Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans doi: 10.3791/3331 Published: November 15, 2011

Summary

Lazer axotomy time-lapse görüntüleme mutasyonların etkileri de tahlil için hassas bir şekilde

Abstract

Time-lapse mikroskobu ile takip Lazer axotomy C ile akson rejenerasyonu fenotipleri için hassas bir testtir elegans 1. Bu testte temel zorluk, bir lazer ablasyon sistemi 2,3 uygulanması için gerekli olan algılanan maliyet ($ 25-100K) ve teknik uzmanlık. Ancak, mütevazı maliyetleri (<$ 10K) solid-state darbe lazerler lazer ablasyon hedef aksonlar doku yüzeyine "yakın" şeffaf hazırlıkları için sağlam bir performans sağlayabilir. İnşaat ve hizalama bir sistem, bir gün içinde yapılabilir. Odaklanmış kondenser ablasyon lazer ışığı tarafından sağlanan optik yol, uygun bir uyum kılavuzu sağlar. Kaldırılır tüm optik ile bir ara modül ablasyon lazer adanmış ve lazer ablasyon oturumu sırasında herhangi bir optik elemanlar hareket gerekirse sağlar. Ara modül dikroik, eş zamanlı görüntüleme ve lazer ablasyon sağlar. Lazer ışını t Merkezlemeo odaklı mikroskop yoğunlaştırıcı lens ışın sistemi ilk uyum yönlendirir. Lensler çeşitli durum ve seçilen objektif lens arka diyafram doldurmak için kullanılan lazer ışını genişletmek. Final ön yüzeyi aynalı cam slayt hedefi ile uyum ve test yapılır. Lazer gücü minimum boyut ablasyon spot (<1um) vermek için ayarlanır. Ablasyon nokta son kinematik monte ayna görüntüleme penceresinde sabit çapraz kıllar ince ayar ile ortalanır. Lazer güç axotomy için minimum hedef slayt (Bu kullandığınız hedef değişebilir) ablasyon nokta için gerekli olandan daha yüksek yaklaşık 10X olacaktır. Worms agaroz pedleri (veya mikroakışkan odaları 4) montaj, lazer axotomy ve time-lapse görüntüleme için immobilize olabilir . Agaroz pedleri mikrodalga erimiş dengeli tuz çözeltisi içinde% 10 agaroz ile kolayca yapılır. Bir damla erimiş agaroz cam bir slayt üzerine yerleştirilen ve başka bir ile düzleştirilmişbir yastık içine cam slayt kalınlığında yaklaşık 200 um (komşu slaytlar zaman bant, tek katmanlı bir boşluk bırakan olarak kullanılır). "Sharpie" kap, 13mm üniformalı bir çaplı dairesel bir ped kesmek için kullanılır. Anestezik (1ul Muscimol 20mm) ve Mikroküreler (Chris Fang-Yen kişisel iletişim) (1ul 2.65% Polistiren 0,1 um su), sol tarafta yatan böylece odaklı 3-5 solucanlar tarafından takip pad merkezine eklenir. Bir cam lamel uygulanır ve daha sonra vazelin lamel mühür ve örnek buharlaşmasını önlemek için kullanılır.

Protocol

1. Bir lazer ablasyon sistemi inşaatı

Lazer güvenlik gözlükleri takın ve ilk hizalama sırasında lazer güvenlik uygulamaları kullanabilirsiniz. Lazer Okülerin yoluyla bakmayın.

  1. Şekil breadboard bileşenleri düzenleyin. 1 (ayrıca bkz: örnek 2) . Lazer (gerekirse yükseltici plaka ile), periskop yazılan ve yükseltilmiş demiryolu destekler vidalanması.
  2. Demiryolu ekseni ile hizalamak için mikroskop yerleştirin. Mikroskop yoğunlaştırıcı lens iletilen ışık demeti ile aynı hizaya getirin. Ray yüksekliği (bir seviyeye kullanmak) ve ayarlanabilir bir diyafram ya da demiryolu ile yapıştırılmış bir lens pozisyonu hizalayın. Diyafram veya lens kondenser ışınına ray her iki ucunda aynı hizada olmalıdır . Lab jakları demiryolu yükseklik ayarı ile yardımcı olabilir.
  3. Glan-Thompson polarize ve lazer ışını yarım dalga plakası aynı hizaya getirin. Bu hizalama yapmak lazer gerekmez. BEAM sadece kenarları vurmadan iki geçmek gerekiyor. (Şekil 1) kiriş dökümü için uygun bir yönelim ve konum sağlamak için polarize döndürün. Lazer gücü ayarlamak için yarım dalga plakası dönecektir. Breadboard bileşenleri sabitleyin.
  4. Lazer açın 100, sürekli modda darbe frekansını ayarlamak ve en az yarım dalga plakası kullanarak gücü azaltabilir. Lazer ışını görselleştirmek için bir Post-it notu veya lens kağıdı kullanın.
  5. Ayarlayın ve yükseltilmiş ray üzerine monte edilmiş ayna ışın getirmek için lazer sırayla kinematik monte aynalar düzeltmek. Lazer ışını aynalar merkezi kabaca aynı hizada olmalıdır. Ayna lazer ışını ekseni (Şekil 1) kabaca 45 derece odaklı olmalıdır.
  6. Kaba, üstüne periskop ve mikroskop iletilen ışık demeti merkezinde lazer ışını hizalamak için demiryolu sonuna kinematik monte edilen ayna ayarlayın. Lazer ışını ve to mikroskop ışık iletilen ışın yolu kağıt takarak aynı anda görüntülenmiştir olabilir. Ara modül herhangi bir ND filtre ve diyafram çıkışı ya da tamamen açık olduğundan emin olun.
  7. İnce ince ayarlamalar ile üst periskop ve demiryolu aynalar merkezine iletilen ışık demeti lazer ışını aynı hizaya getirin. Kağıt demiryolu aynası yakın tutun ve üst periskop ayna ile iletilen ışık demeti merkezinde lazer ışını hizalamak. Mikroskop limanı yakınlarında kağıt tutun ve demiryolu ayna ayarlamaları (Şekil 2) ile merkeze iletilen ışık demeti lazer ışını hizalamak.
  8. Post-it yerleştirin hizalı yoğunlaştırıcı lens ve açık amacı, taret arasında ışın yolu not. Merkeze yakın küçük bir lazer ışını ile iletilen ışık demeti göreceksiniz. Demiryolu merkezi lazer ışın ayna üzerinde ince ayar kullanın. Kelepçeler ile mikroskop sabitleyin.

Adım 10,9-1,12 isteğe bağlıdır, ama ışın genişleyen lensler eklemeden önce uyum ve lazer ablasyon değerlendirmek için kolay ve kullanışlı.

  1. Lazer kapatın ve mekanik emniyet deklanşör meşgul. Işın yolu% 50 dikroik dışarı döndürün. Doğrudan bir lazer ışığı Okülerin geçecek olsa da, yansıyan ışık oldukça yoğun. 60X petrol amacı ile güzel bir uyum ve görüntü için hedef slayt monte edin. Slayt üzerinde çizikler odaklanın. Ara modül ND4 ve ND8 filtre koyun.
  2. Görüntü hedef CLSM ile slayt, İplik diske ya da CCD kamera sistemi. % 50 dikroik lazer yoluna çevirin. Bu noktadan itibaren, ablasyon lazer açıkken Okülerin üzerinden bakmak asla. Ablasyon lazer açın ve 100 tetiklenen, frekans modunu ayarlamak ve nabız sayısı 10. Güç hala yarım dalga plaka ile minimum ve sonra mekanik emniyet obtüratör açık olduğundan emin olun. Simultaneou.sinsi görüntü ve ablasyon lazer kullanın.
  3. Hedef slayt görüntüleme iken, ablasyon lazer tetikler. Ablasyon spot 1-10 um çapında bir hedef slayt kontrol edin. Ablasyon yerinde görüldüğü kadar sırayla ND filtreleri kaldırabilirsiniz. Demiryolu ayna ile ablasyon nokta görüntünün merkezi ayarlayın. ND filtresi, ince bir <1 um ablasyon spot vermek için yarım dalga plakası lazer güç artırmak için oda var eklemek istediğiniz. Resim 0.2 um / piksel ya da daha az ve ince görüntünün merkezinde (512x512 görüntü ile pozisyonu 256.256) ablasyon nokta ayarlamak.
  4. Lazer ışınının odak ve eksen derinliğini kontrol edin. Focus ve 1-2 um ve ablasyon konumu ve ablasyon spot büyüklüğü kontrol edin. Lazer ışını eksenel hizada ise ablasyon nokta hareket etmez. Koşulsuz bir lazer ışını (yaklaşık 3-5 um odak alt üst) birkaç um üzerinde güç dağıtacak.

2. Amacı, geri doldurmak için lazer ışını genişletmek için lensler ekleodaklanma kontrolü için diyafram ve ayarlamak yakınsama

  1. Bu sistem arka diyafram objektif (10 mm) doldurmak için lazer ışını genişletmek için çift Galile ışın genişleticiler kullanır. Mount taşıyıcıları 4 lens ve demiryolu (L1f1 + L2f2 ve L3f1 '+ L4f2') ekleyebilirsiniz. Tüm objektifler aynı optik eksen lazer ışını (Şekil 2) tam olarak dik ve böylece pozisyonları ayarlayın.
  2. Lazer açın ve minimum güç ve sürekli modu ayarlamak. Kabaca lazer ışını görmek için kağıt kullanarak her bir lens aracılığıyla ışını hizalamayı ve ışık mikroskobu kondenser iletilir. Kapatın ve deklanşör lazer.
  3. Mikroskop bir taraftan kelepçeleri çıkarın ve lazer ışını yolu mikroskop dışarı kaydırın. Lazer açın ve güvenlik deklanşör kaldırmak.
  4. Yakın bir yerde duvara genişletilmiş lazer ışını görüntüleyerek, lensler ve lazer ışını ince ayara yapılabilir. Le ışın simetrik genişletmek ve sözleşmenses taşındı. Işın (Fig. 3) hizalamak için kinematik monte son iki aynalar ayarlayın.
  5. Hizalanmış ve genişletilmiş ışın profili, dairesel ve tekdüze parlaklık (Fig. 3) olmalıdır. Post-ışın boyutu ve bütünlüğü ile izlenebilir amacı arka diyafram tahmini konumu not.
  6. Işın sonsuz optik sistemler için sıfır yakınsama ayarlanabilir olmalıdır. Bir Post-It hareket lenslerden uzak not Yakınsama, kiriş boyutunu değiştirir belirterek tahmin edilebilir. Lazer kapatın ve mekanik obtüratör meşgul.
  7. Mikroskop doğru hizalama tanımlamak için sabit kelepçeler kullanarak lazer ışını yoluna geri kaydırın. Mikroskop serbest tarafında kelepçeler değiştirin, ama aşağı doğru sıkmayın.
  8. Lazer açın ve güvenlik deklanşör kaldırmak. Objektif taret açık bir pozisyona döndürün. Post-it yerleştirin sahne ile ilgili not. Iletilen ışık b merkezli genişletilmiş ve düzgün bir lazer ışını görmek gerekirkondenser EAM (Şekil 4). Mikroskop kelepçeleri gevşemesine ve mikroskop dikkatlice dürtmek merkezinin de gerekebilir.
  9. Güvenlik deklanşör Engage ve tetiklemek için lazer modu ayarlayabilirsiniz. 60X amacı, yeri ve görüntü hedef slayt yüzeyi çizilmelere döndürün.
  10. Çıkarın, güvenlik deklanşör, ablasyon lazer tetikleyebilir ve minimum ablasyon nokta için lazer gücünü ayarlamak. Ablasyon yerinde görüntü merkezinin 5-10 um içinde dairesel olmalı ve.
  11. Merkezi kinematik monte raylı ayna ince ayarlamalar ile ablasyon nokta. Iteratif merkezi ablasyon nokta, demiryolu monte ve üst periskop ayna ayarlamak ve düzgün bir ışın profili korumak için ihtiyacınız olacaktır.
  12. 1 um adımları odağı sistematik bir şekilde yukarı ve aşağı hareket eden ve ablasyon lazer tetikleme lazer Z odak değerlendirin. , Genişletilmiş, hizalı ve yakınsama ayarlı ışın hepsi 1 um ab zayıf ya da görüntü odak noktasında maksimum kesebilme.Ove veya aşağıda odak (Resim 5).
  13. Galile teleskopla (Şekil 2) L3 objektif hareket ettirerek genişletilmiş ışının Z odağı ayarlayın.

3. Lazer axotomy ve akson rejenerasyonu time-lapse mikroskopi

  1. Dengeli tuz çözeltisi içinde Mikrodalga% 10 Agaroz (RPI Moleküler Biyoloji EEO 0.1 A20090) tamamen erimiş kadar. Sıcak bir plaka üzerine montaj için kullanım sırasında erimiş tutmak için ayarlayın.
  2. Erimiş agaroz Bir damla bir cam slayt üzerine yerleştirilir ve kalın yaklaşık 200 um (komşu slaytlar zaman bant, tek katmanlı bir boşluk bırakan olarak kullanılır) bir yastık içine bir bardak slayt ile düzleştirilir.
  3. "Sharpie" işareti kap, 13mm üniformalı bir çaplı dairesel bir ped kesmek için kullanılır.
  4. Sol tarafta yatan böylece Anestezik (1ul Muscimol 20mm) ve Mikroküreler (Chris Fang-Yen, kişisel iletişim) (1ul% 2,65 Polistiren suda 0,1 um) odaklı 3-5 solucanlar tarafından takip pad merkezine eklenir . Bir bardak lamel uygulanan ve daha sonra Vaseline lamel mühür ve örnek buharlaşma (şek.6) engellemek için kullanılır.
  5. Ablasyon lazer her oturumun başında, yukarıda açıklandığı gibi, crosshair hizalanmış. Lazer güvenlik deklanşör meşgul.
  6. Hedef nöronların uygun bir floresan işaretleyici ile lazer hizalama hedef ve görüntü monte yetişkin solucan çıkarın. Benzer bir büyütme (0.2 um / piksel veya daha yüksek büyütme) ve crosshair'i (Şekil 7) altında konumunu Resim aksonlar.
  7. Lazer güvenlik deklanşör açın ve ablasyon lazer görüntüleme ise tetikleyebilir. Değerlendirin lazer tetikleme sonra akson ve akson kesilir kadar yavaş lazer gücünü artırmak. 10X daha fazla lazer gücü hakkında hizalama hedef slayt (darbe 1uJ / ns hakkında) bir ablasyon nokta oluşturmak için daha aksonlar kesmek gerekir. Biz genellikle 0.27mW hakkında (2500 Hz'de sürekli Tutarlı FieldMaxII güç metre ve lazer ile örnek ölçülen ortalama güç) 2.5 kHz ve güç 100 darbeleri ile kesti. Ablasyonlazer güç ayarı, gelecek deneylerde (Şekil 7) aksonlar kesme için tutarlı olacaktır.
  8. Akson başarıyla kesilmiş iki uçları (Şekil 7), parlaklık kaybı olmadan 0.5-1 hakkında um bir mola gösterecektir. Parlaklık ya da büyük bir boşluk (2-10 um) büyük bir kayıp çoğu kez bir kavitasyon baloncuğu akson ötesinde büyük hasar anlamına gelir. Proksimal ve distal aksonlar sonraki 30 dakika içinde (Şekil 8 ve Movie) retraksiyon ampuller ayrı ve oluşturacaktır.
  9. 30 dakika boyunca zaman atlamalı kayıt başlamadan önce mikroskop sahne ile monte solucanlar dengelenmesi. Bu sıcaklık farklılıkları ve agaroz daralma nedeniyle kayma en aza indirecektir.
  10. Sistemi ile ilişkili görüntüleme yazılımı) Time-lapse görüntüleme parametreleri kullanarak ayarlanır. İstenen uzaysal çözünürlüğü verirken genellikle 0.1-0.2 um / piksel görüntü 10-20 Z adımları (1um/step) kazanç, iğne deliği, tarama hızı ve görüntüleme lazer güç ayarlarını maruziyeti en aza indirmek. Örnekleme aralıklarla tipikistenen temporal çözünürlük (Şekil 8 ve Movie) bağlı olarak 15 saat içinde 1-5 dakika ly.
  11. Time-lapse görüntü verilerini NIS Elements veya ImageJ kullanarak filmleri çevrilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Lazer axotomy bu sistemi kullanarak, güvenilir ve rutin. Şekil 7'de gösterilen sonuçları tipik örnekleridir. Time-lapse görüntüleme akson rejenerasyonu bu protokolü kullanarak, çok sağlamdır. Biz rutin olarak 5 farklı solucan, motorlu sahne kullanarak tek bir slaytta 5 aksonlar kadar kesim ve görüntü. Tek sınırlama, her 180 saniyede bir örnekleme en fazla 9 aksonlar (9 yığınları) tadabilirsiniz sonra bir akson için bir yığın toplamak için 20 saniye sürerse, her bir akson, örneğin görüntüleri toplamak için gereken zaman. Şekil 8 ve 9 olarak gösterilen örnek, iyi bir temsilcisi sonucudur. Deney yaklaşık% 10'u bu kaliteli sonuçlar verir. Kalan deneyler rejenerasyon fenotip iyi veri sağlar, ancak estetik unappealÇünkü solucan, genellikle 5-8 saat immobilizasyon sonra başlar, küçük Değişimin hareketleri ing.

Şekil 1
Şekil 1 Lazer Ablasyon Sistemi. 532 nm Nd: YAG lazer diğer bileşenlerin yüksekliğe getirmek için yükseltici bir plaka üzerine monte edilir ve breadboard sabitlenmiş. (Optik izolatör isteğe bağlı ve muhtemelen gerekli değildir). Glan-Thompson polarize ve yarım dalga plakası ince lazer gücü kontrol etmek için kullanılır. Bunlar ince kalibre rotasyon bağlar. Kiriş dökümü dikkat edin. Köşe ayna alt periskop ayna lazer ışını yönlendirir. Üst periskop ayna demiryolu ayna ışın yönlendirir. Demiryolu, iki çubuk desteklenen platformlar üzerine monte edilmiştir. Çift raylı sürme bağlar Galile lensler bağlıdırlar. Ablasyon lazer adanmış katma bir ara modül dikkat edin. Sistemi optik isola kaldırarak daha kompakt yapılabilirtor ve köşesinde ayna, lazer, Glan-Tekin polarize ve yarım dalga plakası breadboard arka kenarı yeniden konumlandırmak.

Şekil 2
Şekil 2 Çift Galile İklimlendirme lensler sıfır yakınsama üniforma 10 mm boyutlarında, 300 um TEMoo lazer ışını genişletmek için kullanılır. Bir laboratuar jakı, demiryolu tutan platformlarından biri altında konumlandırılmış. Bu hizalama adımları sırasında demiryolu yükseklik ayarlama yardımcı olur. Kabaca demiryolu ray L1 lens montaj ve bir hizalama kılavuz olarak kondenser ışını ile yükseklik ayarı. Kondenser ışını ray her iki ucunda objektif merkezine hizalar, böylece raylı ayarlayın. Bu ray optik mikroskop eksenine paralel hizalanmış sağlayacaktır. Ray optik eksen maç için ilk mikroskop ayarlamanız gerekebilir. (Bkz. Şekil 1) mikroskop konumunu düzeltmek için mengeneler kullanın. Inci çıkarıne objektif ray monte. Şimdi raylı her iki ucunda kondenser ışını merkezinde lazer ışını aynı hizaya getirin. Işın yolunda bir kağıt, aynı anda iki ışınlarını görmek için uygun bir yoldur. Ray monte edilen ayna yakın kondenser ışın lazer ışını hizalamak için üst periskop ayna kullanın. Ray ray ucunda (mikroskop için yakın) kondansatör ışın lazer ışını hizalamak için monte edilen ayna kullanın. Şimdi Şekilde gösterildiği gibi demiryolu dört lensleri. Demiryolu uzunluğu, lenslerin odak uzaklığı ve objektif düzenlemeleri mikroskop ve fiziksel kurmak bağlı olarak değişecektir. Kritik parametreleri lazer ışınının çapı ve seçilen hedefi arka diyafram boyutunu. Infinity optik sistemleri mükemmel bir paralel lazer ışını (sıfır yakınsama) durulacak. L1 ve L2 arasındaki mesafe, odak uzunlukları, f1 + f2, L3 ve L4 arasındaki mesafe ve buna uygun f1 + f2 'olmalıdır lensler toplamı olmalıdır. Tarihleri ​​arasında mesafee çift Galile çiftleri önemli değildir. L3 pozisyonu ışın yakınsama kontrol etmek için ince ayarlanmış olabilir; <1mm ayarları Görüntüyü odaklamak için lazer odak ayarlamak için gerekli olacaktır. Işın yolu (ya da ne yaptıklarını farkında olmalı ve buna göre ayarlayın) olabilir ara modül tüm objektifler, filtreler, diyafram, vb kaldırmak için emin olun.

Şekil 3
Çift Galile lensler sayesinde lazer ışını Şekil 3 Hizalama. Mikroskop ışın yolu dışına taşınacağı, böylece bir taraftan mikroskop mikroskop kelepçelerini çıkarın, ancak kalan kelepçeler mikroskop tam olarak yerleştirilmesine izin verecek. Lazer güvenlik düşünün . Lazer güç Glan Tekin polarize ile minimum ayarlanabilir olduğundan emin olun. Lazer açın ve duvara lazer ışını desenini görüntülemek. Duvara bantlanmış bir kağıt lazer görmek için yardımcı olurspot. Sistematik ışın boyutu ve görünüşü ne bir fikir almak için merceklerin pozisyonlarını ayarlayın. Yoğun bir noktaya eksantrik kısan bir profili bulunan bir paneli gibi görünen bir şey göreceksiniz. Paneli B. Şimdi üst periskop gösterildiği gibi merkeze yoğun nokta ayarlamak için ray monte edilen ayna kullanın, düzgün bir periferal profil vermek için ayna monte edilmiş. Eğer her şey düzgün hizalanmış artık hareketli merceklerin ışın simetrik genişletmek ve sözleşme neden olduğunu bulmalısınız. Şekil 2'de görüldüğü gibi başlangıç ​​pozisyonlarına geri lensler hareket ettirin. Şimdi geri objektif diyafram mesafeden ışınlarını durdurmak. En azından arka diyafram doldurmak için yeterince büyük ve tek bir parlaklık, dairesel olmalıdır. Sürece ablasyonların için yeterli lazer gücüne sahip olarak, büyükse Tamam. Yakınsama amacı arka diyafram ve duvar arasındaki mesafe ışın çapı karşılaştırarak değerlendirin. Işın çapı olmalıdırsıfır yakınsama ışın için aynı olması. Ölçeği bar 10mm.

Şekil 4
Kondenser ışınına genişletilmiş lazer ışını Şekil 4 Hizalama. Shutter, lazer ve mikroskop hizalama durur kelepçeler kullanarak lazer ışını yoluna geri hareket ettirin. Açın, hizalayın ve Okülerin üzerinde yoğun yansıyan lazer ışığı ile ilgilenen herkes önlemek için objektif bir lens. Teyp kağıt kullanarak kondenser demeti . Objektif taret açık bir pozisyona döndürün. Kondenser ışın kapamak için sahnede bir parça kağıt koyun. Lazer sürekli modda açın ve mekanik emniyet deklanşör kaldırmak. Mikroskop rağmen gelen bazı lazer ışığı görmek gerekir. Mikroskop kelepçelerini gevşetin ve kondenser ışını lazer ışını hizalamak için mikroskop hafifçe dürtmek. Lazer ışını, yuvarlak ve düzgün parlaklık olmalıdır. Bazen adju yararlıst lensler raya monte edilmiş. Hizalama doğru olup olmadığını düzgün lazer ışını genişletmek ve sözleşme gerekir. Ray monte edilen ayna ile minimum merkezli kondenser ışın merkezi sözleşmeli lazer ışını ve ardından istediğiniz boyuta genişletin. Demiryolu ayna ile sözleşmeli ışın konumunu ayarlamak, genişletilmiş ışın düzgün bir parlaklık sağlamak için en üst monte periskop ayna yeniden ayarlamak gerekir. Merkezli dairesel bir lazer ışını alamıyorsanız, o zaman önceki hizalama adımlarında geri gitmek gerekir.

Şekil 5
Şekil 5 Merkezi ablasyon spot ve optimum odak için lazer ışını yakınsama ayarlamak. Kapatın ve deklanşör lazer. Kağıdı çıkarın ve yansıtılmış hedef slayt monte (ayrıca 2 bir hedef olarak lamel üzerine kalıcı bir kalem mürekkep kullanabilirsiniz). 60 ile aynalı yüzeyi Görüntü çiziklerLazer Şimdi X 1.4na yağ objektif) bir konfokal veya CCD ile yüzey görüntü. Okülerin bakmayın. Açın ve lazer kepenklerini açmak. Modu, düşük güç ve 100 Hz tetiklemek için lazer ayarlayın. 10 darbeleri ile ilgili tetikler. Görünümün merkezinde 10 um içinde çapı 1-5 um ablasyon nokta göreceksiniz. Ablasyon nokta göremiyorsanız% 5-10 adımda lazer gücünü artırabilir. Bir kez bir ablasyon nokta, görüş alanının merkezinde tanımlar. 512x512 resim görüntüleme, 256, 256 koordinatları çapraz kıllar koyun. Merkezine lazer nokta ayarlarsanız daha sonra yakınlaştırma ile konumunu değiştirmek olmaz. Demiryolu merkezi crosshair'i ablasyon noktaya taşımak için ayna monte kullanın. Şekil 4 de yukarıda açıklandığı gibi kaldırılır amacı ile kiriş bakarak lazer ışınının tekdüzelik reevaluate. Üst periskop monte edilen ayna ile ışın tekdüzelik ayarlayın. Ablasyon spot konumunun değerlendirilmesi tekrarlayın. Bu p iteratifrocess ablasyon nokta merkezli ve genişletilmiş kiriş üniform kadar tekrar edilmelidir. Eğer yapılırsa doğru ablasyon nokta, resimde Odak ablasyon spot görüldüğü gibi dairesel olacaktır. Bundan Z ekseninde lazer ışınının odak değerlendirir. Lazer ablasyon spot merkezinde yaklaşık 1 um üretmek için tetikler. Şimdi 5 um ile ilgili slayt yanal hareket ve odak hedef slayt yüzeyinin altında 1 um. Ilk ablasyon nokta için kullanılan aynı lazer ayarları kullanarak lazer tetikler. Hedef slayt yüzey üzerinde odaklanan 1 um sonra tekrarlayın. Lazer ışını görüntü odakta odaklı ise o zaman bu rakam gösterilen benzer bir model göreceksiniz. Büyük ablasyon yerinde görüntü odak ve yukarıda ve aşağıda ablasyon noktalar odak simetrik küçük almalısınız karşılık gelmelidir. Objektif odak uçak hizalamak için L3 ayarlayın. Mikroskop uzak objektif L3 Moving ışın daha yakınsak yapacak ve ablasyon nokta daha yakın hareket edecekhedefidir. Küçük <1mm ayarlamalar odak yakın ihtiyaç duyulacaktır. Artık aksonlar kesmek için hazır. Ölçek çubuğu 1 um.

Şekil 6
Şekil 6 Montaj solucanlar, lazer axotomy ve time-lapse görüntüleme . Agaroz salin içinde% 10 tamamen erimiş kadar ısıtılır. Küçük bir damla, bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve daha sonra düz bir yastık oluşturmak için başka bir slayt ile düzleştirilir. Iki komşu slaytlar bant ped kalınlığı ayarlanır. Ped yaklaşık 1 dakika ayarlamak için izin verilir ve daha sonra slayt ayrılır. "Sharpie" top 13mm hakkında bir üniforma ölçekli ped oluşturmak için bir çerez kesici olarak kullanılır. 10mM Muscimol 1 ul ve mikroküreler, 1 ul ped merkezi (Fang-Yen kişisel iletişim) eklenir. Worms cam lamel üzerine koymadan önce 2 ul damla ve odaklı eklenir. Vazelin sonra mühür lamel kenarında bir şırınga (20-25 ga iğne) uygulanır.


C. elegans lazer axotomy 7 Tipik sonuçları Şekil. A lazer axotomy öncesi ve sonrasında kısa bir süre bozulmadan akson görebilirsiniz. Boşluk, normalde yaklaşık 0.5-1um. B yaklaşık 1 um uzaklıktadır yakındaki bir akson zarar vermeden bir akson lazer axotomy gösterir. Lazer, yaklaşık% 10 güç (2500 Hz'de 0,3 mW ortalama) ve 100 bakliyat kuruldu. Ölçek çubuğu 5 um.

Şekil 8
Şekil 8. Tipik L4 rejenerasyon vahşi tip. Bu ablasyon ve akson rejenerasyonu time-lapse kayıt gösteren bir zaman serisi. 0 dakika retraksiyon ampul lazer axotomy kısa bir süre sonra görebilirsiniz. 138 dakika retraksiyon ampul uzak ölçüde geri çekti ve şimdi yeni model başladı. Sporadik membran çıkıntılar (mircospikes veya filopodia) akson mil (138 ve 324 oklar) birlikte görülebilir.360 dakikada sağ güdük bir iyi biçimli kompakt büyüme konisinin uzanır. 414 dakika her iki kütükleri büyüme konileri genişletmiştir. Dorsal sinir kablosu (414, 519 ve 597 dakika) doğru genişletmek ilk embriyonik benzeri büyüme konileri distrofik olur. Dorsal sinir kablosu (960 dakika) kısa distrofik büyüme konileri durak. Arrowheads proksimal güdük ve büyüme konileri işaret etmektedir. Oklar proksimal akson mili boyunca membran çıkıntılar işaret etmektedir. Ölçek çubuğu 20um.

Film 1 Film vahşi tip akson rejenerasyonu. Şekil 8'de gösterildiği zaman noktalarında Bu film ile birlikte gider. Protokolde tanımlanmış ve aksonlar yaklaşık 10 saat boyunca her üç dakikada bir görüntülü olarak Worms monte edildi. Z yığınlarının (20 X 1um), her zaman noktasında alınan ve tek görüntüleri maksimum projeksiyon algoritması (NIS Elemanları) tarafından birleştirilir . film izlemek için buraya tıklayın .

Discussion

3,5-11 farklı lazer sistemleri ile lazer mikrocerrahi çeşitli tartışmalar vardır. Femtosecond kızılötesi lazerler, 12 ve rahat bir görüntüleme tesisi ile ilişkili hücre içi lazer ablasyon için "altın standart", ama bireysel kullanıcılar için genellikle çok pahalı . Görüntüleme derinliği nedeniyle görüntüleme örnek için femtosecond kızılötesi lazer ihtiyacınız varsa o zaman muhtemelen bir lazer axotomy için ihtiyacınız olacak. Yüzeyinin 30-50 um içinde hedef aksonlar Şeffaf dokular muhtemelen yüksek na daldırma objektifi aracılığıyla hedeflenen 20 UJ / nabız aralığında, mavi ve yeşil darbe lazerler ile mümkün. Özellikle hedef akson derinliği artar olarak, femtosecond lazer ile karşılaştırıldığında nano ve pico ikinci lazerler daha çok hasar var. C. elegans şeffaf ve tüm aksonlar yüzeyinin 20-30 um içinde. Biz rutin yüzeyinin 5 um içinde motor aksonlar kesti. Ayrıca kolayca balta kestikmanikür yüzeyi yaklaşık 20 um sinir halkası içinde ons. Biz yetişkin bir solucan çapı ile yaklaşık 30-50 um aksonlar kesme sınırı bulundu. Burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, şeffaflık ve derinliği hedef akson kriterlere uygun birçok farklı hazırlıklarını iyi iş olasıdır. Yine de, bu biraz şaşırtıcı IR femtosecond lazerler, nano ve pikosaniye 355 nm ve 532 nm lazerler teorik avantajları göz önüne alındığında, C. lazer axotomy için çok iyi bir performans elegans 6,13. Biz nanosaniyelik 440 nm, 532 nm nanosaniyelik ve femtosecond kızılötesi lazerler lazer axotomy yanıt akson rejenerasyonu açısından herhangi bir farklılık görüyoruz.

Katı hal 355 nm UV lazerler 532 nm pasif Q-anahtarlı katı hal lazer pompalanır aynı maliyet ile ilgili, ancak bu kısa dalga boyuna verimli geçmesi ya da daha yüksek güçler veya optik gerektirir. Çoğu optik görünür 400 ile iyi bir performans için tasarlanmıştır.700 nm ışık. 355 nm lazerler 6 gibi düşük plazma eşik, küçük spot büyüklüğü, ve ablasyon lazer hedef% 100 verimli bir şekilde doğrudan ve örnek sinyal kaybı olmadan GFP eş zamanlı görüntüleme sağlayacak uzun bir pas dikroik gibi bazı avantajları sunacak. Mavi 440 nm lazerler, görünür ışık lazer ile (standart optikler ve güvenliği ile iyi bir performans) çalışma avantajlarını tutacak. Ne yazık ki, bir DPP-Q-anahtarlı katı hal 440 nm lazer maliyet, şu anda benzer bir güç 355nm veya 532 nm lazer 3 kez maliyetidir. C için yeni bir sistem tasarımı olsaydı elegans, hedef derinlik az olduğu, 1 UV şeffaf lens (355nm az% 50-70 geçirgenliği ile maliyet 40X 1.3na petrol lens için yaklaşık 3000 $) ve 355 nm lazer 5-10 UJ / darbe üreten bir tercih olur -20 kHz.

Axon ablasyon plazma oluşumu nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Kısa bakliyat, düşük güç ve plazma hacimleri w plazma eşikleri üretecek hasta 6 adet daha küçük olabilir. Amaç, darbe enerjisi en düşük güç ayarlayarak küçük ve kısa ömürlü plazma üretmek için. Büyük uzun ömürlü plazmalar kavitasyon baloncukları üretecektir hücreleri çevreleyen zarar verebilir. Biz genelde, yüksek frekans (yani 2.5kHz) 50-100 hakkında bakliyat kullanarak o ablasyon bulduk en iyi sonucu verir. Bu hasar yavaş yavaş bakliyat hasarın boyutunu daha iyi kontrol etmek için bir dizi üzerinden entegre edilebilir göstermektedir. Demeti hizalı ve doğru genişletilmiş ise, burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, çok bağışlayıcıdır. Biz,% 10 lazer gücü (ortalama 0.3 mW 2500 Hz'de ölçülür ve tahmini 1 UJ / pulse) yetişkin solucan aksonlar kesme ve% 14 güç ile sınırlı lokalize hasar kesebilir. Hasar daha büyük alanlar% 15-39 lazer güç izleyebilirsiniz, ancak sadece% 40 güç (yaklaşık 1 mW ortalama 2500 Hz'de ölçülen) Yukarıdaki solucanlar büyük kavitasyon baloncukları ve solucan manikür zarar nedeniyle patlayabilir.

e_content "> Steinmeyer ve ark. 2010 2 kağıt, lazer ablasyon sistemi oluşturmak için mükemmel bir kaynak. Leon Avery de ucuz bir N2 gaz 337 nm lazer tabanlı bir lazer ablasyon sistemi güzel bir pratik tanımı ve bazı büyük pratik sağlar tavsiye (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /) kendi sistemi tasarlarken ilk mikroskop hedefi nasıl ablasyon lazer hedef belirlemek için mikroskop temsilcisi ile konuşmak gerekir. mikroskop bir titreşim izolasyonu masaya monte edilmelidir (Newport, TMI, Thor). breadboard en optimal düzeyde, ancak sağlam bir çelik üst hala manyetik konumlandırıcılı kullanılabilir tüm optik elemanlar yer bırakılmalıdır çünkü dik bir kapsamda özel bir ara modül güzel Ancak, daha az pahalı ve kamera bağlantı noktası (ters) veya epi-floresan bir bağlantı noktasına bağlı bir "birleştirici" kullanmak daha uygun olabilir (bir arka diyafram ve geçirgenliği boyutunu bilmek gerekir blation lazer dalga boyu) objektif lens kullanmak niyetinde. Bir kez bir lazer (örneğin, Crylas, teem, Kristal, ya da CRC) Thor ya da Newport doğru optik elemanlar seçerek, donanım ve güvenlik donanımları ile ilgili yardım için başvurmalısınız karar verir. Biz yer kazanmak için bir çift Galile ışın genişletici karar verdi, ancak basit bir Kepler genişletici bir seçenek (f2/f1 = genişleme faktörü). Özel bir ışın genişletici en pahalı olacak, ama Newport, Thor, ve çeşitli lazer üreticileri mükemmel kalitede ticari ışın genişleticiler sunmaktadır. Bazı lazer üreticileri de uygun maliyetli ve yerden tasarruf edilebilir, manuel ve elektronik kontrollü zayıflatıcılar sunuyoruz, ancak Glan-Thompson polarize ve yarım dalga plakası gibi çok yönlü değil. Ayrıca lazer nasıl kontrol etmek için karar vermeniz gerekir. Lazer şirket tarafından sağlanan ticari bir TTL jeneratör, ya da yazılım kullanmak, bir LabView tabanlı denetleyici tasarımı. Özel lazer üreticisi ile seçenekleri tartışın.

çadır "> Biz biz genel bir kılavuz olarak sadece kullanılan var donanımın listesini sağlanan var. Bu sistem bizim mevcut görüntüleme sistemi eklendi zaman hakkında ABD doları 15.000 maliyet burada anlatılan. Sizin yerel Fizik bölümü çoğu zaman için bir pratik giriş sağlamak için istekli birine sahip olacak serbest ışını lazerler ile güvenli bir şekilde çalışıyor.

Immobilizasyon ve zaman atlamalı görüntüleme C için alternatif yöntemler elegans son zamanlarda tarif edilmiştir. 14

Sorun Giderme

En zor ve kritik bir adım mikroskop optik eksen merkezli genişletilmiş ışın uyum. Bir kere ışın merkezi nihai uyum için direksiyon aynalar kullanarak ÖNCE 5 um mikroskop optik eksen içinde hizalanır almak için çok çalışması gerektiğini Galile lensler ile merkezli ve genişletilmiş var. Mikroskop ışını hizalamak için direksiyon aynalar aşırı kullanımı, ışın ile eksen hareket edecekgenişletici. EXTREME DİKKAT KULLANARAK uygun ND filtre ile lazer ışını zayıflatır ve doğrudan bir yansıtıcı hedef (ön yüzeyi ayna) lazer ışın profili görebilirsiniz. (Demiryolu yüksekliğini ayarlamak için yukarı / aşağı aralığı merkezli edilememesi halinde) tam merkezinde 60X objektif alanında kiriş mikroskop hafifçe dürtmek yapabilirsiniz. Işın profili tam ortalanmış bir dairesel kiriş ve simetrik "işaret fişekleri" vermek için mikroskop optik eksene hizalamak için kullanılabilir. Asimetrik bir parlama mikroskop ekseni mükemmel uyumlu değildir (ya da raylı düz değil) olduğunu bir göstergesidir. Son olarak, L3 ayarlamak ve kiriş ve hatta simetrik bir genişleme ve daralma görmek gerekir. Sonra lazer ışını küçük bir noktaya odaklanmak için L3 ayarlamak Odak mikroskop ve hedef yüzeyinde tam. Artık lazer ışını LSCM veya CCD sistemi üzerinden görüntülü ve ablasyon nokta içinde 5 um merkezinin içinde olduğunu bulmak gerekirZ odak 1um.

Eğer solucanlar "havaya uçurmak" ya da sürekli sorun büyük olasılıkla ablasyon lazer ince ayara aksonlar kesmek için büyük kavitasyon baloncukları üreten. En az (<500nm) ablasyon yerinde Z odaklama (L3 lens ile yakınsama ayarlamak) ve XY güvene dayalı spot (son kinematik monte ayna ile ayarlamak) lokalize emin olun.

Yüzeye yakın aksonlar Hedefleme daha az lazer güç gerektiren. Benzer şekilde, küçük hayvanlar (L1 ve L2) yetişkinler de aynı aksonlar hedeflemesine göre axotomy için daha az lazer güç gerektirir.

Vahşi tip aksonlar rejenere veya aksonları çamaşır suyu yoksa, görüntüleme lazer gücünü azaltarak veya örnekleme oranı azalan denemelisiniz. Solucanları ölmek ya da kalırsanız sickly 1% adımlarla yüzde Agaroz azaltmayı deneyin. Başına yüksek kullanırken bu genellikle onları ölüme neden olacak gibi montaj solucanlar sonra lamel hareket etmiyor emin olun.Burada belirtilmesi gereken agaroz ve mikroküreler.

Solucanlar time-lapse oturumu sırasında patlaması ya da ölürseniz nedeniyle: 1. Yüzde agaroz çok yüksek. 2. Hasar ablasyon lazer tarafından kütikülü. 3. Monte edildikten sonra lamel Hareketi. Manikür zarar hata ise sadece ablasyon lazer hedef olmuştur monte solucanlar etkileyecektir.

Solucan time-lapse oturumu sırasında çok fazla hareket ederse,% 0.5 'lik adımlarla yüzde agaroz artırmayı deneyin. Sağlıklı solucanlar Sağlıklı aksonlar her zaman "aktif" ve floresans tutarlı bir seviye göstergesi. , Floresan ya da aktivite ani bir düşüş görürseniz solucan ölüyor ya da öldü. Çoklu boncuklu veya parçalanmış aksonlar, ölüyor ya da ölü bir solucanın bir işaretidir.

Tüm zaman atlamalı oturumu sırasında odak aksonlar tutmak sorun varsa birkaç farklı sorunları olabilir. İlk 10 saat boyunca bir bardak slayt görüntüleme inert bir örnek sahne sürüklenme kontrolrs. Birkaç mikron sürüklenme termal istikrarsızlık nedeniyle olabilir, ancak muhtemelen 5'inden um mikroskop ile mekanik sorunları nedeniyle. Montaj ile ilgili sorunlar daha sık görülür. Zaman atlamalı başlamadan önce monte solucanlar 30 dakika için mikroskop aşaması ile muvazene edelim. Vazelin mühür zaman atlamalı oturumu sırasında sızıntıları geliştirmek olmadığını kontrol edin.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı, Nörobilim McKnight Endowment Fund, Christopher ve Dana Reeve Vakfı ve Amerisure Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
535 nm Laser Crylas FDSS532Q3 (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers)
All optics and hardware (Thor offers comparable optics and hardware)
SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter Newport Corp. SS100-F2KN 2
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm Newport Corp. 10RP52-1 1
Rotation Stage, 1" Aperature Newport Corp. RSP-1T 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm Newport Corp. 10GL08AR.14 1
Polarizer Rotation Mount Newport Corp. RM25A 1
¼" spacer for 1" diameter post Newport Corp. PS-0.25 1
½" height, 1"diameter post Newport Corp. PS-0.5 1
Fork, 1" diameter post Newport Corp. PS-F 1
Beam Dump Newport Corp. PL15 1
Microscope Objective Lens Mount Newport Corp. LH-OBJ1 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm Newport Corp. 10Q20HE.2 4
SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole Newport Corp. SN100C-F 2
High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI Newport Corp. AJS100-0.5K 4
Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female Newport Corp. SS-1-B 2
Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 340-RC 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 1
Rail carrier for X26, square 40mm length Newport Corp. CN26-40 4
Steel Rail, 384mm (15") length Newport Corp. X26-384 1
Rod Platform for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 300-P 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 2
Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPC025AR.14 2
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX082AR.14 1
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX085AR.14 1
Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-0.5 2
Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-1 2
Microspheres 0.1um Polysciences, Inc. 00876
Agarose Research Products International Corp. A20090 EEO matters
Muscimol Sigma-Aldrich M1523

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  2. Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
  3. Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
  4. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
  5. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
  6. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
  7. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
  8. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
  9. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
  10. Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  11. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
  12. Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
  13. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
  14. Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması<em> C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).More

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter