% и / или Tween до 0,1 - 0,3%. Кроме того, этанол основе фиксаторов, такие как формальдегид, спирт-кислых кислот (FAA), могут быть использованы для тканей, которые в противном случае не легко проникли 14,15. - Замените фиксатор PFA еще раз и держать флаконах при температуре 4 ° С в течение ночи.
- День 1: Подготовьте свежий 4% параформальдегида (PFA) фиксатором. Для 500 мл, 400 мл теплой 1x PBS (130 мМ NaCl, 7 мМ Na 2 HPO 4, 3 мМ NaH 2 PO 4 pH7.0) до 60 ° С и растворить две гранулы NaOH. В вытяжной шкаф, добавить 20 г paraformaldehyде и тщательно перемешать до полного растворения. Место решения на льду и при охлаждении регулирования рН до 7,2 с H 2 SO 4 (1-2 капли на 100 мл). Затем отрегулировать громкость до 500 мл с 1x PBS.
- Ткань вложение
- День 2: Предварительное охлаждение 1x PBS и этанола серии при 4 ° C.
- Промыть образцы TWIсе в течение 30 минут в каждом из 1x PBS, на льду.
Примечание: Опять-таки, рекомендуется использовать большой избыток каждого решения. - Дегидрировать образцы, взяв их с помощью этанола серии, на льду, выглядит следующим образом:
- 10% этанола 30 мин,
- 30% этанола, 30 мин,
- 50% этанола, 1 час,
- 70% этанола, 1 час,
- 85% этанола, 1 час,
- 95% этанола 1 час,
- 3 смены по 100% этилового спирта для каждого 1 час
- В конце концов, заменить этанол на 0,1% эозином в 100%-ным этанолом в течение ночи при 4 ° C. Эозином пятна клеточной стенки делает образцы более заметными во вложении и секционирования.
Примечание: Время, указанное здесь были оптимизированы для блоков 3x3x3 мм, но больше инкубации могут потребоваться для больших образцов.
Образцы могут быть сохранены в 70% этанолом при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. День 3: На следующее утро, теплое образцы до комнатной температуры в течение одного часа. Затем заменить этанол постепенно histoclear следующим образом:
- В конце дня, добавить 1 / 4 объема Paraplast Плюс фишки и положите флакон в 60 ° C духовку. Также заполнить стакан с Paraplast чипсы и пополнять этот часто для того, чтобы всегда иметь свежий расплавленный воск под рукой.
Примечание: Температура печи является важным и длительном нагревании Paraplast выше 60 ° С, следует избегать. - День 4: Постепенно замените histoclear с Paraplast, регулярно добавляя больше парафина чипов (каждый час). В конце дня, тщательно слейте histoclear / воск смесь и сразу же заменить его чистым расплавленным воском. Оставьте образцов при 60 ° С в течение ночи.
- Дни 5 и 6: Изменение Paraplast 3 раза в день, примерно каждые 4 часа, со свежими расплавленного воска соответствии сПримерами при температуре 60 ° C.
Примечание: возможно изменение воск только один раз в день, но ткань подготовка займет несколько дополнительных дней, чтобы закончить, как воск нужно менять хотя бы 5 или 6 раз. Вакуумная инфильтрация образцы тканей, когда они находятся в 100% этанола и / или в воске может еще больше повысить проникновение и вложение тканей. Вакуумные инфильтрации образцов в воске должно быть сделано при температуре 60 ° C. - День 7: Изменение воска еще раз. Запах histoclear должна исчезнуть полностью и образцы могут быть встроены в тот же день.
- Настройка большую тарелку потепления при температуре 60 ° C защищена алюминиевой фольги.
- Способ встраивания будет варьироваться в зависимости от типа ткани для анализа. Наиболее важным моментом на этом этапе является обеспечение того, образцы ориентированы правильно для секционирования позже. Один из способов заключается в использовании пластиковых форм и кольца. Разминка форм на потепление тарелку и залить расплавленным воском в нижней части формы. Передачаобразец ткани в пресс-форму с подогреваемой щипцы и направить его в нужное положение. Место белое кольцо на форму и добавить дополнительные расплавленный воск, такой, что ткани покрываются полностью. Тщательно перемещать плесень от пластины к скамье. Пусть воск остывать постепенно.
Другая возможность состоит в распределении всех образцов в чашке Петри содержащих расплавленный воск (образцы должны быть полностью покрыты воском) во время работы на 60 ° C нагревается пластина. Ориентироваться образцов с теплой щипцами. В конце концов, выключить пластинку. Когда воск затвердевает, чашке Петри можно переместить на скамейке, а затем хранить при 4 ° C. Когда все будет готово для секционирования, маленькие блоки, содержащие образец ткани можно вырезать из чашки Петри с нагревается лезвие и установлены на микротома держатель образца с дополнительной капли расплавленного воска. Пусть образец затвердеть в течение нескольких минут до секционирования.
Примечание: Блоки могутхраниться при температуре 4 ° С в течение 1 года или дольше. Дополнительную полезные советы о фиксации тканей и вложения, см. ссылку. 16
2. Зонд подготовки
- Клонирование
Зонды, как правило, создается для одного или нескольких конкретных регионах гена. Высоко повторяющиеся последовательности должны быть исключены из зонда, но последовательностей, соответствующих областях сохраняется белка, такие как ДНК-связывающие мотивы в транскрипционные факторы, как правило, даст гена определенные шаблоны выражения 8,9,12,15 (рис. 1). Это потому, что РНКазы лечение в пост-гибридизации шагов (см. ниже) снижает уровень зонд перекрестной гибридизации между членами семейства генов. РНКазы расщепляет на несоответствия в дуплексы РНК, распадаются зонды гибридизации с стенограммы с несовершенной взаимодополняемости, которые будут смыты в последующих шагов.
В общем, несколько зондов, возможно, должны быть проверены на каждого гена, представляющих интерес. Зонды могут быть как 150 баз в длину. Althougч нет ограничения на длину зонда, фрагменты короче 1,5 кб обычно транскрибировать лучше. Фрагменты ДНК для транскрипции являются клонировали в вектор, содержащий T3, T7 или SP6 промоутеров (например pCRII-TOPO, Invitrogen). Кроме того, T3, T7 или SP6 последовательностей промотор может быть включена в качестве 5'-хвост на обратный праймер использовали для усиления зонд регионе.
В каждом эксперименте на месте гибридизация, мы включаем положительный контрольный датчик, для которых гибридизации картина известна и которая работает постоянно, а в качестве отрицательного контроля (1D рис и Н). Последние могут быть случайными зонд РНК, как известно, не скрещиваются с любой стенограммы тканей, представляющих интерес. Хотя обычно используют смысле зонд гена под анализ, в этом нет необходимости и любого не гибридизации РНК подойдет цели. Если есть возможность, ткани от транскрипционной аллель нуль-гена будет служить отличным отрицательного контроля. - Линеаризации плазмиды путем переваривания примерно 5 мкг ДНК с ограничением фермента, который дайджесты в конце вставить противоположной сайт промоутера. Не используйте ферментов рестрикции, которые оставляют 3'-навес. Это может привести к транскрипции артефакты, потому-полимеразы могут использовать навес 3 'в качестве субстрата для продолжения транскрипции. Кроме того, зонд региона, включая T3, T7 или SP6 промотора может быть усилен с помощью ПЦР для получения ДНК-шаблон для реакции в пробирке транскрипции.
- Проверьте аликвоту на геле чтобы убедиться, что реакция прошла до конца.
- Извлечение ДНК с фенол / хлороформ, осадок с этанолом и ресуспендируйте ДНК гранул в MilliQ H 2 O в концентрации 1μg/μl. Кроме того, ДНК может быть очищена с использованием стандартных столбцов очистки ДНК.
- Настройка в пробирке транскрипции реакции путем смешивания:
- 1 мкл пуrified ДНК (1μg/μl)
- 2μl 10x буфер транскрипцию
- 2 мкл 10х DIG РНК маркировке смеси
- 1 мкл РНКазы OUT
- 2μl T3, T7 или SP6 РНК-полимеразы (20 ед / мкл)
- H 2 O до 20 мкл.
Инкубировать при 37 ° С в течение 1 до 2 часов. Держите 1 мкл для анализа на гель позже.
Примечание: Флуоресценция-меченых зондов являются предпочтительными в животных системах, но из-за высокой авто-флуоресценции большинства тканей растений, в месте протоколы гибридизации для растения используют меченые зонды 17 или более обычно DIG-меченых зондов, которые обнаруживаются иммуногистохимии. - Удаление шаблона ДНК, добавив 75 мкл MilliQ Н 2 О и 5 мкл RQ1 ДНКазы (1 ед / мкл) для транскрипции реакции и инкубации реакцию при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
- Purify в пробирке реакция транскрипции для устранения неакционерных нуклеотидов и малых транскриптов. Один возможнымность заключается в использовании гель-Sephadex ® колонки, такие как мини Быстрый Спиновые Столбцы РНК (Roche). Кроме того, транскрипции реакция может быть очищен с помощью обычных LiCl / осаждения этанолом (см. исх. 14). Держите 1 мкл, чтобы проверить гель позже.
- Зонды более 250 баз в длину, как правило, частично гидролизованный получить молекулы РНК приблизительно 150 п и, следовательно, достаточно малы, чтобы эффективно проникают в срезах тканей. Добавить равный объем 2x карбонатного буфера (80 мМ NaHCO 3, 120 мМ Na 2 CO 3), чтобы очищенная реакции транскрипции и инкубировать при температуре 60 ° C. Инкубационный период должна быть рассчитана по следующей формуле:
время = (Li - LF) / (К х Ли х Lf)
где Li = начальная длина зонда (в Кб); Lf = окончательной длины зонда (0,150 кб), К = 0,11 кб / мин. Держите 2 мкл, чтобы проверить геля. - Нейтрализовать реакции гидролиза, добавив 1 / 20 объема 10% уксусной кислоты.
- Зонд то пуриFied путем добавления 1 мкл тРНК (100мг/мл), 1 / 10 объема 3М NaAc рН 5,2, плюс 2,5 объемов холодного 100% этанола, и инкубации при температуре -80 ° С в течение 30 мин. Осадок РНК центрифугированием при 13500 оборотов в минуту в течение 20 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и ополосните РНК гранул с 500 мкл 70% этанола. Центрифуга раз позвольте гранул сухого воздуха (как правило, около 15 мин), и ресуспендируют РНК в 50 мкл 50% деионизированной формамида. Зонд должен храниться при температуре -80 ° C до использования.
- Проверьте на регулярной 1% TAE-агарозном геле конечного продукта, а также полуфабрикатов из разделов 2.2.4, 2.2.6 и 2.2.7 (рис. 2A). Это позволяет контролировать эффективность в реакции транскрипции пробирке.
Примечание: в реакции транскрипции пробирке должна принести около 1 мкг РНК на 1 мкг шаблона. - Дот-блот анализа
Концентрация зонда и DIG-UTP включения можно оценить с помощью дот-блот анализа (рис. 2В). Последовательные RН. А. разведения пятнистых на стандартных мембранных гибридизации наряду помечены контроль РНК с известной концентрацией. Например, мы используем DIG-UTP помечены контроль РНК зонд включены в в пробирке транскрипции комплект (Roche). Лучше всего, чтобы протестировать несколько разведений для каждого датчика в целях определения точной концентрации.- Подготовка блокирующего буфера путем растворения 0,5% Blocking Reagent в 1x TBS буфера (100 мМ Трис-HCl pH7.5, 150 мМ NaCl) при 70 ° С, то пусть решение остыть до комнатной температуры.
- Пятно 1 мкл серийных разведений (обычно 10 -1 до 10 -5) в пробирке транскрипции и контрольных датчиков на N + нейлоновые мембраны. Fix РНК УФ сшивания.
Примечание: минимальная поверхность мембраны должна быть использована для уменьшения объема буфера в дальнейшем. - Равновесие мембраны в 1x TBS в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) на встряхивая платформы.
- Блок мембраны использованием блокировкибуфера в течение 30 минут при комнатной температуре на встряхивая платформы.
- Промойте мембрану в 1x TBS в течение 5 мин.
- Инкубируйте мембраны с анти-DIG антител, разбавляя 1 мкл анти-дигоксигенин-AP в 10 мл 1x TBS, в течение 45 минут при комнатной температуре.
- Вымойте мембраны дважды в 1x TBS в течение 15 минут каждый.
- Равновесие мембраны в 1x TN буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 9,5, 100 мМ NaCl) в течение 5 мин.
- Пятно мембраны путем инкубации с НБТ / BCIP 1 / 50 (объем / объем) в буфере 1x TN. Окрашивание может занять 5-10 минут. Затем промойте мембрану с водой, он может быть сухим и в качестве записи.
Примечание: NBT / BCIP является субстратом для щелочной фосфатазы конъюгированных с анти-DIG антитела, которые после гидролиза производит темно-синий краситель.
3. Секционирование
- Теплый блоков до комнатной температуры. Если блоки слишком холодно, отдельные разделы могут пролонгировать без образования "Лента" воском. Trim блока в trapeZoid форму оставив около 1 мм воска вокруг образца.
- Разминка большой слайд теплее при 35-37 ° С.
Примечание: Многие протоколы сделать этот шаг, при 42 ° С однако снижение температуры до 35-37 ° C предотвращает образование пузырьков под разделы. - Место блока на микротома, что больше двух параллельных граней в нижней части. Тщательно принести блок вперед к лезвию и убедитесь, что поверхность блока параллельно лезвию. Раздел при толщине 8 - 10 мкм. Воск ленты может быть выровнен по нелипкую поверхности, например, алюминиевой фольгой или фильтровальную бумагу, для выбора интересующих разделов. Это можно оценить, используя близлежащие рассекает микроскопом.
Примечание: эозином окрашивания тканей обеспечивает индикацию ли ткани были должным образом проникли во вложении. Если центр блок не окрашиваются эозином это обычно означает, что ткань слабо закрепленные. - Марк Зонд-на SL Plusязи с карандашом (самые ручки или маркеры будут стерты во время на месте протокол гибридизации) и распространять 1 мл чистого MilliQ H 2 O на него. Тщательно плавать интересующих разделов на поверхности воды при комнатной температуре (проще манипулировать разделами на воде во время работы при комнатной температуре). Убедитесь, что блестящая сторона (нижняя сторона, как лента отрывается от микротома) сталкивается с водой. Затем перенесите слайд медленно на слайд теплее. Отопление помогает разделах выкладывать на поверхности воды. Через 5 минут, слейте воду осторожно, но одним плавным движением, поэтому лента опускается вниз на слайде. Пусть слайды высохнуть в течение по крайней мере несколько часов или на ночь при 37 ° С, поэтому придерживается ткани.
Примечание: секционные ткани могут храниться в коробке с осушителем кремнезема в течение нескольких дней до нескольких недель при температуре 4 ° С, однако, лучше всего использовать слайды как можно скорее.
4. В месте Гибридныйции
- Раздел предварительной обработки
Объем, необходимый для каждого решения, очевидно, будет зависеть от количества слайдов на лечение и размера контейнера используется. Разделы всегда должны быть полностью погружены. Для 25-слайд стойки и аккуратно установки контейнера, 200-250 мл будет достаточно. Поскольку многие из этапов инкубации очень короткие, обычно мы подготовим все возможные решения, а затем начать слайд предварительной обработки. Тем не менее, ангидрид уксусной необходимо готовить непосредственно перед использованием и протеазы добавляется во время использования. Все действия выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Кроме того, все буферы могут быть подготовлены на 10x концентрации исходного раствора.- Теплый протеазы буфера (100 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ ЭДТА) в контейнере до 37 ° C.
- Deparaffinize и увлажняет ткани следующих секций:
- histoclear - 10 мин (используйте стеклянную посуду)
- histoclear - 10 мин (используйтестеклянную посуду)
- 100% этилового спирта - 1 мин
- 100% этилового спирта - 30 сек
- 95% этанола - 30 сек
- 85% этанола - 30 сек
- 70% этанола - 30 сек
- 50% этанола - 30 сек
- 30% этанола - 30 сек
- 10% этанола - 30 сек
- MilliQ H 2 O - 1 мин
- Инкубируйте в 1x PBS в течение 2 мин.
- Смешайте 625μl протеазы 50мг/мл в 250 мл протеазы буфера предварительно нагревают до 37 ° С и инкубировать слайды в течение 20 мин при 37 ° C.
Примечание: протеазы требуется переваривать белки фиксированной и увеличению зонд доступ к сотовой РНК. Очень важно, чтобы контроль времени инкубации максимально гибридизации сигнала без разбивки ткани, что некоторые оптимизации могут потребоваться для каждого образца ткани. - Нейтрализовать протеазы активности в 0,2% глицина в 1x PBS в течение 2 мин.
- Промыть слайды раз в 1x PBS в течение 2 мин.
- Лечить слайды яN 4% PFA решение в течение 10 мин повторно исправить РНК, которые могут быть повреждены протеазы лечения.
- Промыть слайдов дважды в 1x PBS в течение 2 минут каждый.
- В то время как слайды в PBS моет, составляют 250 мл 0,1 М триэтаноламин рН раствора 8,0, смешивая 12,5 мл 2М триэтаноламин (29.8g в 100 мл MilliQ H 2 O, pH8.0 с HCl) в 236,25 мл MilliQ H 2 O в стеклянную посуду. Добавить 1,25 мл ангидрида уксусной кислоты в буфер триэтаноламин сразу перед тем, слайды, и хорошо перемешайте. После добавления слайдов, продолжать помешивать в течение 10 минут.
Это требует, чтобы слайд стойку поднимается в контейнер триэтаноламин / уксусного ангидрида. Мы используем системы зажима с поддержкой стоять.
Примечание: На данном этапе положительно заряженные аминогруппы, которые могут привести к не-специфического связывания зонда ацетилированного. Кроме того, уксусный ангидрид токсичен, это решение должно быть подготовлено в вытяжной шкаф и утилизировать <./ LI> - Промыть слайдов дважды в 1x PBS в течение 2 мин.
- Дегидрировать срезах тканей еще раз:
- H 2 O - 1 мин
- 10% этанола - 30 сек
- 30% этанола - 30 сек
- 50% этанола - 30 сек
- 70% этанола - 30 сек
- 85% этанола - 30 сек
- 95% этанола - 30 сек
- 100% этилового спирта - 30 сек
- 100% этилового спирта - 30 сек
- Гибридизация
- Теплый нагрева блока до 85 ° C.
- Подготовка гибридизации буфера. За 10 мл, смешайте в трубке Сокол 1,25 мл на месте солей гибридизации (3M NaCl, 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ фосфат натрия pH6.8, 50 мМ ЭДТА), 5 мл деионизированной формамид, 2,5 мл 50% декстран сульфата, 250 мкл 50x Денхардта, 125 мкл 100мг/мл тРНК, и 875 мкл H 2 O. <бр /> Примечание: декстран сульфата очень вязкая, поэтому лучше, чтобы подогреть раствор до 60 ° С, чтобы сделать пипетирования легче. Гибридизация буфера можно хранить при температуре -20 ° C.
- Подготовка различных зондов. Для каждого слайда, смешайте 1 мкл зонда с 9 мкл MilliQ H 2 O и 10 мкл деионизированной формамида. Тепло зонда при 85 ° С в течение 2-3 мин, сразу же холод на лед, центрифуги коротко, и добавлять зонд 80μl гибридизации буфер на слайде. Тщательно перемешать с помощью пипетки, но избежать пузырей.
Примечание: количество зонда, которые будут добавлены в слайд должна быть проверена эмпирически. Как правило, зонды используются в конечной концентрации 0,5 сложности зонд нг / кб / мкл. После гибридизации выполняются с 100 мкл на слайд, около 25 нг зонд необходимо на слайд для зондов, которые являются 0,5-кб в длину и 50 нг зонда на слайд для датчиков, 1-кб долго. Для простоты мы часто пытаемся 0,5, 1 и 4 мкл зонда на слайд. - Место скользит почистую поверхность и дайте им высохнуть на воздухе полностью в течение 5-10 мин. Внесите зонд / гибридизации буфер смесь на правый край слайда. Постепенно нижнего покровного на слайде, убедившись, что гибридизация решение охватывает все разделы без пузырей. Нажмите покровное слегка пальцем, где пузырьки образуются вытеснять их из всех срезах тканей. Не тяните крышку соскользнуть, как это может повредить разделы.
Примечание: альтернативный метод обычно используется для этого шага заключается в подготовке "бутерброды" из двух слайдов, которые инкубируют с тем же зондом. Для получения дополнительной информации об этом методе см. ссылку. 14. - Подготовка камере влажности в совершенно плоской пластиковой коробке. Обложка нижней части коробки с ватман, смоченной водой MilliQ, покрытая бумага с парафильмом оставляя углы обнаружили, место слайды в пластиковой коробке и печатью окно плотно.
- Инкубируйте слайды в нужном гибридизации температуре, обычно 50 - 55 ° C, Fили 16-20 часов.
- Для использования на следующее утро, готовить 1 литр 0,2 x SSC и хранить это в 55 ° C. Кроме того, подготовить 1 литра буфера NTE (0,5 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl pH7.5, 1 мМ ЭДТА pH8.0) и хранить при температуре 37 ° C.
- После гибридизации лечения
- Удалить покровные осторожно, чтобы не повредить разделы. Место слайдов в стойке и мыть их дважды в 0,2 x SSC при 55 ° С в течение одного часа.
Примечание: Покровные часто падать легко, когда слайды находятся в вертикальном положении. Если покровное остается присоединенным, погрузите слайд в теплой 0,2 x SSC в течение 1 или 2 мин до мытья покровное прочь. Избегайте потянув покровное из слайда, так как это может привести к повреждению секций. - В то же время, подготовить 500 мл промывочного буфера (1% БСА, 0,3% тритона в TBS буфера) и 100 мл блокирующий раствор (0,5% блокирующий реагент в TBS буфера). Движение блокирование порошок в TBS, который медленно нагревают до 70 ° С и дайте ему остыть до комнатной температуры один раз dissolvиздание
Примечание: объемы промывочного буфера и блокирование решения необходимо будет варьироваться в зависимости от размера плоской пластиковой коробке, используемые в шагах 4.3.8 -11. Это займет некоторое время, чтобы полностью раствориться Тритон, чтобы подготовить достаточное решение заранее. - Равновесие слайдов в NTE 1x в течение 2 мин.
- Приступить к РНКазы лечения путем перечисления слайды в 1x NTE буфер для которых 20μg/ml РНКазы добавляется непосредственно перед использованием, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
Примечание: РНКазы расщепляет свободные одноцепочечной РНК, а также на несоответствия в дуплексы РНК. Этот шаг поможет снизить уровень неспецифического связывания зонда, как расщепляется исследовали фрагменты смываются в последние 0,2 x SSC вымыть (см. 4.3.6). - Промыть слайдов дважды в 1x NTE в течение 2 минут каждый.
- Вымойте слайдов в свежем 0,2 x SSC при 55 ° С в течение одного часа.
- Равновесие слайдов в 1x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Передача слайдов из стойки на гоэлектронной нижней плоской пластиковой коробке и покроют их минимальный объем блокирующим раствором. Блок слайды в течение 45 мин медленно покачивая платформы.
- Передача слайдов второй чистую плоскую пластиковую коробку и мыть их в течение 45 мин с моющим буфером на встряхивая платформы.
- Приступить к антител инкубации. Развести анти-дигоксигенин антител в промывочный буфер (1:5 об / об) и либо применять минимальный объем непосредственно на каждый слайд или место слайда в плоскую пластиковую коробку и покроют их минимальный объем раствора антител. Инкубируйте слайдов в темноте в течение 2-3 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
- Вымойте слайды 4 раза в течение 15 минут каждый промывочным буфером при встряхивании платформы. Используйте минимальный объем промывочного буфера и плоской пластиковой коробке. Чистая пластиковая коробка между каждым из стирок.
Примечание: Очистка окна между моет будет снижение общего фона на слайде. Для упрощения этого, мы используем два одинаковых плоских ящикахи передача вставляется в чистое поле после каждого мытья. - Передача слайды в 1x TBS в течение 2 мин.
- Равновесие слайдов в TN буфер дважды в течение 2 минут каждый.
- Подготовка красящим раствором непосредственно перед использованием путем добавления 20 мкл НБТ / BCIP на 1 мл буфера TN. Налейте окрашивание раствора в небольших пластиковых взвешивания блюдо. Сэндвич два слайда вместе с разделами лицом друг к другу. Опустите одну длинную сторону бутерброда в решение, позволяющее капиллярного действия, чтобы подтянуть решение. Слейте скользит по Kimwipe и заполнить слайды с антителом решение снова. Возможно, вам придется задействовать слайды как решение потоков, чтобы избежать пузырей. Место слайдов в пластиковую коробку и храните при комнатной температуре в темноте.
- День 10 до 15 день: Обновить красящим раствором два раза в день в течение 1-5 дней, промыв слайдов в TN буфера и подготовке новых бутерброды содержащей свежий раствор окрашивания.
Примечание: Замена окрашивание раствора при регулярном Intervals улучшит сигнал к фону. Развитие сигнала можно контролировать при соединении или стерео-микроскопом. Можно сфотографировать разделы пока они находятся в буфере TN в перерыве между раундами окрашивания или после их передачи в воду непосредственно перед стационарного монтажа.
- Удалить покровные осторожно, чтобы не повредить разделы. Место слайдов в стойке и мыть их дважды в 0,2 x SSC при 55 ° С в течение одного часа.
- Монтаж
- Как только сигнал очевидно, промыть слайдов в MilliQ H 2 O и обезвоживает их быстро через этанола серии:
- 10% этанола - 10 с
- 30% этанола - 10 с
- 50% этанола - 10 с
- 70% этанола - 5 сек
- 80% этанола - 5 сек
- 95% этанола - 5 сек
- 100% этилового спирта - 5 сек
- histoclear - 2 мин
- histoclear - 2 мин
- Горы слайды, поставив одну или две капли на основе толуола монтажа среды на каждом скользнулэлектронной и медленно снижения покровное на слайд избегая образования пузырьков. Пусть монтажа среду затвердеть ночь перед анализом результат при соединении микроскопом. Как только установлен, слайды могут храниться в течение многих лет при комнатной температуре.
- Как только сигнал очевидно, промыть слайдов в MilliQ H 2 O и обезвоживает их быстро через этанола серии:
5. Представитель Результаты:
После 1-5 дней, красно-фиолетовый сигнал будет развиваться в тех клетках, где зонд гибридизированных к дополнительным транскриптов (рис. 1). Цветовой сигнал таким образом, обеспечивает прямой визуализации на клеточном разрешение экспрессии генов, представляющих интерес. Слабый фон окраски может также развиться в результате неспецифического связывания зонда или окрашивания тканей растений (рис. 3). Такой фоновый сигнал может быть относительно более выраженным в небольших, менее определяются клетки ткани, но фон окраски также будет наблюдаться в разделах гибридизации с отрицательным и положительным зондов контроля и не будетвоспроизводимость между экспериментами.
Рисунок 1. Представитель результаты, полученные с различных датчиков на Arabidopsis и кукурузы тканей. Натурные гибридизации Arabidopsis (AD) и кукурузы (EH) тканей с различными генами специфических зондов иллюстрирующие тип результатов, которые можно ожидать от успешного завершения намеченных протокола. (А) Локализация SHOOTMERISTEMLESS1 (СТМ) в Arabidopsis вегетативный побег вершиной; обратить внимание на наличие фиолетово-синий сигнал в неопределенном клетках меристемы и отсутствие сигнала в окружающих листьев. (BD) Разделы Arabidopsis торпедных эмбрионов этапе показывает CLAVATA3 (B) выражение в несколько эмбриональных стволовых клеток, AtML1 (C) выражение в эпидермального слоя, а также отсутствие сигнала в разделах Зондирование случайного отрицательного контроля РНК (D). (E) Локализация knotted1 STM гомолога в развивающемся эмбрионе кукурузы; отметить сильный сигнал в частности, в эмбриональном меристемы и корня. (FH) продольные срезы через вегетативную верхушки побега из кукурузы показ различных моделей на месте гибридизации для arf3a (F) и ocl4 (G) и не гибридизации сигнал для отрицательного контрольного датчика (H). arf3a экспрессируется на абаксиальный / нижней поверхности листа, в то время AtML1 гомолога ocl4 выражается именно в эпидермис.
Следующие фрагменты гена были использованы в качестве зонда: STM: кДНК область, охватывающая аминокислоты 81 - 382, который включает в себя сохранение homeodomain; CLV3: полную кДНК; AtML1: третий экзон; KN1: все открытые рамки считывания; arf3a: нуклеотидов 9 - 225 из кДНК клона HM004539; ocl4: 1,7 3 'кб полной кДНК, которая включает в себя несколько областей сохраняется белка.
Рисунок 2. Проверка точки, делая в зондов пробирке транскрипции. () В месте зонды гибридизации проверяются на стандартных агарозном геле после того как в пробирке транскрипции (), после ДНКазы лечения и последующей очистки в пробирке транскрипции реакции (б), после гидролиза карбоната, при необходимости-(с) и при готов к использованию (г). Для зондов более 250 б.п. в длину, такие как датчик 1, карбонат гидролиза даст меньший диапазон датчика фрагменты (кронштейн). (B) колориметрический количественное зонды блоттинг точка. Разведения от 10 -1 до 10 -5 от 100 нг / мкл контрольного датчика (1) и трех новых DIG-меченых зондов (2-4) выставляются на передачу мембраны, инкубировали с анти-DIG антитела, и анализировали использованием колориметрического анализа, изложенные в разделе 2.3 протокола. Анализ показывает,Следующие оценкам концентраций: зонд 2, ~ 100 нг / мкл; датчика 3, ~ 10 нг / мкл датчика 4, ~ 1 нг / мкл. Зонд 4 вряд ли уступает хорошим на месте сигнала гибридизации.
Рисунок 3. Сравнение неспецифические зонд хорошо функционирующих зонда. Продольные срезы через вегетативную верхушки побега из кукурузы показывает неспецифические фонового сигнала (А) и конкретных на месте сигнала гибридизации для OCL5 зонда в наружный слой клетки (B).
Рисунок 4. Схема сроки шагов на месте протокол гибридизации. Шаги тканей вложение указаны в зеленый, зонд-подготовительных шагов в оранжевый цвет, и на месте шагов гибридизации в синий цвет. Этот график считает, что ДНК templaТе для в пробирке транскрипции зонда имеется. Парафиновые встраиваемый ткани блоков и DIG-меченых зондов можно приготовить заранее и хранить при температуре 4 ° C и -80 ° С, соответственно, по времени использования. На месте протокол гибридизации может быть завершена всего за четыре дня.
Discussion
На месте методом гибридизации, изложенные здесь, позволяет прямой визуализации пространственно-временной картины выражением какого-либо гена с большой сотовой разрешение, высокую чувствительность и специфичность. Протокол не позволяет количественное сравнение уровней экспрессии между генами. Однако, высокая чувствительность метода и разрешением позволяет выявить градиент экспрессии генов в ткани 8, 18, что невозможно с большинством других методов анализа экспрессии генов.
Протокол включает много шагов, которые могут сделать поиск неисправностей проблематично. Наиболее важных шагов протокола фиксации тканей и отбора и маркировки зонда. Плохо проникли тканей и зондов с низким включения DIG дадут очень слабые сигналы, которые могут быть трудно обнаружить выше фона. Для каждого нового гена, рекомендуется попробовать несколько различных зондов основе Diff #аренда регионов стенограммы. Иногда, два или три зондов, предназначенных для различных регионах меньше генов, возможно, должны быть объединены, чтобы получить сильный и специфической гибридизации сигнала. Кроме того, гибридизация условий, таких как температура и состав гибридизации буфер, могут быть оптимизированы для каждого гена или ткани, снизить или увеличить жесткость гибридизации. Также шаг протеазы лечение переменной и может быть изменен адаптировать протокол для различных видов растений или для обнаружения стенограммы с очень низкой численности. Включение и положительные и отрицательные зондов контроль будет полезна для идентификации проблематичных точках протокола.
Процедура оптимизирован для парафин разделы растительной ткани, но с небольшими изменениями может быть использована также и для целого монтажа на месте гибридизации. Хотя широко используется в исследованиях животных 19, целые горы на месте гибридизация будет лimited в тканях растений, которые можно легко проникнуть, например, эмбрионов, корней или молодых меристематических тканей 20,21. Протокол также может быть легко изменены, чтобы одновременно обнаружить два различных мРНК или локализовать стенограммы наряду с белками 15,22,23. Наконец, можно распространить применение этого метода для визуализации малых экспрессии РНК в растениях. шаблоны микроРНК выражения была определена с использованием этого протокола в обоих кукурузы и Arabidopsis 8,14. В последнее время в пробирке транскрипции зондов были заменены на коммерчески доступных DIG-меченых заблокирован нуклеиновых кислот (LNA) олиго зондов, которые повышают чувствительность сигнала 18, 24.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории МП при поддержке грантов от Национального научного фонда (DBI-0820610 и IOS-1022102) и Нью-Йорк Департамент здравоохранения (NYSTEM-C024308). CM получил докторской стипендии от испанского Министерства образования и науки (2007-0937) и Фонд Рафаэля дель Пино, Испания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoseal 60 4oz | Fisher Scientific | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Tissue Path Paraplast Plus | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega Corp. | M6101 | |
| DIG-labeled Control RNA | Roche Group | 11585746910 | |
| DIG RNA labeling mix | Roche Group | 11277073910 | |
| SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche Group | 10881767001 | |
| RNase-A | Roche Group | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
| Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche Group | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche Group | 1 681 451 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Group | 11814427001 | |
| tRNA from E. coli | Roche Group | 109541 | |
| Triton®X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Deionized formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich | A6404 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
| Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Albumin from bovine serum - ≥98% | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ethanol absolute 200 proof | |||
| Phenol/chloroform | |||
| Base moulds | Electron Microscopy Sciences | 62352-15 | |
| Embedding rings | Fisher Scientific | 22-038-197 | |
| 20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR international | 66020-326 | |
| Probe-on-plus slides | Fisher Scientific | 22-230-900 | |
| Micro cover glasses 24x50 mm | VWR international | 48404-452 | |
| Whatman paper 3mm | VWR international | 89022-360 | |
| Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electron Microscopy Sciences | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
| 18 clean plastic containers | Electron Microscopy Sciences | 71402 | |
| 2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
| Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
| Microtome | Leica | ||
| Self-cleaning dry vacuum system | Welch Allyn | 2025 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | ||
| Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
| Incubator at 58-60°C | Fisher Scientific | For steps with molten Paraplast | |
| Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher Scientific | Need two due to the quick change between temperatures | |
| Centrifuge (4°C - 20°C) | |||
| Fume hood |
References
- Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
- Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
- Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
- Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
- Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
- Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
- Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
- Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
- Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
- Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
- Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
- Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
- Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
- Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
- Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
- Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
- Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
- Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
- Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
- Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
- Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).
