Summary
Laser axotomy etterfulgt av time-lapse imaging er en følsom måte å analysen effekten av mutasjoner i
Abstract
Laser axotomy etterfulgt av time-lapse mikroskopi er en følsom analyse for axon regenerering fenotyper i C. elegans 1. Det største hinderet for denne analysen er den oppfattes koster ($ 25-100K) og teknisk kompetanse som kreves for å gjennomføre en laser ablasjon system 2,3. Kan imidlertid solid-state puls lasere av beskjedne kostnader (<$ 10K) gir robust ytelse for laser ablasjon i gjennomsiktig forberedelsene hvor target axons er "close" til vevsoverflaten. Konstruksjon og innretting av et system kan gjennomføres på en dag. Den optiske stien leveres av lys fra den fokuserte kondensatoren til ablasjon laser gir en praktisk innretting guide. En mellomliggende modul med all optikk fjernet kan være dedikert til ablasjon laser og forsikrer at ingen optiske elementer må flyttes i løpet av en laser ablasjon økt. En dichroic i den mellomliggende modulen tillater samtidig bildebehandling og laser ablasjon. Sentrering laserstrålen to den utgående strålen fra den fokuserte mikroskop kondensator objektiv guider den første justeringen av systemet. Et utvalg av linser brukes til stand og utvide laserstrålen til å fylle baksiden blenderåpning på valgt objektiv. Endelig justering og testing er utført med en front overflate speilglass skyve målet. Laser strømmen er justert for å gi en minimum størrelse ablasjon spot (<1um). Den ablasjon spot er sentrert med finjusteringer av de siste kinematically montert speil til trådkorset fast i bildebehandling vinduet. Laser strøm til axotomy vil være ca 10X høyere enn nødvendig for den minste ablasjon flekk på målet lysbildet (dette kan variere med målet du bruker). Ormer kan være immobilized for laser axotomy og time-lapse bildebehandling ved montering på agarose pads (eller i microfluidic kamre 4). Agarose putene er lett gjort med 10% agarose i balansert saltvann smeltes i en mikrobølgeovn. En dråpe av smeltet agarose er plassert på et glass slide og flatet med en annenglass gli inn i en pute rundt 200 um tykk (et enkelt lag av tid tape på tilstøtende lysbilder brukes som en spacer). En "Sharpie" cap brukes til å kutte ut en uniformert diameter rund pute av 13mm. Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokuler (Chris Fang-Yen personlig meddelelse) (1ul 2,65% Polystyrene 0,1 um i vann) er lagt til midten av puten etterfulgt av 3-5 ormer orientert slik at de blir liggende på sin venstre side. Et glass dekkglass er brukt, og deretter vaselin brukes til å forsegle dekkglass og hindre fordamping av prøven.
Protocol
1. Bygging av en laser ablasjon system
Bruk laser vernebriller og bruk god laser sikkerheten praksis under den første justering. Se aldri gjennom okulars når laseren er på.
- Ordne komponentene på breadboard som vist i fig. 1 (se også eksempel 2). Bolt ned laser (med en riser plate hvis nødvendig), periskop post, og den forhøyede rail støtter.
- Plasser mikroskop for å justere med skinnen aksen. Juster med den overførte lysstråle fra mikroskopet kondensator linsen. Plasser skinnen høyden (bruk et nivå) og posisjon med en justerbar blender eller en linse festet til rekkverket. Blenderåpningen eller linsen må være justert i begge ender av skinnen til kondensatoren strålen. Lab Jacks kan hjelpe med rail høydejustering.
- Juster Glan-Thompson polarisator og halv-wave plate til laserstrålen. Du trenger ikke laser på å gjøre denne justeringen. BEAM trenger bare å gå gjennom begge uten å treffe kantene. Roter polarisatoren å gi en praktisk orientering og posisjon for strålen dump (fig.1). Du vil rotere en halv bølge plate å justere laser makt. Fest komponenter til breadboard.
- Slå på laser, sette pulsfrekvens til 100, kontinuerlig modus, og redusere strømforbruket til et minimum ved hjelp av den halve bølge plate. Bruk en Post-it lapp eller linsepapir å visualisere laserstrålen.
- Juster og fest kinematically montert speil i rekkefølge fra laseren for å få strålen opp til speilet som er montert på enden av forhøyet skinnen. Laserstrålen bør være på linje omtrent til midten av speil. Speilene skal være orientert om lag 45 grader til laserstrålen aksen (fig.1).
- Grovt justere kinematically montert speil på toppen av periskop og på enden av skinnen å justere laserstrålen til sentrum av den overførte lysstråle fra mikroskopet. Både laserstrålen og than overført lysstråle fra mikroskopet kan samtidig visualiseres ved å sette inn papir i strålen banen. Sørg for at eventuelle ND filter og åpninger i den mellomliggende modulen er ute eller helt åpen.
- Fint justere laser strålen til midten av den overførte lysstråle med finjusteringer på toppen periskop og jernbane speil. Hold papiret nær jernbane speilet og justere laser strålen til midten av den overførte lysstråle med den øverste periskop speilet. Hold papiret nær mikroskopet porten og juster laserstrålen til sentrum av den overførte lysstråle med skinnen speilet justeringer (fig.2).
- Plasser en Post-it lapp i strålen banen mellom justert kondensatoren objektivet og det åpne målet turret. Du bør se overført lysstråle med mindre laserstråle nær sentrum. Bruk finjusteringer på skinnen speilet for å sentrere laserstrålen. Fix mikroskopet på plass med klemmer.
Trinn 10,9 til 1,12 er valgfrie, men det er enkelt og nyttig å vurdere justering og laser ablasjon før du legger strålen ekspanderende linser.
- Slå av laser og engasjere den mekaniske sikkerheten utløseren. Roter 50% dichroic ut av strålen banen. Selv om ingen direkte laserlys vil passere til okulars, kan det reflekterte lyset være ganske intense. Mount målet skyv for den fine innretting og bilde med 60X olje målet. Fokus på riper på lysbildet. Sett i ND4 og ND8 filter i mellomliggende modul.
- Bilde målet lysbilde med CLSM din, Spinning disk, eller CCD kamera system. Roter 50% dichroic inn laseren banen. Fra dette punktet, bør du aldri ser gjennom okulars mens ablasjon laser er på. Slå på ablasjon laser og sette modus til utløst, frekvens til 100, og puls nummer til 10 år. Kontroller at strømmen er fortsatt satt til minimum med den halv-bølgen plate og deretter åpne den mekaniske sikkerheten utløseren. Du kan simultanlistig image og bruke ablasjon laser.
- Mens bildebehandling målet lysbildet, utløse ablasjon laser. Sjekk målet lysbilde for en ablasjon sted 10-10 um i diameter. Sekvensielt fjerner ND filter til en ablasjon sted er sett. Juster ablasjon flekken til midten av bildet med rail speilet. Du vil ønske å legge tilbake et ND filter for å ha plass til fint øke laser strøm med den halv-bølgen plate å gi en <1 UM ablasjon spot. Bilde på 0,2 UM / pixel eller mindre og fint justere ablasjon flekken til bildet sentrum (posisjon 256256 med 512X512 bildet).
- Sjekk dybden av fokus og aksen av laserstrålen. Fokus opp og ned 1-2 um og sjekke ablasjon posisjon og ablasjon spot størrelse. Hvis laserstrålen er aksialt justerte ablasjon flekken ikke vil flytte. Den unconditioned Laserstrålen vil fordele makt over flere um (ca 3-5 um fra topp til bunn av fokus).
2. Legg linsene å utvide laserstrålen til å fylle målet tilbakeblenderåpning og justere konvergens å kontrollere fokus
- Dette systemet bruker dual galileiske stråle expanders å utvide laserstrålen til å fylle baksiden blenderåpning på målet (10 mm). Monter 4 objektiver til bærere og feste dem til skinnen (L1f1 + L2f2 og L3f1 '+ L4f2'). Juster posisjoner slik at alle objektiver er på samme optiske akse og akkurat ortogonal til laserstrålen (fig. 2).
- Slå på laser og juster den til minimum kraft og kontinuerlig modus. Grovt justere strålen justering gjennom hver linse bruker papir for å se laserstrålen og overført lysstråle fra mikroskop kondensatoren. Slå av og skodde laseren.
- Fjern klemmer fra den ene siden av mikroskopet og skyv mikroskop ut av laserstrålen banen. Slå på laser og fjerne sikkerhet shutter.
- Den fine justering av linsene og laserstrålen kan utføres ved å se den utvidede laserstrålen på en nærliggende vegg. Strålen bør utvide og kontrakt symmetrisk når lenses er flyttet. Juster de to siste kinematically montert speil for å justere stråle (fig.3).
- Den justert og utvidet bjelke profil skal være sirkulære og uniform lysstyrke (fig.3). Størrelsen og ensartethet av strålen kan sees med en Post-it lapp på antatt plassering av objektiv tilbake blenderåpning.
- Strålen bør justeres til null konvergens for uendelig optiske systemer. Konvergens kan estimeres ved å merke hvordan bjelken størrelsen endringene som du flytter en Post-it lapp lenger fra linser. Slå av laser og engasjere mekanisk lukker.
- Skyv mikroskop tilbake inn i laserstrålen bane ved den faste klemmene å definere riktig justering. Sett på klemmer på den frie siden av mikroskop, men ikke skru ned.
- Slå på laseren og fjerner sikkerheten shutter. Roter målet turret til en åpen posisjon. Plasser en Post-it lapp på scenen. Du bør se utvidet og uniform laserstråle sentrert på overførte lyset bEAM fra kondensatoren (Fig.4). Du må kanskje sentrum den ved å løsne mikroskop klemmer og nøye nudging mikroskop.
- Engasjere sikkerhet utløseren, og sett laser for å utløse modus. Roter 60X objektiv på plass og bilde overflaten riper på målet lysbildet.
- Ta sikkerheten utløseren, utløse ablasjon laser og justere laser strøm til minimum ablasjon spot. Den ablasjon stedet bør være sirkulære og innen 5-10 um av bildet sentrum.
- Sentrer ablasjon flekken med finjusteringer av kinematically montert skinne speil. Du må iterativt justere skinnemonterte og topp periskop speil både sentrere ablasjon spot og opprettholde en enhetlig bjelke profil.
- Vurdere Z fokus for laser ved å flytte fokus systematisk opp og ned i 1 UM trinn og utløser ablasjon laser. Den utvidede, justert, og konvergens justeres beam bør ablate maksimalt på bildet fokus og svakt eller ikke i det hele tatt en um abOve eller under fokus (fig 5).
- Juster Z fokus for utvidet strålen ved å flytte linse L3 av de galileiske teleskop (fig.2).
3. Laser axotomy og time-lapse mikroskopi av axon regenerering
- Mikrobølgeovn 10% agarose (RPI Molecular Biology Grade EEO 0,1 A20090) i balansert saltvann till helt smeltet. Sett på en varm plate for å holde det smeltet under bruk for montering.
- En dråpe av smeltet agarose er plassert på et glass slide og flatet med et annet glass lysbilde i en pad ca 200 um tykk (et enkelt lag av tid tape på tilstøtende lysbilder brukes som en spacer).
- En "Sharpie" markør cap brukes til å kutte ut en uniformert diameter rund pute av 13mm.
- Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokuler (Chris Fang-Yen, personlig meddelelse) (1ul 2,65% Polystyrene 0,1 um i vann) er lagt til midten av puten etterfulgt av 3-5 ormer orientert slik at de blir liggende på sin venstre side . Et glass dekkglass er brukt, og deretter VaselIne blir brukt til å forsegle dekkglass og hindre fordamping av prøven (figur 6).
- Den ablasjon laser er justert til trådkorset, som beskrevet ovenfor, ved begynnelsen av hver sesjon. Engasjere laser sikkerheten shutter.
- Fjern laser justering målet og image et montert voksen orm med en passende fluoriserende fargestoff i målet nevroner. Bilde axons på et tilsvarende forstørrelse (0,2 UM / pixel eller høyere forstørrelse) og posisjon under trådkorset (figur 7).
- Åpne laser sikkerhet lukker og utløse ablasjon laser mens imaging. Vurdere axon etter utløser laser og langsomt øke laser makt til axon er kuttet. Du trenger ca 10X mer laser makt til å skjære axons enn å danne en ablasjon sted på justeringen target lysbildet (om 1uJ / ns puls). Vi vanligvis kuttet med 100 pulser på 2,5 kHz og strøm satt til ca 0.27mW (gjennomsnittlig effekt målt på prøven med Coherent FieldMaxII kraftmåler og laser satt til kontinuerlig ved 2500 Hz). Den ablasjonlaser makt innstillingen vil bli konsekvent for å kutte axoner i senere eksperimenter (figur 7).
- En vellykket kutt axon vil vise en pause på ca 0,5 til 1 um uten tap av lysstyrke i de to kuttet endene (figur 7). Et stort tap av lysstyrke eller et stort gap (2-10 um) innebærer ofte omfattende skader utover axon av en kavitasjon boble. Den proksimale og distale axoner skal skille og form retraction pærer over de neste 30 minutter (fig. 8 og film).
- Likevekt din montert ormer med mikroskop scenen i 30 minutter før du starter din tid lapse opptak. Dette vil redusere drift på grunn av temperaturforskjeller og agarose sammentrekning.
- ) Time-lapse bildebehandling parametere er satt opp ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer tilknyttet systemet. Vi vanligvis image 10-20 Z trinn (1um/step) på 0,1 til 0,2 um / pixel bruker gain, pinhole, skanne rate, og bildebehandling laser makt innstillinger som minimerer eksponeringen samtidig som det gir ønsket romlig oppløsning. Sampling intervaller er typiskely 1-5 minutter over 15 timer, avhengig av ønsket tidsmessig oppløsning (fig. 8 og film).
- Time-lapse bildedata konverteres til filmer ved hjelp av NIS Elements eller ImageJ.
Fire. Representant Resultater:
Laser axotomy bruker dette systemet er en pålitelig og rutine. Resultatene er vist i figur 7 er typisk. Time-lapse avbildning av axon gjenfødelse er meget robust ved hjelp av denne protokollen. Vi rutinemessig kuttet og image opptil 5 axoner i 5 forskjellige ormer på et enkelt lysbilde ved hjelp av en motorisert stadium. Den eneste begrensningen er den tiden det tar å samle bilder av hver axon, for eksempel hvis det tar 20 sekunder å samle en stabel for en axon da på det meste du kan smake 9 axoner (9 stacks) hvis du er prøvetaking hvert 180 sekunder. Eksempelet vist i figur 8 og 9 er en god representant resultat. Omtrent 10% av forsøkene gir resultater av denne kvaliteten. De resterende forsøkene gir gode data på gjenfødelse fenotypen, men er estetisk unappealing på grunn av små jittering bevegelser av ormen som vanligvis begynner etter 5-8 timer med immobilisering.
Figur 1 laser ablasjon System. Den 532 nm Nd: YAG laser er montert på riser plate å bringe det til høyden på de andre komponentene, og boltet til breadboard. (Optisk isolator er valgfritt, og sannsynligvis ikke nødvendig). The Glan-Thompson polarisator og halv-bølge plate brukes til fint kontrollere laser makt. De er i fint kalibrert rotasjon mounts. Pass på å sette strålen dump. Hjørnet speilet leder laserstrålen til nedre periskop speilet. Den øvre periskop speilet styrer strålen til rekkverket speilet. Skinnen er montert på to stang støttede plattformer. Dual Galilean linser er festet til glideskinne mounts. Legg merke til den ekstra mellomliggende modul dedikert til ablasjon laser. Systemet kan gjøres mer kompakt ved å fjerne den optiske isolaTor og hjørnet speilet og omplassering av laser, Glan-Thompson polarisator og halv-wave plate i bakkant av breadboard.
Figur 2 Dual galileiske Conditioning linser brukes til å utvide de 300 um TEMoo laserstråle til en null konvergens uniform 10 mm størrelse. En lab jack er plassert under en av plattformene som holder skinnen. Det hjelper på å justere rail høyden under justeringen trinn. Grovt justere rail høyden ved å montere L1 objektivet til jernbane og bruke kondensator bjelken som en justering guide. Juster rail slik at kondensator strålen justeres til midten av linsen i begge ender av skinnen. Dette vil sikre at skinnen er justert parallelt med den optiske aksen av mikroskopet. Du må kanskje først justere mikroskop for å matche den optiske aksen av skinnen. Bruk tvinger å fikse posisjonen til mikroskopet (se fig. 1). Fjern the rail montert linse. Nå justere laser strålen til midten av kondensatoren bjelken i begge ender av skinnen. En papir i strålen bane er en praktisk måte å se både bjelker samtidig. Bruk den øverste periskop speilet for å justere laserstrålen til kondensatoren strålen nær rail montert speil. Bruk skinnen montert speil for å justere laserstrålen til kondensatoren strålen ved enden av skinnen (nærmest mikroskop). Nå monteres alle fire objektiver til rekkverket som vist i figuren. Lengden på jernbane, brennvidden til objektiver, og linsen ordninger vil variere avhengig av mikroskop og fysisk satt opp. Kritiske parametere er laserstrålen diameter og størrelsen på baksiden blenderåpning på det valgte målet. Infinity optiske systemer vil fokusere en helt parallell laserstråle (null konvergens). Avstand mellom L1 og L2 skal være summen av linsene brennvidder, f1 + f2, og avstanden mellom L3 og L4 bør tilsvarende være f1 '+ f2 ". Avstanden mellom the dual Galilean parene er ikke kritisk. Plassering av L3 kan finjustert for å styre strålen konvergens; <1mm justeringer vil være nødvendig å justere fokus for laser til bildet fokus. Pass på å fjerne alle objektiver, filtre, blenderåpning, osv. fra den mellomliggende modul som kan være i strålen sti (eller være klar over hva de gjør og justere systemet tilsvarende).
Figur 3 Justering av laserstrålen gjennom dual galileiske linser. Fjern mikroskop klemmer fra den ene siden av mikroskopet slik at mikroskopet kan flyttes ut av bjelke banen, men de resterende klemmene vil tillate mikroskop for å være nøyaktig flyttes. Tenk laser sikkerhet. Pass på at laser strømmen er justert til et minimum med Glan-Thompson polarisasjonsfilter. Slå på laser og se laserstrålen mønster på veggen. Du kan finne en papir tapet til veggen bidrar til å vise laserenspot. Systematisk justere plasseringen av linser for å få en følelse for hva de gjør for strålen størrelse og utseende. Du burde se noe som ser ut som panel A, der en intens spot er eksentrisk plassert i en dimmer profil. Bruk rail montert speil for å justere den intense flekken til senteret, som vist i panel B. Nå bruker toppen periskop montert speil for å gi en enhetlig perifere profil. Hvis alt er riktig justert, bør du nå finne at flytting av linsene fører til at strålen å utvide og kontrakt symmetrisk. Flytt linsene tilbake til startposisjonene som vist i figur 2. Nå avskjære strålen på avstanden til målet tilbake blenderåpning. Det bør være sirkulær, i hvert fall stor nok til å fylle ryggen blenderåpning, og av en uniform lysstyrke. Det er OK hvis det er større, så lenge du har tilstrekkelig laser makt for dine ablations. Evaluere konvergens ved å sammenligne strålen diameter på avstanden til målet tilbake blenderåpning og veggen. Beam diameter børvære identisk for en null konvergens bjelke. Scale bar er 10mm.
Figur 4 Justering av utvidet laserstrålen til kondensatoren strålen. Shutter laseren og flytte mikroskopet tilbake i banen for laserstrålen med klemmene som justering stopper. Slå på, justere og fokus kondensatoren bjelken ved hjelp av en objektiv. Tape papir over okulars å forhindre at noen ser på intense reflektert laserlys. Roter målet turret til en åpen posisjon. Sett et stykke papir på scenen for å occlude kondensatoren strålen. Slå laser på kontinuerlig mode og fjerne mekanisk sikkerhet utløseren. Du burde se noen laserlys som kommer om mikroskopet. Løsne mikroskopet klemmer og skubber mikroskop for å justere laserstrålen med kondensatoren strålen. Laserstrålen skal være sirkulære og uniform lysstyrke. Det er noen ganger nyttig å adjust skinnen montert linser. Du skal kunne utvide seg og trekke laserstrålen jevnt hvis justeringen er korrekt. Du kan midtstille den kontraktsfestede laserstrålen til minimum sentrert kondensator bjelke med rail montert speil og deretter utvide det til ønsket størrelse. Når du justere plasseringen av den kontraktsfestede strålen med rail speilet, må du justere toppen montert periskop speilet for å opprettholde en jevn lysstyrke av det utvidede strålen. Hvis du ikke kan få en sirkulær sentrert laserstråle da må du gå tilbake gjennom den tidligere justering trinn.
Figur 5 Sentrer ablasjon spot og justere laserstråle konvergens for optimal fokus. Slå av og skodde laseren. Fjern papiret og monter speilet target lysbilde (du kan også bruke permanent markør blekk på et dekkglass som mål 2). Bilde riper på speiloverflate med 60X 1.4na olje objektiv) nå bilde av overflaten med en confocal eller CCD. Ikke se gjennom okulars mens laser er på. Slå på og unshutter laseren. Sett laser for å utløse modus, lavest effekt, og 100 Hz. Trigger ca 10 pulser. Du burde se en ablasjon flekk 1-5 um i diameter innen 10 um i sentrum av visningen. Hvis du ikke ser en ablasjon sted du kan øke laser makten i 5-10% trinn. Når du identifiserer en ablasjon sted, senter den til synsfeltet. Plasser trådkorset på 256, 256 koordinater hvis visning 512X512 bilde. Hvis du justerer laser spot til sentrum da det ikke vil endre posisjon med zooming. Bruk skinnen montert speil for å flytte ablasjon flekken til senteret trådkorset. Revurdere ensartethet av laserstrålen ved å se på strålen med sikte fjernes som beskrevet ovenfor i figur 4. Juster bjelken ensartethet med den øverste periskop montert speil. Gjenta evalueringen av ablasjon spotposisjon. Dette er iterativ en process som bør gjentas til ablasjon spot er sentrert og utvidet strålen er uniform. Hvis gjort riktig ablasjon punktet vil være sirkulære sett i ablasjon flekk på Focus i figuren. Neste vurdere fokus laserstrålen i Z-aksen. Trigger laser til å produsere en ablasjon flekk av ca 1 um i sentrum. Nå flytter raset ca 5 um sidelengs og fokus 1 um under overflaten av målet lysbildet. Trigger laseren med samme laser innstillinger som du brukte for første ablasjon spot. Gjenta etter fokusering 1 um over overflaten av målet lysbildet. Hvis laserstrålen er fokusert i bildet fokusere så bør du se et mønster tilsvarende som vist i denne figuren. Den største ablasjon stedet bør tilsvare bildet fokus og ablasjon flekker over og under fokus bør få mindre symmetrisk. Juster objektivet L3 å justere fokal flyene. Flytting objektiv L3 unna mikroskop vil gjøre strålen mer konvergent og ablasjon stedet vil gå nærmeremålet. Små <1mm justeringer vil være nødvendig i nærheten fokus. Du er nå klar til å kutte axons. Scale bar er 1 UM.
Figur 6 Montering ormer for laser axotomy og time-lapse imaging. Agarose 10% i saltvann er oppvarmet til helt smeltet. En liten dråpe er plassert på et glass objektglass og deretter flatet med et annet lysbilde for å danne en flat pad. Tykkelsen på puten er satt av tape på to tilstøtende lysbilder. Puten er tillatt å sette i ca 1 minutt og deretter lysbildene blir separert. En "Sharpie" top brukes som en cookie cutter å danne en enhetlig størrelse pad på ca 13mm. En ul av 10mm Muscimol og en ul av mikrosfærer legges til midten av pad (Fang-Yen personlig kommunikasjon). Worms er lagt til to ul slipp og orientert før du setter på glasset dekkglass. Vaselin brukes deretter fra en sprøyte (20-25 ga. Nål) til kanten av dekkglass å forsegle den.
Figur 7. Typiske resultater av laser axotomy i C. elegans. I A kan du se intakt axon like før og etter laser axotomy. Gapet er normalt ca 0,5-1um. B viser laser axotomy av ett axon uten å skade en nærliggende axon ca 1 um unna. Laser ble satt til ca 10% effekt (0,3 mW gjennomsnitt på 2500 Hz), og 100 pulser. Scale bar er 5 um.
Figur 8. Typiske vill type L4 regenerering. Dette er en tidsserie som viser ablasjon og time-lapse opptak av axon regenerasjon. Kort tid etter laser axotomy ved 0 minutter kan du se retraction pære. Ved 138 minutter retraction pæren har trukket tilbake til sin ytterste grad, og nå begynt å remodel. Sporadisk membran fremspring (mircospikes eller filopodia) kan sees langs axon akselen (piler 138 og 324). Dethøyre stubbe strekker et velformet kompakt vekst kjegle på 360 minutter. På 414 minutter både stubber har forlenget vekst kjegler. Det opprinnelige embryonale-like growth kjegler blir dystrofe som de utvide mot dorsal nerve ledningen (414, 519 og 597 minutter). Den dystrofe Veksten kjegler stall kort av dorsal nerve ledningen (960 minutter). Pilspisser påpeke proksimal stubbe og vekst kjegler. Piler påpeke membran utstikkere langs proksimale axon akselen. Scale bar 20um.
Movie 1. Movie av vill typen axon gjenfødelse. Denne filmen går langs med den tiden punktene vist i Figur 8. Worms var montert som beskrevet i protokollen og axons var avbildes hvert tredje minutt i ca 10 timer. Z stabler (20 X 1um) ble tatt på hvert tidspunkt og fusjonert inn enkeltbilder av en maksimal projeksjon algoritme (NIS Elements). Klikk her for å se filmen.
Discussion
Det finnes flere gode diskusjoner av laser mikrokirurgi med forskjellige laser systemer 3,5-11. Femtosecond IR lasere er "gullstandarden" for subcellular laser ablasjon 12 og praktisk hvis forbundet med en avbildning anlegg, men de er ofte for kostbare for individuelle brukere. Hvis du trenger en femtosecond IR laser for imaging prøven på grunn av dybden av bildebehandling vil du sannsynligvis trenger en for laser axotomy. Transparent vev med target axons innen 30-50 um av overflaten er trolig gjennomførbart med blå og grønne puls lasere i de 20 UJ / puls utvalg målrettet gjennom en høy na nedsenking linse. Det vil være mer collateral damage med nano og pico andre lasere sammenlignet med femtosecond laser, særlig når dybden av målet aksonet øker. C. elegans er gjennomsiktig og alle axons er innenfor 20-30 um av overflaten. Vi rutinemessig kutte motor axoner som er innen 5 um av overflaten. Vi har også lett kutte øksons innenfor nerve ring som er rundt 20 um fra cuticle overflaten. Vi fant grensen for å kutte axons å være om lag 30-50 um gjennom diameter av en voksen orm. Det er sannsynlig at laser ablasjon systemet beskrevet her ville fungere bra med mange forskjellige preparater som passer kriteriene for åpenhet og dybde av målet axoner. Likevel er det litt overraskende, gitt den teoretiske fordelene av femtosecond IR lasere, som nano og picosecond 355 nm og 532 nm lasere gjøre så godt for laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser ingen forskjeller i axon regenerering svar på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm, og femtosecond IR lasere.
Solid state 355 nm UV lasere er omtrent samme pris som det 532 nm diode pumpet passivt Q-Switched solid state laser, men krever enten høyere makter eller optikk som effektivt passerer disse kortere bølgelengder. De fleste optikk er konstruert for å gjøre det bra med synlig 400 -700 nm lys. 355 nm lasere ville tilby noen fordeler 6 som redusert plasma terskel, mindre flekk størrelse, og en langpasning dichroic ville effektivt direkte 100% av ablasjon laser til målet og la samtidig avbildning av GFP uten tap av prøve signal. Blå 440 nm lasere ville beholde fordelene med å jobbe med en synlig lys laser (god ytelse med standard optikk og sikkerhet). Dessverre er prisen av en DPP Q-switched solid state 440 nm laser 3 ganger kostnaden for en 355nm eller 532 nm laser av lignende kraft på dette tidspunktet. Hvis vi skulle designe et nytt system for C. elegans, hvor target dybde er minimal, ville vi velge en UV gjennomsiktig linse (koster ca kr 3000 for en 40X 1.3na olje-objektiv med 50-70% transmisjon på 355nm) og en 355 nm laser produsere 50-10 UJ / puls ved 1 -20 kHz.
Axon ablasjon antas å skyldes plasma formasjon. Kortere pulser vil produsere plasma terskler ved lavere makt og plasma volum w syke bli mindre 6. Målet er å produsere den minste og korteste levetid plasma ved å justere puls energi til laveste styrkenivå. Større langlivede plasmaer vil generere kavitasjon bobler som skader omkringliggende celler. Vi har generelt funnet ut at ablasjon bruker ca 50-100 pulser på høyeste frekvens (dvs. 2.5kHz) gir de beste resultatene. Dette tyder på at skaden kan bli gradvis integrert over en rekke pulser til bedre kontroll omfanget av skaden. Den laser ablasjon system som beskrives her er veldig tilgivende hvis strålen er justert og utvidet nøyaktig. Vi starter å kutte axoner i voksen ormer ved 10% laser kraft (snitt på 0,3 mW målt ved 2500 Hz og anslagsvis 1 UJ / puls) og kan kutte med begrenset lokaliserte skader gjennom 14% strøm. Du kan observere større områder av skader 15-39% laser makt, men bare over 40% kraft (ca 1 mW gjennomsnittlig målt ved 2500 Hz) eksplodere ormer gjøre på grunn av store kavitasjon bobler og skader ormen i skjellaget.
e_content "> The Steinmeyer et al. 2010 2 papir er en utmerket ressurs for å konstruere en laser ablasjon system. Leon Avery har også en fin praktisk beskrivelse av en laser ablasjon system basert på en rimelig N2 gass 337 nm laser og han gir noen stor praktisk råd (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Når designe ditt eget system, bør du først snakke med dine mikroskop representant for å finne ut hvordan å målrette ablasjon laser til mikroskopet målet. Din mikroskop bør monteres på en vibrasjonsisolering bord (Newport, TMI, Thor). En breadboard toppen er optimal, men en solid stål toppen kan fortsatt brukes med magnetisk posisjoneringsenheter. En dedikert mellomliggende modul på en opprettstående omfang er fint fordi alle optiske elementer kan bli liggende på plass. Men det kan være billigere og mer praktisk å bruke et kamera port (invertert) eller en "combiner" festet til en epi-fluorescerende port. Du trenger å vite størrelsen på ryggen blenderåpning og transmittans (på en blation laser bølgelengde) av objektiv du har tenkt å bruke. Når du bestemmer deg på en laser (f.eks Crylas, vrimle, Crystal, eller CRC) bør du kontakte Thor eller Newport for hjelp med å velge riktig optiske elementer, maskinvare og sikkerhetsutstyr. Vi bestemte oss på en dual galileer stråle ekspander for å spare plass, men en enklere Keplerian Expander er et alternativ (f2/f1 = utvidelse faktor). En tilpasset bjelke ekspander vil være den minst kostbare, men Newport, Thor, og flere av laser produsenter tilbyr utmerket kvalitet kommersielle bjelke expanders. Noen laser produsenter tilbyr også manuell og elektronisk styrte lyddempere som kan være kostnadseffektive og plassbesparende, men ikke like allsidig som Glan-Thompson polarisator og halv bølge plate. Du må også bestemme hvordan å kontrollere laser. Du kan utforme en LabView basert controller, bruke en kommersiell TTL generator, eller programvare som leveres av laser selskapet. Diskuter alternativer med de spesifikke laser produsenten. telt "> Vi har laget en liste over maskinvaren vi har bare brukes som en generell veiledning. Systemet er beskrevet her koster ca $ 15 000 da lagt til vår eksisterende imaging system. Din lokale Physics avdeling vil ofte ha noen villige til å gi en praktisk innføring i trygt å jobbe med gratis bjelke lasere.Alternative metoder for immobilisering og tidsinnstilte avbildning av C. elegans har nylig blitt beskrevet. 14
Feilsøking
De vanskeligste og mest kritiske trinnet er justeringen av sentrert utvidet strålen til den optiske aksen av mikroskopet. Når du har strålen sentrert og utvidet gjennom galileiske linser bør du jobbe hardt for å få det justert til innen 5 um av mikroskopet optiske aksen FØR du bruker styringen speil for den endelige justering til sentrum. Overdreven bruk av styringsgruppen speil for å justere strålen til mikroskopet vil flytte den av aksen gjennom strålenekspander. BRUK EXTREME FORSIKTIG du kan dempe laserstrålen med passende ND filter og direkte se laserstrålen profil på en reflekterende mål (foran overflate mirror). Du kan skubber mikroskopet til nettopp sentrum strålen i 60X objektiv synsfelt (hvis det ikke kan være sentrert i opp / ned området du trenger å justere rail høyde). Strålen profilen kan brukes til nøyaktig justere mikroskop optiske aksen for å gi en sentrert stråle som er sirkulær og "flares" symmetrisk. En asymmetrisk bluss er en indikasjon på at mikroskop aksen ikke er perfekt justert (eller jernbane er ikke nivået). Til slutt bør du justere L3 og se en jevn og symmetrisk ekspansjon og sammentrekning av strålen. Fokus mikroskopet nøyaktig på målet overflaten og deretter justere L3 å fokusere laserstrålen til den minste flekk. Du skal nå finne at laserstrålen er innen 5 um av senteret når avbildes via LSCM eller CCD-systemet og ablasjon stedet er innenfor1um av Z fokus.
Hvis du synes du er "blåse opp" ormer eller konsekvent generere store kavitasjon bobler å kutte axons problemet ditt er mest sannsynlig den fine justering av ablasjon laser. Pass på minimum (<500nm) ablasjon spot er lokalisert til Z fokus (justere konvergens med L3 objektiv) og til XY tillitspersonen flekken (juster med siste kinematically montert speil).
Targeting axons nærmere overflaten vil kreve mindre laser makt. Tilsvarende vil mindre dyr (L1 og L2) krever mindre laser strøm for axotomy forhold til målgruppe samme axons hos voksne.
Hvis villtype axons ikke regenerere eller axons blekemiddel du bør prøve å redusere avbildning laser makt eller redusere sampling rate. Hvis ormer dø eller bli sykelig prøve å redusere prosent agarose i trinn på 1%. Pass på at du ikke flytter dekkglass etter montering ormer som dette vil ofte føre dem til å dø når du bruker høy perandelen agarose og mikrosfærer.
Hvis ormer briste eller dø i løpet av en time-lapse session det skyldes: 1. Prosentandel agarose er for høy. 2. Skade på cuticle ved ablasjon laser. 3. Bevegelse av dekkglass etter montering. Dersom skader på skjellaget er feil det vil bare påvirke montert ormer som har vært målrettet med ablasjon laser.
Hvis orm beveger seg for mye under en time-lapse session prøve å øke andelen agarose i 0,5% trinn. Sunn axoner i sunne ormer er alltid "aktiv" og viser en konsistent nivå av fluorescens. Hvis du ser en plutselig reduksjon i fluorescens eller aktivitet ormen er døende eller døde. Flere beaded eller fragmentert axons er et sikkert tegn på en døende eller døde ormen.
Hvis du har problemer med å holde dine axoner i fokus under hele tiden lapse session det kan være flere ulike problemer. Først sjekke din scenen drift av tenkelig en inert prøven på en glass-slide over 10 hrs. Et par mikrometer drift kan skyldes termisk ustabilitet, men større enn 5 um skyldes sannsynligvis til mekaniske problemer med mikroskop din. Problemer med montering er mer vanlig. La montert ormer likevekt med mikroskop scenen i 30 minutter før du starter din tid forfalle. Kontroller at vaselin forseglingen ikke utviklet lekkasjer i løpet av din tid forfalle økten.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation, McKnight Endowment Fund for Neuroscience, er Christopher og Dana Reeve Foundation og Amerisure Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 535 nm Laser | Crylas | FDSS532Q3 | (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers) |
| All optics and hardware | (Thor offers comparable optics and hardware) | ||
| SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter | Newport Corp. | SS100-F2KN | 2 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm | Newport Corp. | 10RP52-1 | 1 |
| Rotation Stage, 1" Aperature | Newport Corp. | RSP-1T | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm | Newport Corp. | 10GL08AR.14 | 1 |
| Polarizer Rotation Mount | Newport Corp. | RM25A | 1 |
| ¼" spacer for 1" diameter post | Newport Corp. | PS-0.25 | 1 |
| ½" height, 1"diameter post | Newport Corp. | PS-0.5 | 1 |
| Fork, 1" diameter post | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Beam Dump | Newport Corp. | PL15 | 1 |
| Microscope Objective Lens Mount | Newport Corp. | LH-OBJ1 | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm | Newport Corp. | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole | Newport Corp. | SN100C-F | 2 |
| High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI | Newport Corp. | AJS100-0.5K | 4 |
| Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female | Newport Corp. | SS-1-B | 2 |
| Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 340-RC | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 1 |
| Rail carrier for X26, square 40mm length | Newport Corp. | CN26-40 | 4 |
| Steel Rail, 384mm (15") length | Newport Corp. | X26-384 | 1 |
| Rod Platform for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 300-P | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 2 |
| Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPC025AR.14 | 2 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX082AR.14 | 1 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX085AR.14 | 1 |
| Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-0.5 | 2 |
| Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-1 | 2 |
| Microspheres 0.1um | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | A20090 | EEO matters |
| Muscimol | Sigma-Aldrich | M1523 |
References
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
- Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
- Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
