Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

In Situ Hybridisering för exakt lokalisering av transkript hos växter

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3328

Summary

Den

Abstract

Med framstegen inom genforskningen det senaste decenniet, har växtbiologi sett ett stort antal studier presentera storskaliga kvantitativa analyser av genuttryck. Microarray och nästa generations förhållningssätt sekvensering som används för att undersöka utvecklingsmässigt, fysiologiskt och stress processer, dissekera epigenetiska och små RNA spridningsvägar och bygga stora gen regleringsnät 1-3. Samtidigt som dessa tekniker underlätta samtidig analys av stora gen-apparater, ger de oftast en mycket begränsad Spatiotemporal upplösning av förändringar genuttryck. Denna begränsning kan delvis övervinnas med hjälp av antingen profilering metod i samband med lasermicrodissection eller fluorescens-aktiverad cell sortering 4-7. Men att till fullo förstå den biologiska rollen av en gen, är kunskap om dess Spatiotemporal mönster av uttryck på cellulär upplösning viktigt. Särskilt när man studerar utvecklingen eller effekterna av miljö-stiMuli och mutanter kan en detaljerad analys av en gen uttryck mönstret blivit avgörande. Till exempel kan subtila kvantitativa skillnader i uttrycket nivåer av centrala gener leda till dramatiska fenotyper då i samband med förlust eller vinst uttryck i specifika celltyper.

Flera metoder används rutinmässigt för att en detaljerad granskning av mönster genuttryck. Det ena är genom analys av transgena reporter linjer. En sådan analys kan dock bli tidskrävande vid analys av flera gener eller arbetar i fabriker motsträviga till omvandling. Dessutom är en oberoende validering för att säkerställa att transgenen uttrycket mönstret efterliknar den i endogena genen normalt krävs. Immunhistokemiska protein lokalisering eller mRNA in situ hybridisering närvarande relativt snabbt alternativ för direkt visualisering av genuttryck i celler och vävnader. Den senare har den klara fördelen att den lätt kan used på någon gen av intresse. In situ hybridisering tillåter detektion av mål mRNA i celler genom hybridisering med en märkt anti-sense RNA sond erhålls genom in vitro transkription av genen av intresse.

Här redogör vi för ett protokoll för in situ lokalisering av genuttryck i växter som är mycket känslig och specifik. Den är optimerad för användning med paraformaldehyd fast, paraffininbäddade snitt, som ger utmärkt bevarandet av histologi och gräva-märkta prober som är synliga genom immuno-detektion och alkaliska fosfataser kolorimetrisk reaktion. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på ett antal vävnader från ett brett spektrum av växtarter och kan användas för att analysera uttrycket av mRNA samt små RNA 8-14.

Protocol

1. Provberedning

OBS: Alla steg upp till och med hybridisering steget är känsliga för RNAse aktivitet. Det är därför viktigt att arbeta i rena förhållanden. Det är också ganska vanligt att göra alla lösningar RNase-fria genom att använda DEPC-behandlat vatten och glas bakas vid 180 ° C i minst 3 timmar. Plastbehållare ofta rengörs genom behandling med 0,2 N NaOH i 30 min. Men ingen av dessa försiktighetsåtgärder är viktiga och vi brukar använda vanliga rena milliQ H 2 O för alla lösningar. Vi sparar separata reagenser, lådor och glas för in situ-hybridizations och lagra dessa i en ren skåp.

  1. Exempel fixering
    1. Dag 1: Bered en färsk 4% paraformaldehyd (PFA) fixativ. För 500 ml, varma 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 3 mm NaH 2 PO 4 pH7.0) till 60 ° C och lös två pelletar av NaOH. I ett dragskåp, tillsätt 20 g paraformaldehyde och blanda väl tills det är upplöst. Placera lösningen på is och när de kyls justera pH till 7,2 med H 2 SO 4 (1-2 droppar för 100 ml). Justera sedan volymen till 500 ml med 1x PBS.
      Obs: Använd inte HCl för att justera pH-värdet eftersom detta kommer att frigöra mycket giftiga ångor. Paraformaldehyd är giftigt, denna lösning bör därför beredas i ett dragskåp och omhändertas på rätt sätt. Dessutom är Paraformaldehyd lagras vid 4 ° C och bör köpas nya var 6 - 9 månader.
    2. Prover Harvest vävnad och placera dem direkt i 15 ml färsk PFA fixativ på is i glaset skintillationsflaskor. Om vävnaden dissektion krävs, görs detta bäst på isen i kallt fixativ.
      OBS: Det är viktigt att använda ett stort överskott av fixativ. Den allmänna rekommenderade förhållandet är att använda 10 volymer av fixativ till en volym av vävnad.
    3. Applicera ett vakuum (~ 500 mm Hg) i prover, medan på is. Håll ett vakuum i 15-20 minuter, små bubblor ska släppa från provets men fixativ bör inte komma till en koka. Släpp vakuum långsamt och förnya PFA fixativ för att säkerställa att fixativ kvar på rätt koncentration. Upprepa detta steg tills vävnaderna sjunker efter utsläpp av vakuum.
      Obs: fixering krävs att fixa och cross-link RNA-molekyler i vävnaden. Detta steg är viktigt eftersom dåligt fasta material ger en låg signal. Vissa vävnader inte sjunka inte omedelbart men de flesta kommer så småningom att sjunka under natten. För att förbättra infiltrationen av fixativ kan följande rengöringsmedel läggas till: Triton upp till 0,1% och / eller Tween upp till 0,1 - 0,3%. Alternativt, etanol-baserade fixativ, såsom formaldehyd-alkohol-sur syra (FAA), kan användas för vävnader som annars inte är lätt infiltrerade 14,15.
    4. Byt PFA fixativ gång och hålla rören vid 4 ° C över natten.
  2. Tissue inbäddning
    1. Dag 2: Pre-cool 1x PBS och etanol serien vid 4 ° C.
    2. Skölj proverna TWIce i 30 min vardera i 1x PBS, på is.
      Obs: Återigen är det rekommenderat att använda ett stort överskott av varje lösning.
    3. Torka proverna genom att ta dem genom en etanol-serien på is, som följer:
      • 10% etanol 30 min,
      • 30% etanol 30 min,
      • 50% etanol 1 timme,
      • 70% etanol 1 timme,
      • 85% etanol 1 timme,
      • 95% etanol 1 timme,
      • 3 förändringar på 100% etanol för 1 timme varje
    4. Vid slutet av dagen, ersätta etanol med 0,1% Eosine i 100% etanol över natten vid 4 ° C. Eosine fläckar cellväggen göra proven mer synlig under inbäddning och snittning.
      Anteckningar: Tiderna anges här har optimerats för block av 3x3x3 mm men längre inkubationer kan krävas för större prover.
      Prover kan förvaras i 70% etanol vid 4 ° C i flera månader. Dag 3: Följande morgon, varma proverna till rumstemperatur i en timme. Sedan ersätta etanol gradvis med histoclear enligt följande:
      Bord
    5. Vid slutet av dagen, tillsätt 1 / 4 volym Paraplast Plus chips och placera flaskan i ett 60 ° C ugn. Också fylla en bägare med Paraplast marker och fylla detta ofta för att alltid ha färsk smält vax till hands.
      Obs: Temperaturen i ugnen är viktig och långvarig uppvärmning av Paraplast över 60 ° C bör undvikas.
    6. Dag 4: successivt ersätta histoclear med Paraplast genom att regelbundet lägga till fler paraffin marker (varje timme). Vid slutet av dagen, Häll försiktigt bort histoclear / vax blandning och omedelbart ersätta den med ren smält vax. Lämna prover vid 60 ° C över natten.
    7. Dag 5 och 6: Ändra Paraplast 3 gånger dagligen, ca var 4 timmar, med färska smält vax håller sempel vid 60 ° C.
      Observera: Det är möjligt att ändra vax bara en gång om dagen, men vävnaden beredningen skulle ta några extra dagar att slutföra, eftersom vaxet behöver bytas minst 5 eller 6 gånger. Vakuum infiltration av vävnadsprover när dessa är i 100% EtOH och / eller vax kan ytterligare förbättra infiltration och inbäddning av vävnader. Vakuum infiltration av prover i vax bör ske i 60 ° C.
    8. Dag 7: Ändra vaxet igen. Lukten av histoclear bör nu vara borta helt och proverna kan bäddas in senare samma dag.
    9. Sätt upp en stor värmeplatta vid 60 ° C skyddat av aluminiumfolie.
    10. Metoden att bädda varierar beroende på vilken typ av vävnad som skall analyseras. Den viktigaste punkten i detta steg är att se till att proven är vända åt rätt för sektionering senare. Ett sätt är att använda plast formar och ringar. Värm upp formarna på uppvärmningen plattan och häll smält vax i den nedre delen av mögel. Överföringett vävnadsprov i formen med uppvärmd pincett och rikta den till önskad position. Placera den vita ringen på formen och lägga till ytterligare smält vax så att vävnaderna täcks helt. Försiktigt flytta mögel från plåten till bänken. Låt vaxet svalna gradvis.

En annan möjlighet är att dela ut samtliga prover i en petriskål med smält vax (proverna bör helt täckt av vax) medan du arbetar på 60 ° C varm tallrik. Orientera prover med varma pincett. I slutet, stäng av plattan. När vaxet är solidifierat kan petriskål flyttas till bänken och sedan lagra vid 4 ° C. När redo för sektionering, kan små block som innehåller ett vävnadsprov skäras ut ur petriskål med en varm kniv och monteras på en mikrotom Provhållare med en extra droppe av smält vax. Låt provet härda i några minuter innan snittning.

Obs: Blocks kanlagras vid 4 ° C under 1 år eller längre. För ytterligare tips på vävnad fixering och inbäddning, se ref. 16

2. Probe förberedelse

  1. Kloning
    Sonder är oftast genereras till en eller flera särskilda regioner av genen av intresse. Mycket repetitiva sekvenser bör undantas från sonden, men sekvenser motsvarande bevarat protein domäner, såsom DNA-bindande motiv i transkriptionsfaktorer, vanligtvis kommer att ge gen specifikt uttryck mönster 8,9,12,15 (Fig. 1). Detta eftersom RNAse en behandling i den post-hybridisering steg (se nedan) minskar nivån av sonden över hybridisering mellan medlemmar genfamilj. RNAse En klyver på obalanser i RNA duplex, fragmentering sonder hybridiseras till avskrifter med imperfekt komplementaritet, som kommer att tvättas bort i senare steg.
    I allmänhet kan flera sonder behöver testas för varje gen av intresse. Givare kan vara så kort som 150 baser lång. Although Det finns ingen gräns för hur länge sonden, fragment kortare än 1,5 kb typiskt transkribera bättre. DNA-fragment som ska transkriberas är klonade i en vektor som innehåller T3, T7 eller SP6 initiativtagare (t.ex. pCRII-Topo, Invitrogen). Alternativt kan T3, T7 eller SP6 sekvenser arrangören ingå som en 5'-tail på baksidan grundfärg som används för att förstärka sonden regionen.
    I varje in situ hybridisering experiment inkluderar vi en positiv kontroll sond för vilken hybridisering mönster är kända och som arbetar konsekvent, liksom en negativ kontroll (Figur 1D och H). Det senare kan vara en slumpmässig RNA sond som är känd för att inte hybridisera till någon avskrifter i vävnaden av intresse. Även om det är vanligt att använda den meningen sond av genen som analyseras, detta är inte nödvändigt och icke-hybridisering RNA kommer att passa ändamålet. Om tillgängligt, skulle vävnader från en transkriptionell null allel av genen av intresse att fungera som en utmärkt negativ kontroll.
  2. In vitro transkription
    1. Linjärisera plasmiden genom uppslutning av ca 5 mikrogram DNA med en begränsning enzym som smälter i slutet av insatsen mittemot platsen för arrangören. Använd inte restriktionsenzym som lämnar en 3'-överhäng. Detta kan leda till transkriptionen artefakter eftersom polymeras kan utnyttja 3 "överhäng som substrat för att fortsätta transkription. Alternativt kan sonden regionen, inklusive T3, T7 eller SP6 projektansvarig förökas med PCR för att generera DNA-mall för in vitro transkription reaktion.
    2. Kontrollera en alikvot på en gel för att verifiera att reaktionen har gått till färdigställande.
    3. Extrahera DNA med fenol / kloroform, fällning med etanol och återsuspendera DNA pelleten i milliQ H 2 O till en koncentration av 1μg/μl. Alternativt kan DNA rengöras med vanliga kolumner DNA-rening.
    4. Ställ in in vitro transkription reaktion genom att blanda:
      • 1μl purified DNA (1μg/μl)
      • 2μl 10x transkription buffert
      • 2 mikroliter 10x DIG RNA-märkning mix
      • 1μl RNAse UT
      • 2μl T3, T7 eller SP6 RNA-polymeras (20 U / l)
      • H 2 O upp till 20μl.

      Inkubera vid 37 ° C under 1 till 2 timmar. Håll 1μl att analysera på en gel senare.
      Obs: Fluorescens-märkta prober är att föredra i djur-system men på grund av den höga auto-fluorescens av de flesta växtvävnad, in situ hybridisering protokoll för växter använder radioaktivt märkt sonder 17 eller oftare DIG-märkta prober som upptäcks av immunohistokemi.
    5. Ta bort DNA-mallen genom att lägga till 75 mikroliter MilliQ H 2 O och 5 mikroliter RQ1 DNAse (1 U / l) till transkriptionen reaktionen och inkubering av reaktionen vid 37 ° C i 10 min.
    6. Rena som en reaktion in vitro transkription för att eliminera icke bildat nukleotider och små utskrifter. En möjligansvar är att använda en storlek-utanförskap Sephadex ® kolumn, exempelvis mini Quick Spin RNA Columns (Roche). Alternativt kan transkription reaktion renas genom en konventionell LiCl / etanol nederbörd (se ref. 14). Håll 1μl att kolla på en gel senare.
    7. Sonder över 250 baser i längd är vanligen delvis hydrolyserad att få RNA-molekyler på cirka 150 NT och därför tillräckligt små för att effektivt penetrera vävnadssnitt. Lägg till en lika stor volym 2x karbonat buffert (80 mM NaHCO 3, 120 mm Na 2 CO 3) för att det renade transkription reaktionen och inkubera vid 60 ° C. Inkubationstiden bör beräknas med följande formel:
      tid = (Li - LF) / (K x Li x Lf)
      där Li = ursprunglig givare längd (i kb), Lf = slutlig sond längd (0,150 kb), K = 0,11 kb / minut. Håll 2 mikroliter att kolla på en gel.
    8. Neutralisera hydrolys reaktionen genom att tillsätta 1 / 20 volym på 10% ättiksyra.
    9. Sonden är då Purirats av att lägga 1μl av tRNA (100mg/ml), 1 / 10 volym 3M NaAc pH 5,2, plus 2,5 volymer kalla 100% etanol, och inkuberas vid -80 ° C i 30 min. Fällning RNA genom centrifugering vid 13.500 rpm i 20 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och skölj RNA pellets med 500μl 70% etanol. Centrifugera igen, låt pelleten lufttorka (typiskt ca 15 min) och resuspendera RNA i 50μl 50% avjoniserat formamid. Sonden ska förvaras vid -80 ° C fram till användning.
    10. Kolla på en vanlig 1% Tae-agarosgel den färdiga produkten samt mellanprodukter från avsnitt 2.2.4, 2.2.6 och 2.2.7 (Figur 2A). Detta möjliggör övervakning av effektiviteten i in vitro transkription reaktion.
      Obs: In vitro transkription reaktion ska ge ca 1 mikrogram av RNA per 1 mikrogram av mall.
  3. Dot blot-analys
    Sonden koncentration och DIG-UTP inbyggnad kan bedömas genom dot blot-analys (Figur 2B). Serial RNA spädningar är fläckig på en standard hybridisering membran tillsammans med en märkt kontroll RNA med känd koncentration. Till exempel använder vi DIG-UTP märkt kontroll RNA sond som ingår i in vitro transkription kit (Roche). Det är bäst att testa flera spädningar för varje sond för att upprätta en exakt koncentration.
    1. Förbered blockerande buffert genom att lösa upp 0,5% av Blocking Reagent i 1x TBS buffert (100 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl) vid 70 ° C, låt lösningen svalna till rumstemperatur.
    2. Spot 1μl av spädningar (typiskt 10 -1 till 10 -5) av in vitro-transkriberat och kontroll sonder på ett N + nylon membran. Fäst RNA med UV förnätning.
      OBS: En minimal yta av membranet bör användas för att minska volymen av buffertar som behövs senare.
    3. Jämvikta membranet i 1x TBS i 5 min i rumstemperatur (RT) på en skakande plattform.
    4. Blockera membranet med hjälp av den blockerandebuffert för 30 min vid RT på en skakande plattform.
    5. Skölj membranet i 1x TBS i 5 min.
    6. Inkubera membran med anti-DIG antikropp, späda 1μl Anti-digoxigenin-AP i 10 ml 1x TBS, för 45 min vid RT.
    7. Tvätta membranet två gånger i 1x TBS i 15 min vardera.
    8. Jämvikta membranet i 1x TN buffert (100 mm Tris-HCl pH 9,5, 100mm NaCl) i 5 minuter.
    9. Fläck membranet genom inkubering med NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) i 1x TN buffert. Färgning kan ta 5-10 min. Efteråt skölj membranet med vatten, det kan sedan torkas och hålls som en post.
      Obs: NBT / BCIP är ett substrat för den alkaliska fosfatas konjugerat till anti-DIG antikropp som vid hydrolys ger en mörkblå färg.

3. Sektionering

  1. Varm blocken till rumstemperatur. Om blocken är för kallt, kan enskilda avsnitten rulla över utan att bilda ett vax "band". Skär blocket i en trapeZoid form vilket innebär att ungefär 1 mm av vax runt provet.
  2. Värm upp en stor bild varmare vid 35-37 ° C.
    Obs! Många protokoll gör detta steg vid 42 ° C dock sänka temperaturen till 35-37 ° C förhindrar uppkomsten av bubblor under avsnitten.
  3. Placera blocket på mikrotomen så att den längre av de två parallella ansikten är i botten. Försiktigt föra blocket fram till bladet och se till att ytan på blocket är parallellt med klingan. § med en tjocklek på 8 - 10μm. Vaxet band kan anpassas till en icke-klibbig yta, t.ex. aluminiumfolie eller filterpapper, för att markera delar av intresse. Detta kan bedömas med hjälp av en närliggande dissekera mikroskop.
    Obs: eosin färgning av vävnad ger en indikation om huruvida vävnaderna riktigt har infiltrerats under inbäddning. Om mitten av blocket inte färgas med eosin Det tyder på att vävnaden är dåligt är fast.
  4. Markera Probe-on Plus slIdes, med en penna (de flesta pennor eller markörer raderas under in situ hybridisering protokoll) och distribuera 1 mL ren milliQ H 2 O på den. Försiktigt flyta delar av ränta på ytan av vatten vid rumstemperatur (det är lättare att manipulera de delar på vattnet när man arbetar vid rumstemperatur). Se till att den blanka sidan (undersidan som bandet lossnar från mikrotomen) vetter mot vattnet. Sedan överföra bilden sakta på bilden varmare. Uppvärmning hjälper avsnitt för att spridas på ytan av vattnet. Efter 5 min, häll av vattnet försiktigt men i en jämn rörelse, så bandet sänks ner på bilden. Låt objektglasen torka i minst flera timmar eller över natten vid 37 ° C, så att vävnaden fastnar.
    Obs: delad vävnaden kan lagras i en låda med kiseldioxid torkmedel för ett par dagar till veckor vid 4 ° C, men det är bäst att använda bilderna så snart som möjligt.

4. In situ Hybridnisation

  1. § förbehandling
    Den volym som behövs för varje lösning beror givetvis på hur många bilder som ska behandlas och behållaren storleken. Avsnitten ska alltid vara helt under vatten. För en 25-bild rack och ett snyggt passande behållare är 200-250 ml räcker. Eftersom många av inkubationstiden stegen är mycket korta, förbereder vi brukar alla möjliga lösningar först och sedan starta den bild förbehandling. Kommer dock att ättiksyraanhydrid lösning måste beredas omedelbart före användning och proteas läggs vid användningen. Alla steg utförs i rumstemperatur om inte annat anges. Dessutom kan alla buffertar vara beredd på 10x koncentration som en stamlösning.
    1. Värm proteas buffert (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) i behållaren till 37 ° C.
    2. Deparaffinize och rehydrera vävnadssnitt enligt följande:
      • histoclear - 10 min (använd en glasskål)
      • histoclear - 10 min (använd englasskål)
      • 100% etanol - 1 min
      • 100% etanol - 30 sek
      • 95% etanol - 30 sek
      • 85% etanol - 30 sek
      • 70% etanol - 30 sek
      • 50% etanol - 30 sek
      • 30% etanol - 30 sek
      • 10% etanol - 30 sek
      • milliQ H 2 O - 1 min
    3. Inkubera i 1x PBS i 2 min.
    4. Blanda 625μl av proteas 50mg/ml i 250 ml proteas buffert förvärmas till 37 ° C och inkubera objektglasen i 20 minuter vid 37 ° C.
      Obs: proteas krävs för att smälta fast proteiner och öka sond tillgång till cellulära RNA. Det är viktigt att kontrollera tiden för inkubationstiden för att maximera hybridisering signalen utan uppdelning av vävnad och därmed en del optimering kan krävas för varje vävnadsprov.
    5. Neutralisera proteas aktivitet i 0,2% glycin i 1x PBS i 2 min.
    6. Skölj objektglasen gång i 1x PBS i 2 min.
    7. Behandla bilderna in 4% PFA-lösning i 10 min att åter fixera RNA som kan skadas av proteas behandling.
    8. Skölj objektglasen två gånger i 1x PBS i 2 min vardera.
    9. Medan bilderna är i PBS tvättar, utgör 250 ml 0,1 M trietanolamin, pH 8,0 genom att blanda 12,5 ml 2M trietanolamin (29.8g i 100ml milliQ H 2 O, pH8.0 med HCl) till 236,25 ml milliQ H 2 O i en glasskål. Tillsätt 1,25 ml ättiksyraanhydrid i trietanolamin buffert omedelbart innan man lägger bilderna i och rör om väl. När du lagt till bilderna, fortsätter att röra sakta i 10 minuter.
      Detta kräver att bilden rack är förhöjd i behållaren för trietanolamin / ättiksyraanhydrid. Vi använder ett fastspänningssystem med stöd stativ.
      OBS: I detta steg positivt laddade aminosyror grupper som kan leda till icke-specifik bindning av sonden är acetylerade. Dessutom är ättiksyraanhydrid giftigt, denna lösning bör därför beredas i ett dragskåp och kasseras på rätt sätt <./ Li>
    10. Skölj objektglasen två gånger i 1x PBS i 2 min.
    11. Torka av vävnadssnitt igen:
      • H 2 O - 1 min
      • 10% etanol - 30 sek
      • 30% etanol - 30 sek
      • 50% etanol - 30 sek
      • 70% etanol - 30 sek
      • 85% etanol - 30 sek
      • 95% etanol - 30 sek
      • 100% etanol - 30 sek
      • 100% etanol - 30 sek
      OBS: Objektglas kan förvaras i en behållare med en liten mängd 100% etanol i botten upp till flera timmar vid 4 ° C.
  2. Hybridisering
    1. Värm en värmeblock till 85 ° C.
    2. Förbered hybridisering buffert. För 10 ml, blanda i en Falcon rör 1,25 ml in situ hybridisering salter (3M NaCl, 100mm Tris-HCl pH 8,0, 100mm Na Fosfat pH6.8, 50mm EDTA), 5 ml avjoniserat formamid, 2,5 ml 50% dextransulfat, 250 l 50x Denhardt, 125 l 100mg/ml tRNA och 875 l H 2 O. <br /> Obs! dextransulfat är mycket trögflytande, så det är bäst att förvärma lösningen till 60 ° C för att göra pipettering lättare. Hybridisering buffert kan förvaras vid -20 ° C.
    3. Förbered olika sonder. För varje bild, blanda 1 l sond med 9 l milliQ H 2 O och 10 l avjoniserat formamid. Värm sond vid 85 ° C i 2-3 minuter, omedelbart chill på is, centrifug kort och lägga sonden till 80μl hybridisering buffert per bild. Blanda väl genom att pipettera, men undvika att göra bubblor.
      OBS: Mängden sond som ska läggas per bild måste testas empiriskt. Generellt är sonder används vid en slutlig koncentration på 0,5 ng / kb / l sond komplexitet. Eftersom hybridizations utförs med 100 l per bild, är ca 25 ng av givare som behövs per bild för givare som är 0,5 kb i längd och 50 ng givare per bild för sonder som är 1-kb lång. För enkelhetens skull försöker vi ofta 0,5, 1 och 4 l sond per bild.
    4. Placera glasen på enren yta och låt dem lufttorka helt 5-10 min. Pipettera sonden / hybridisering buffert blandningen på den högra kanten av bilden. Successivt lägre på ett täckglas på bilden, och se till att hybridisering lösning täcker alla avsnitt utan några bubblor. Peka på täckglas lätt med fingret där det bildas bubblor att tränga undan dem från alla vävnadssnitt. Dra inte locket glida av, eftersom detta kommer att skada delarna.
      OBS: En alternativ metod som vanligen används för detta steg är att förbereda "smörgåsar" av två bilder som inkuberas med samma sond. För mer information om denna metod, se ref. 14.
    5. Förbered en fuktkammare i en helt platt plastlåda. Täck botten på lådan med Whatman fukta milliQ vatten, täckt pappret med parafilm lämnar hörnen avslöjade, placera bilderna i plastlåda och försegla lådan ordentligt.
    6. Inkubera objektglasen på önskad hybridisering temperatur, normalt 50 - 55 ° C, Feller 16-20 timmar.
    7. För användning nästa morgon, bereda 1 liter 0,2 X SSC och lagra vid 55 ° C. Dessutom bereda 1 liter NTE buffert (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA pH8.0) och förvara vid 37 ° C.
  3. Post-hybridisering behandling
    1. Ta bort täckglasen noggrant för att inte skada avsnitt. Placera objektglasen i ett rack och tvätta dem två gånger i 0,2 X SSC vid 55 ° C i en timme.
      Obs: Täckglas ofta faller av lätt när bilderna är placerade upprätt. Om täckglas sitter kvar, sänk bilden i varma 0,2 X SSC för 1 eller 2 min att tvätta täckglaset av. Undvik att dra täckglas på bilden, eftersom detta kan orsaka skador på delarna.
    2. Under tiden förbereder 500 buffert ml tvätt (1% BSA, 0,3% Triton i TBS buffert) och 100 ml blockerande lösningen (0,5% blockering av reagens i TBS buffert). Rör blockering pulvret i TBS som sakta värms till 70 ° C och låt den svalna till rumstemperatur gång dissolved.
      Obs: volymer tvätt buffert och blockerande lösningen som behövs varierar beroende på storleken på platt plastlådan som används i steg 4.3.8 -11. Det kommer att ta tid att helt lösa upp Triton, så förbered nog lösningen i förväg.
    3. Jämvikta bilderna i 1x NTE i 2 min.
    4. Fortsätt till RNAse En behandling genom att överföra bilderna till 1x NTE buffert som 20μg/ml RNAse A skall läggas strax före användning, inkubera vid 37 ° C i 30 min.
      OBS: RNAse En klyver fria inre RNA samt på obalanser i RNA-duplex. Detta steg hjälper till att minska graden av icke-specifik bindning av sonden, som klyvs sonderade fragment tvättas bort i den sista 0,2 X SSC tvätt (se 4.3.6).
    5. Skölj objektglasen två gånger i 1x NTE i 2 min vardera.
    6. Tvätta bilderna i färskt 0,2 X SSC vid 55 ° C i en timme.
    7. Jämvikta bilderna i 1x PBS i 5 min i rumstemperatur.
    8. Överför bilder från racket på the botten av en platt plastlåda och täck dem med en minimal mängd blockerande lösningen. Blockera bilder i 45 min på en sakta skakar plattform.
    9. Överför bilderna till en andra rent platt plastask och tvätta dem i 45 min med tvätt buffert på en skakande plattform.
    10. Fortsätt till antikropp inkubation. Späd anti-digoxigenin antikropp i tvätt-buffert (1:5 v / v) och antingen använda en liten mängd direkt på varje diabild eller placera glida in i en platt plastask och täck dem med en minimal volym antikroppar lösning. Inkubera objektglasen i mörker i 2-3 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
    11. Tvätta diabilder 4 gånger 15 minuter vardera med tvätt buffert på skaka plattform. Använd en minimal mängd av tvätt buffert och en platt plastlåda. Rengör plastlådan mellan varje tvättar.
      Obs: Rengöring rutan mellan tvättarna kommer minskas den allmänna bakgrunden på bilden. För att förenkla detta använder vi två identiska platta lådoroch överföra bilderna till en ren låda efter varje tvätt.
    12. Överför glider in 1x TBS i 2 min.
    13. Jämvikta bilderna i TN buffert två gånger i 2 min vardera.
    14. Bered färglösningen omedelbart före användning genom att lägga till 20 l NBT / BCIP per 1 ml TN buffert. Häll av färglösningen i en liten plast vågskål. Sandwich två bilder tillsammans med sektionerna mot varandra. Doppa en långsida smörgås i lösningen, vilket gör att kapillärkraften att dra upp lösningen. Tappa glasen på en Kimwipe och fylla bilderna med antikroppen lösningen igen. Du kan behöva trycka på bilderna som lösningen flöden för att undvika bubblor. Placera bilderna i en plastlåda och förvara i rumstemperatur i mörker.
    15. Dag 10 till dag 15: Uppdatera färglösningen två gånger dagligen under 1-5 dagar genom att skölja bilderna i TN buffert och förbereda nya smörgåsar med färska färglösningen.
      Observera: Byte av färglösningen jämna intervals kommer att förbättra signal till bakgrunden förhållandet. Utveckling av signalen kan övervakas under en förening eller stereomikroskop. Det är möjligt att fotografera avsnitten medan de är i TN buffert mellan rundor av färgning eller när de överförs till vatten precis innan permanent montering.
  4. Montering
    1. När signalen är uppenbar, skölj glasen i milliQ H 2 O och torkar dem snabbt genom en etanol-serien:
      • 10% etanol - 10 s
      • 30% etanol - 10 s
      • 50% etanol - 10 s
      • 70% etanol - 5 s
      • 80% etanol - 5 s
      • 95% etanol - 5 s
      • 100% etanol - 5 s
      • histoclear - 2 min
      • histoclear - 2 min
      Obs: Se till att hålla alla dessa inkubationstider kort, eftersom signalen är etanol lösliga.
    2. Montera bilderna genom att placera en eller två droppar toluenbaserade monteringsmedium på varje glede och långsamt sänka täckglas på bilden undvika uppkomsten av bubblor. Låt monteringsmedium härda över natten innan analys av resultatet i ett sammansatt mikroskop. När monterad, kan diabilder förvaras i flera år i rumstemperatur.

5. Representativa resultat:

Efter 1-5 dagar kommer en röd-lila-signal utvecklas i de celler där sonden har hybridiseras till kompletterande avskrifter (figur 1). Färgen signalen ger alltså en direkt visualisering på cellulär upplösning av uttrycket mönstret av genen av intresse. En svagare bakgrundsfärgning kan också utveckla, till följd av icke-specifik bindning av sonden eller färgning av växtvävnad (Figur 3). Sådana bakgrunden signalen kan vara relativt sett mer uttalad i de små, mindre bestämd celler i vävnaden, men bakgrundsfärgning skulle också iakttas i sektioner hybridiseras till negativ och positiv kontroll sonder och skulle intevara reproducerbara mellan experiment.

Figur 1
Figur 1. Representativa resultat som erhållits med olika sonder på Arabidopsis och majs vävnader. In situ hybridizations av Arabidopsis (AD) och majs (EH) vävnader med olika genspecifika prober som illustrerar den typ av resultat som kan förväntas när det framgångsrika slutförandet av den skisserade protokollet. (A) Lokalisering av SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) i Arabidopsis vegetativa skott spetsen, notera förekomsten av lila blå signal i obestämd cellerna i meristem och bristen på signaler i omgivningen bladen. (BD) Delar av Arabidopsis torped stadium embryon visar CLAVATA3 (B) uttryck i de få embryonala stamceller, sonderade AtML1 (C) uttryck i epidermal lagret, och bristen på signaler i sektioner med ett slumpmässigt negativ kontroll RNA (D). (E) Lokalisering av STM homolog knotted1 i utvecklingsländerna majs embryot, notera den starka signalen särskilt i embryonala meristem och rot. (FH) längdsnitt genom vegetativa skott apex från majs visar tydliga in situ hybridisering mönster för arf3a (F) och ocl4 (G) och ingen hybridisering signal för den negativa kontrollen sond (H). arf3a uttrycks på abaxial / botten blad yta, medan AtML1 homolog ocl4 uttrycks specifikt i epidermis.

Följande genen fragment användes som givare: STM: det cDNA region som omfattar aminosyrorna från 81 till 382, vilket inkluderar bevaras homeodomain, CLV3: full längd cDNA, AtML1: den tredje exon, kn1: Hela öppen läsram; arf3a: nukleotider från 9 till 225 av cDNA klon HM004539, ocl4: 3 '1,7 kb i full längd cDNA, som innehåller flera bevarat protein domäner.


Figur 2. Kontroll poäng samtidigt som in vitro transkription sonder. (A) In situ hybridisering sonder kontrolleras på en standard agarosgel efter in vitro transkription (en), efter DNas behandling och efterföljande rening av in vitro transkription reaktion (b), efter karbonat hydrolys-vid behov-(c) och när färdiga för användning (d). För sonder över 250 bp i längden, som givare 1, kommer karbonat hydrolys ger en rad mindre sond fragment (fäste). (B) kolorimetri kvantifiering av sonder med dot blot analys. Utspädningar från 10 -1 till 10 -5 av en 100 ng / l styrning probe (1) och tre nya DIG-märkta prober (2-4) är fläckig på en överföring av membran, inkuberas med anti-DIG antikropp, och analyserade med kolorimetriska analys som beskrivs i avsnitt 2.3 i protokollet. Analysen visarFöljande beräknade koncentrationer: probe 2, ~ 100 ng / l, givare 3, ~ 10 ng / l sond 4, ~ 1 ng / l. Probe 4 är osannolikt att ge en god in situ hybridisering signal.

Figur 3
Figur 3. Jämförelse av en icke-specifik proben till en väl fungerande sond. Längdsnitt genom vegetativa skott apex från majs som visar en icke-specifik bakgrund signal (A) och en specifik situ hybridisering signalen för OCL5 sonden i det yttre cellager (B).

Figur 4
Figur 4. Diagram som visar tidslinjen steg i in situ hybridisering protokollet. Mjukpapper bädda steg förekommer i grönt, probe-förberedelser steg i orange, och in situ hybridisering steg i blått. Denna tidslinje anser att DNA templaTe för in vitro transkription av sonden är tillgänglig. Parafin-inbäddad vävnad block och DIG-märkta prober kan förberedas i förväg och förvaras vid 4 ° C och -80 ° C, respektive fram till tidpunkten för användning. In situ hybridisering protokollet kan sedan fyllas i så lite som fyra dagar.

Discussion

In situ hybridisering metod som beskrivs här låter direkt visualisering av Spatiotemporal uttryck mönster av varje gen av intresse med stor cell upplösning, hög känslighet och specificitet. Protokollet tillåter inte en kvantitativ jämförelse av uttryck nivåer mellan gener. Däremot kan metodens hög känslighet och upplösning avslöja gradienter av genuttryck i en vävnad 8, 18, ​​vilket inte är möjligt med de flesta andra metoder för analys av genuttryck.

Protokollet innehåller många steg, vilket kan göra felsökning problematiskt. Den mest kritiska stegen i protokollet är upptagningen av vävnad och urval och märkning av sonden. Dåligt infiltrerat vävnader och sonder med låga DIG bolagsordning kommer att ge mycket svaga signaler som kan vara svåra att upptäcka ovanstående bakgrund. För varje ny gen, är det lämpligt att prova några olika sonder från diffehyra delar av utskriften. Ibland kan två eller tre sonder inriktade på olika mindre regioner av genen behöver kombineras för att få en stark och specifik hybridisering signal. Dessutom, de hybridisering villkor, såsom temperatur och sammansättning hybridisering bufferten kan optimeras för varje gen eller vävnad för att sänka eller öka hybridisering stringens. Även proteas behandling steget är en variabel och kan ändras för att anpassa protokollet för olika växtarter eller för detektering av avskrifter med mycket begränsad omfattning. Införandet av både positiva och negativa kontrollen sonder kan vara till hjälp för att identifiera problematiska punkter i protokollet.

Förfarandet är optimerad för paraffininbäddade sektioner växtvävnad men med mindre ändringar kan användas även för hel-montera in situ hybridisering. Även ofta används i djurförsök 19, hela montera in situ hybridisering kommer att limited att plantera vävnader som enkelt kan infiltreras, såsom embryon, rötter eller unga meristematic vävnader 20,21. Protokollet kan även enkelt ändras för att simultant detektera två olika mRNA eller lokalisera avskrifter tillsammans proteiner 15,22,23. Slutligen är det möjligt att utsträcka tillämpningen av denna metod för visualisering av små RNA-uttryck mönster i växter. miRNA uttryck mönster har bestämts med hjälp av detta protokoll i både majs och Arabidopsis 8,14. På senare tid har in vitro transkriberade sonder ersatts av kommersiellt tillgängliga DIG-märkt låst nukleinsyra (LNA) oligo sonder som ökar signal känsligheten 18, 24.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Forskning i laboratorium MT stöds av anslag från National Science Foundation (DBI-0.820.610 och IOS-1.022.102) och New York Department of Health (NYSTEM-C024308). CM fick postdoktorala stipendier från det spanska ministeriet för utbildning och vetenskap (2007-0937) och stiftelsen Rafael del Pino, Spanien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytoseal 60 4oz Fisher Scientific 23-244-256 Toluene-based 8310-4
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus Fisher Scientific 23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL Invitrogen 10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl Promega Corp. M6101
DIG-labeled Control RNA Roche Group 11585746910
DIG RNA labeling mix Roche Group 11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U Roche Group 10881767001
RNase-A Roche Group 109142 dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent Roche Group 1 096 176 Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U Roche Group 1 093 274
NBT/BCIP stock solution Roche Group 1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns Roche Group 11814427001
tRNA from E. coli Roche Group 109541
Triton®X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV Sigma-Aldrich P5147 Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279 Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride Sigma-Aldrich A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate Sigma-Aldrich D2532
Albumin from bovine serum - ≥98% Sigma-Aldrich A7906
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds Electron Microscopy Sciences 62352-15
Embedding rings Fisher Scientific 22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps VWR international 66020-326
Probe-on-plus slides Fisher Scientific 22-230-900
Micro cover glasses 24x50 mm VWR international 48404-452
Whatman paper 3mm VWR international 89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack Electron Microscopy Sciences 71420-25 Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers Electron Microscopy Sciences 71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes Help handing wax ribbons
Microtome Leica
Self-cleaning dry vacuum system Welch Allyn 2025
Slide warmer Fisher Scientific
Heating block needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C Fisher Scientific For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C Fisher Scientific Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C - 20°C)
Fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
  2. Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
  3. Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
  4. Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
  5. Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
  6. Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
  7. Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
  8. Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
  9. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
  10. Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
  11. Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
  12. Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
  13. Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
  14. Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
  15. Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
  16. Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
  17. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
  18. Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
  19. Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
  20. Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
  21. Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
  22. Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
  23. Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
  24. Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).

Tags

Växtbiologi , RNA lokalisering expressionsanalys växt DIG-märkt probe
<em>In Situ</em> Hybridisering för exakt lokalisering av transkript hos växter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Javelle, M., Marco, C. F.,More

Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328, doi:10.3791/3328 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter