Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Enstaka Läs och Paired End-mRNA-Seq Illumina bibliotek från 10 nanogram Total RNA

Published: October 27, 2011 doi: 10.3791/3340

Summary

Här beskriver vi en metod för framställning av både enskilda läsa och parade mRNA-Seq slutet Illumina sekvensering bibliotek för genuttryck analys baserad på T7 linjär RNA förstärkning. Detta protokoll kräver endast 10 nanogram att starta totala RNA och genererar mycket konsekvent bibliotek som representerar hela avskrifter.

Abstract

Hela transkriptom sekvensering av mRNA-Seq nu används i stor utsträckning för att utföra globala genuttryck, mutation, allel-specifika uttryck och andra heltäckande genomanalyser. mRNA-Seq öppnar även grinden för genuttryck analys av icke-sekvenserat genomet. mRNA-Seq erbjuder hög känslighet, ett stort dynamiskt omfång och möjliggör mätning av antalet avskrift kopia i ett prov. Illumina arvsmassa analysator utför sekvensering av ett stort antal (> 10 7) av relativt kort sekvens läser (<150 BP). Den "parade slut"-metoden, där en enda lång läsa är sekvenserat både dess ändar, möjliggör spårning alternativa skarv korsningar , infogningar och borttagningar och är användbar för de novo transkriptom montering.

En av de stora utmaningarna för forskarna är en begränsad mängd utgångsmaterial. Till exempel i experiment där cellerna skördas med laser micro-dissektion, tillgänglig från total RNA may åtgärd i nanogram. Beredning av mRNA-Seq bibliotek från sådana prover har beskrivits ett, två men innebär betydande PCR-amplifiering som kan sprida fördomar. Andra RNA-Seq bibliotek konstruktion förfaranden med minimal PCR-amplifiering har publicerats 3, 4 men kräver mikrogram mängder av start totala RNA.

Här beskriver vi ett protokoll för Illumina Genome Analyzer II plattform för mRNA-Seq sekvensering för biblioteks-beredningen som undviker betydande PCR-amplifiering och kräver endast 10 nanogram av det totala RNA. Även om detta protokoll har beskrivits tidigare och validerats för ensamstående slut sekvensering 5, där det visades att producera riktad bibliotek utan att införa betydande förstärkning bias, här är vi validera den ytterligare för att användas som ett parade slut protokoll. Vi förstärker selektivt polyadenylated budbärar-RNA från att starta totala RNA med T7 baserat Eberwine linjär förstärkning metod, myntade "T7LA "(T7 linjär förstärkning). Det förstärkta poly-A mRNA är fragmenterade, omvänd transkriberas och adapter knyts ihop och ger de slutliga sekvensering biblioteket. För både singel läsa och parade slutet körs, är sekvenser mappas till den mänskliga transkriptom 6 och normaliserade så att data från flera körningar kan jämföras. Vi rapporterar mätningen genuttryck i enheter av avskrifter per miljon (TPM), vilket är en överlägsen åtgärd för att RPKM när man jämför prover 7.

Protocol

1. Isolera totala RNA

  1. Tillsätt 1 mL Trizol att celler / vävnad och homogenisera med 18-22 gasbinda nål om det behövs.
  2. Tillsätt 200 l kloroform, och snurra på 14.000 rpm i 30 minuter vid 4 ° C.
  3. Ta ut övre vattenskiktet, tillsätt 0,5 l linjär akrylamid, lägg sedan till 500 l isopropanol. Låt sitta i rumstemperatur i 20 minuter.
  4. Snurra på 14.000 rpm vid 4 ° C, tvätta pellets med 70% etanol, och vakuum torr.
  5. Resuspendera i 1 l nukleas gratis vatten och överför till 200 l PCR-rör.

2. Förbered dubbelsträngad cDNA

  1. Till över 1 l RNA tillsätt 1 ìl 100 mikroM oligo-DT-T7 omvänd transkription primer (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3), värme vid 70 ° C (värmeblock) i 5 minuter och snäpp svalt på is.
  2. Tillsätt 1 l 5x FS buffert, 0,5 l DTT, 0,5 l dNTP mix och 0,5 l RnaseOUT (från Upphöjd II sats).
  3. Värm till 42° C i PCR-maskin för 1 minut, tillsätt sedan 0,5 l Upphöjd II omvänt transkriptas. Inkubera 1 timme vid 42 ° C.
  4. Värm vid 70 ° C i 10 minuter, kyl till 4 ° C.
  5. På is, lägg till följande till ovanstående reaktion:
  • Nukleasfritt fritt vatten - 22,75 l
  • 5X Andra programområdet buffert - 7,5 l
  • dNTP mix - 0,75 l
  • E. coli DNA-ligas - 0,25 l
  • E. coli DNA-polymeras - 1 l
  • RnaseH - 0,25 l

Inkubera i 2 tim vid 16 ° C tillsätt sedan 1 l T4 DNA-polymeras, och inkubera i ytterligare 10 minuter vid 16 ° C.

  1. Transfer till 1,5 ml Eppendorf-rör och tillsätt 80 l vatten.
  2. Tillsätt 0,5 l av linjära akrylamid.
  3. Tillsätt 72 l 3 M NH4OAc och 480 l kallt 100% etanol. Fällning för 1 timme vid -20 ° C.
  4. Snurra på 14.000 rpm vid 4 ° C i 30 minuter, skölj med 1 ml 70% etanol, centrifugera vid 14.000 rpm för 2minuter, och vakuum torka i ca 10 minuter.

3. Förstärk poly-A mRNA med in vitro transkription

  1. Resuspendera ovan cDNA i 3,5 l nukleas fritt vatten.
  2. Ovan, tillsätt 1 l varje dNTPs (totalt 4 l), 1 l 10X reaktion buffert och 1 l av T7-polymeras, och 0,5 l av RnaseOUT från Megascript kit.
  3. Inkubera vid 37 ° C i PCR-maskin över natten.
  4. Redo för nästa steg. Kan förvaras vid -80 ° C.

4. Fragmenteringen av förstärkta poly-A mRNA

  1. Tillsätt 26 l vatten till över reaktionen och 4 l 10x fragmentering reagens.
  2. Värme i PCR-maskin vid 70 ° C i exakt 7 minuter.
  3. Tillsätt 5 ìl av fragmentering stopp buffert, satte prov på is.

5. RNA städa upp

  1. Till ovanstående reaktion, tillsätt 60 l vatten och 350 l av buffert RLT från Rneasy MinElute kit, och blanda genom att pipettera.
  2. Tillsätt 250 l etanol, blanda genom att pipettera och pipetten i spinn kolumn.
  3. Snurra på 8000 RCF i 20 sekunder.
  4. Tvätta en gång med RPE, snurra i 20 sekunder, tvätta andra gången med 80% EtOH, snurra i 2 minuter och torka kolumn med 5 minuters spinn.
  5. Eluera RNA i 10 l nukleas fritt vatten.

6. cDNA syntes

Första programområdet syntes för ensamstående läsa biblioteket:

  1. I en PCR-rör, lägg till följande:
  • Fragmenterade Poly-A mRNA - 10 l
  • Noti Slumpmässiga nonamer Primer - 1 l

Inkubera vid 70 ° C i 5 minuter i termocykler, och snabbt kyla på is. Noti Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3). Den 5 "proximala sekvens är den Noti begränsningen platsen medan den nästa sekvens tills det slumpmässiga regionen är den omvända komplement Illumina fäste B-sekvens från Chip-Seq kit.

Ovan, lägg till följande på is (från Upphöjd III kit):
  • 5X första delen buffert -4 l
  • DTT - 2 l
  • dNTP blandning * - 1,5 l

Sätt på termocykler i 2 minuter vid 42 ° C, tillsätt 1 ìl Upphöjd III omvänt transkriptas, och inkubera vid 42 ° C i 1 timme.

* Istället för dCTP var 5-metyl dCTP används i dNTP blandningen.

Första programområdet syntes för parade slutet biblioteket:

  1. I en PCR-rör, lägg till följande:
  • Fragmenterade Poly-A mRNA - 10 l
  • Slumpmässiga hexamer primer - 1 l

Inkubera vid 65 ° C i 5 minuter i termocykler, och snabbt kyla på is.

  1. Ovan, lägg till följande på is (från Upphöjd firststrand III kit):
  • 5X första delen buffert - 4 l
  • DTT - 2 l
  • dNTPs (frånkit) - 1,5 l

Sätt på termocykler i 1 min vid 45 ° C, tillsätt 1 ìl Upphöjd III omvänt transkriptas, och inkubera vid 45 ° C i 1 timme.

Andra programområdet syntes (för båda biblioteken):

  1. Ovan, lägg till följande på is (från Upphöjd II sats):
  • Vatten (RNas gratis) - 91 l
  • 5X Andra programområdet Buffer - 30 l
  • dNTPs (från satsen) - 3 l
  • E. coli DNA-ligas - 1 l
  • E. coli DNA-polymeras - 4 l
  • E. coli RNas H - 1 l

Blanda röret genom inversion, ge en kort centrifugering och inkubera vid 16 ° C i 2 tim.

7. Rena cDNA

  1. Rena cDNA prov med Zymo kolumner eluera i 40 l vatten för ensamstående läsa och 30 l vatten i parade slut bibliotek.

8. Avsluta reparation

För enstaka läsa biblioteket:

  1. Till över 40 ìl cDNA, lägg till:
  • T4 DNA-ligas buffert med 10mm ATP - 5 l
  • dNTP mix - 2 l
  • T4 DNA-polymeras - 1 l
  • Klenow enzym (utspädd 1:5 med vatten till 1U / l) - 1 l
  • T4 PNK - 1 l

Inkubera i värmecykeln i 30 minuter vid 20 ° C.

För parade slutet biblioteket:

(Använd Illumina parade slutet prov prep kit)

  1. Till över 30 l cDNA, lägg till:
  • RNas DNas fritt vatten - 45 l
  • T4 DNA-ligas buffert med 10mm ATP - 10 l
  • 10 mM dNTP mix - 4 l
  • T4 DNA-polymeras - 5 l
  • Klenow enzym - 1 l
  • T4 PNK - 5 l

Inkubera i värmecykeln i 30 minuter vid 20 ° C.

9. cDNA städa upp

  1. C lutar upp cDNA med hjälp av Zymo kolumner. Eluera i 34 ìl av EB för ensamstående läsa och 32 ìl av EB för parade slut bibliotek.

10. Lägg till "A" baser till 3 'änden av DNA-fragment

För enstaka läsa biblioteket:

  1. Förbered följande reaktionsblandningen:
  • DNA-prov - 34 l
  • Klenow buffert - 5 l
  • dATP - 10 l
  • Klenow exo - 1 l

Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.

För parade slutet biblioteket:

  1. Förbered följande reaktionsblandningen:
  • DNA-prov - 32 l
  • Klenow buffert - 5 l
  • dATP - 10 l
  • Klenow exo - 3 l

Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.

11. cDNA städa upp

  1. Städa upp cDNA med hjälp av zymo kolumner. Eluera i 10 ìl av EB.

12. Adapter ligering

jove_step "> För enstaka läsa biblioteket:

(Använd Illumina Chip-Seq prov prep kit)

  1. Förbered följande reaktionsblandningen:
  • DNA-provet - 10 ìl
  • Adapter Oligo Mix - 1 l
  • 2X DNA-ligas Buffer--15 l
  • DNA-ligas - 4 l

Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur. Adaptrar ska tinas på is och efter utspädning 1:20.

För parade slutet biblioteket:

(Använd Illumina parade slutet prov prep kit)

  1. Förbered följande reaktionsblandningen:
  • DNA-provet - 10 ìl
  • PE Adapter Oligo Mix - 10 l
  • 2X DNA-ligas Buffer - 25 l
  • DNA-ligas - 5 l

Inkubera i 15 minuter vid 20 ° C. Adaptrar ska tinas på is och efter utspädning 1:20.

13. Ligatur reaktion städa upp

  1. Städa upp ligation reaktionen med hjälp av zymo kolumner. Eluera i 44 l vatten för ensamstående läsa biblioteket och 6 ìl EB följt av ytterligare eluering i 5 ìl av EB för parade slut bibliotek.

Utför en Noti matsmältning, bara för enstaka läsa biblioteket

  • cDNA - 44 l
  • NEB buffert 3 till 5 l
  • BSA - 0,5 l
  • Noti - 1 l

Inkubera i 2 timmar till över natten vid 37 ° C, och rena reaktion med hjälp av zymo kolumn. Eluera med 6 ìl buffert EB följt av en andra upplösning med 5 ìl av EB.

14. Storlek val / Gel rening

Utför följande med en 2% Sybr Säkra E-Gel från Invitrogen.

  1. Kör program 0-PreRun 2 minuter.
  2. Ladda 1KB plus stege från Invitrogen utspädd 1:4, och last 10 ìl.
  3. Ladda alla DNA-prov, och fylla tomma gränder med 10 l vatten.
  4. Kör program 1-EGel 2% Kör 28 minuter.
  5. Storlek välja 200-300 bp gel SLICe med en fräsch rakblad.

15. Eluera DNA från gel skiva

  1. Väg gel skiva, och tillsätt 3 volymer buffert QG till en mängd gel (använd Gel Extraction Kit från Qiagen)
  2. Inkubera vid 50 ° C i 10 minuter eller tills gelen slice löser sig.
  3. Tillsätt 1 volym ispropanol, och blanda genom inversion eller pipettering.
  4. Lägg till i kolumnen snurra i 1 minut vid maximal hastighet, och kasta genomströmning.
  5. Tillsätt 500 ìl Buffer QG kolumn, snurra i 1 minut vid maximal hastighet, och kasta passera.
  6. Tillsätt 750 ìl Buffer PE-kolumn, snurra i 1 minut vid maximal hastighet, och kasta passera.
  7. Centrifugera i 1 minut vid maximal hastighet.
  8. Eluera i 36 ìl av EB för ensamstående läsa och 23 l EB för parade slut bibliotek.

16. PCR

För enstaka läsa biblioteket:

(Använd Illumina Chip-Seq prov prep kit)

  1. Förbered following PCR-reaktionsblandningen:
  • DNA - 36 l
  • 5X Phusion buffert - 10 l
  • dNTP mix - 1,5 l
  • PCR primer från 1,1 till 1 l
  • PCR primer från 2,1 till 1 l
  • Phusion polymeras - 0,5 l

Använd följande PCR-protokoll:

  • 30 sekunder vid 98 ° C
  • 10 cykler av:
    • 10 sekunder vid 98 ° C
    • 30 sekunder vid 65 ° C
    • 30 sekunder vid 72 ° C
  • 5 minuter vid 72 ° C
  • Håll vid 4 ° C

* Första gången satsen används, späd PCR 01:02 med EB buffert.

För parade slutet biblioteket:

(Använd Illumina parade slutet prov prep kit)

  1. Förbered följande PCR-reaktionen:
  • DNA - 23 l
  • Phusion DNA-polymeras - 25 l
  • PCR primer PE 1,1 till 1 l
  • PCR primer PE 2,1 -1 l

Förstärk med följande PCR-protokoll:

  1. 30 sekunder vid 98 ° C
  2. 10 cykler av:
    • 10 sekunder vid 98 ° C
    • 30 sekunder vid 65 ° C
    • 30 sekunder vid 72 ° C
  3. 5 minuter vid 72 ° C
  4. Håll vid 4 ° C

* Första gången satsen används, späd PCR 01:02 med EB buffert.

17. Bibliotek städa upp

  1. Städa upp biblioteket med hjälp av zymo kolumner. Eluera i 12 ìl av EB

18. Kvantifiera biblioteket

  1. Kvantifiera biblioteket med hjälp av qubit. Den är redo för sekvensering. Använd sekvensering grundfärger från Illumina läsa enda kluster generationen kit V4 eller högre för ensamstående läsa biblioteket och Illumina parade slutet kluster generationen kit V4 eller högre för parade slut bibliotek.

19. Dataanalys

Bowtie 6 användes för att map läser till RefSeq genen set (NCBI Build 36,1). Den enda änden läser (30 nukleotider) och paret End-läsningar (42 nukleotider) kartlades tillåter upp till 10 matcher genen set, och låta upp till två obalans per läsa. Avskrifter miljondelar (TPM) värden erhölls för att mäta genuttryck med hjälp RSEM 7 (RNA-Seq av Förväntan-Maximering).

20. Representativa resultat: Vi gjorde T7LA bibliotek för både singel läsa och parade slutet löper från 1 mikrogram, 100 mikrogram, 10 mikrogram, 1 mikrogram och 100 pg börjar totala RNA (Figur 1). För utvärdering av våra protokoll, gjorde vi enda läser och parade slut bibliotek utan T7-RNA förstärkning från 10 mikrog total RNA Dessa kontroll bibliotek, kallas "MinAmp", har minimal förstärkning. Den enda förstärkningen de genomgår är 10 cykler PCR nära slutet av protokollet till ligate de Illumina sekvensering adaptrar, ett steg gemensam för alla bibliotek. Alla RNA användes var isolerade från H14mänskliga embryonala stamceller 8.

Vi utvärderas först det antal gener identifierats av olika bibliotek (tabell 1 och kompletterande tabell 1). För både singel läsa och parade slutet bibliotek, identifierat 10 ng T7LA biblioteken nästan lika många gener som de 10 biblioteken mikrogram MinAmp, med en TPM på 10 eller mer. När det gäller de lästa enda bibliotek, identifierat 10 ng T7LA bibliotek 100% av 8500 gener som identifierades av 10 oförstärkta mikrogram bibliotek. För parade slutet bibliotek, identifierat 10 ng T7LA bibliotek 86% av de gener som identifierades av 10 oförstärkta mikrogram bibliotek (7961 av 9267 gener). Bibliotek gjorda av mindre än 10 ng inte kunnat identifiera så många gener. Till exempel i det gemensamma läsa protokollet, identifierat 1 ng biblioteket endast ~ 50% av de gener som identifierades av 10 mikrogram MinAmp bibliotek, vilket fick oss att begränsa det lägsta beloppet av de totala RNA för användning med T7LA protokoll till 10 ng. Vidare kartläggning av en städning gen, GAPDH (figur 2) visar att alla T7LA bibliotek gjorda med minst 10 ng att starta RNA identifierat alla exoner, inklusive extrema 5 "exon. Jämförelse av 10 ng T7LA enda läsa och paras slut bibliotek med MinAmp biblioteken uppvisar en hög grad av likhet (Spearman korrelation, R = 0,90 respektive 0,95, figurerna 3a och b). Vi jämförde även de två enskilt läsa och parade slutet biblioteken göras från 10 ng total RNA och de hade en mycket hög korrelationskoefficient (r = 0,92), som visar att båda typerna av bibliotek som gjorts med T7LA-protokollet ger en mycket likartad signatur genuttryck ( Figur 3c.). Därför är T7LA metoden kunna producera sekvensering bibliotek som är lika tillförlitliga och omfattande som MinAmp bibliotek, men från 1000-faldigt lägre utgångsmaterial.

Figur 1
Figur 1 Schema över ihopkopplade slutet och enda läste bibliotek förberedelse protokollet.

jove_content "> Figur 2
Figur 2 En genomet webbläsare bild av en städning gen, GAPDH, för alla enstaka läsa och parade slut bibliotek. Skalningsfält till vänster för att läsa enstaka biblioteken visar 350 totalt läser. Skalan bar i centrum för den ihopkopplade slutet biblioteken visar 5000 totalt läser. Den horisontella axeln representerar genomsekvens av GAPDH.

Figur 3
Figur 3 Korrelation av genuttryck mellan de olika biblioteken (Spearmans):. A. Mellan enda läst 10 ng T7LA och 10 mikrogram MinAmp bibliotek visar att båda dessa bibliotek har en mycket liknande mönster genuttryck (R = 0,90) B. Mellan parade slut 10 ng T7LA och 10 mikrogram MinAmp biblioteket visar deras likhet genuttrycksprofilerna (R = 0,95). C. Korrelation av genen expressions mellan 10 parade ng slut och 10 ng enda läste bibliotek visar en hög grad av likhet mellan dessa bibliotek som utarbetats av T7LA metoden (R = 0,92).

Figur 4
Figur 4 Identifiering av mänskliga embryonala stamceller specifika genes5 från alla enskilda läsa och parade slut bibliotek.

Bibliotek Typ · Raw Kluster % Kluster passerar filtret % Justera till arvsmassa % Error Rate Gener identifierade
MinAmp 10ug Enstaka läsa 225.602 + / - 4952 65,48 + / - 2,58 47,61 + / - 0,53 0,62 + / - 0,06 8500
1ug T7LA Enstaka läsa 144.818 + / - 6513 82,21 + / - 6,45 48,09 + / - 0,27 0,42 + / - 0,03 8757
100 ng T7LA Enstaka läsa 27.385 + / - 1818 81,33 + / - 11,75 44,46 + / - 4,53 0,49 + / - 0,10 8709
10 ng T7LA Enstaka läsa 11.184 + / - 985 60,70 + / - 3,70 14,96 + / - 1,15 0,99 + / - 0,30 8589
1ng T7LA Enstaka läsa 12.695 + / - 1365 53,27 + / - 16,76 4,08 + / - 0,79 2,25 + / - 1,56 4720
100pg T7LA Enstaka läsa 10.390 + / - 1398 72,99 + / - 2,90 1,48 + / - 0,20 1,51 + / - 0,39 1121
MinAmp 10ug Paired End-R1 95.786 + / - 12.937 90,77 + / - 2,79 58,50 + / - 0,95 0,94 + / - 0,38 9267
Paired End-R2 95.786 + / - 12.937 90,77 + / - 2,79 58,13 + / - 1,13 0,99 + / - 0,37
1ug T7LA Paired End-R1 297.669 + / - 10.196 91,35 + / - 0,36 46,89 + / - 0,14 0,47 + / - 0,01 7334
Paired End-R2 297.669 + / - 10.196 91,35 + / - 0,36 45,52 + / - 0,12 0,51 + / - 0,01
100 ng T7LA Paired End-R1 205.602 + / - 9932 90,53 + / - 0,76 63,44 + / - 1,00 0,48 + / - 0,02 8011
Paired End-R2 205.602 + / - 9932 90,53 + / - 0,76 61,80 + / - 8,09 0,60+ / - 0,36
10 ng T7LA Paired End-R1 214.622 + / - 11.155 89,98 + / - 1,13 56,32 + / - 1,94 0,80 + / - 0,26 7961
Paired End-R2 214.622 + / - 11.155 89,98 + / - 1,13 46,41 + / - 18,39 2,48 + / - 2,68 ;
1ng T7LA Paired End-R1 144.951 + / - 19.841 90,54 + / - 1,19 3,91 + / - 0,16 8,71 + / - 0,86 8124
Paired End-R2 144.951 + / - 19.841 90,54 + / - 1,19 3,27 + / - 1,21 9,11 + / - 3,52
100pg T7LA Paired End-R1 187.600 + / - 11.759 89,52 + / - 1,11 1,78 + / - 0,05 13,42 + / - 0,50 6623
Paired End-R2 187.600 + / - 11.759 89,52 + / - 1,11 1,99 + / - 0,23 15,29 + / - 0,96

° R1 och R2 är framåt och bakåt sekvenser av en tagg
* ≥ 10 TPM

Tabell 1. Information om kluster nummer, gener identifierats, felfrekvens, procent anpassning av den inre läsa och parade slut bibliotek.

Kompletterande Tabell 1. Lista över alla gener och deras värden TPM för alla prover, singel läsa och parade slut.

Discussion

Nuvarande protokoll för att göra parade slutet bibliotek kräver mellan 1 mikrogram 9 till 2,5 mikrogram 10 grundbelopp av det totala RNA. Här presenterar vi våra linjär T7 förstärkning baserade (T7LA) metod för att förbereda både singel läsa och parade slutet Illumina sekvensering bibliotek och visa att denna metod gör det möjligt generation av biblioteken från så lågt som 10 ng av det totala RNA, som producerar data som är jämförbar med minimalt Amplified (MinAmp) bibliotek gjord 1000 gånger mer utgångsmaterial (10 mikrogram total RNA). Den 10 ng biblioteken inte bara identifiera liknande totala antalet gener, utan också producera signaturer genuttryck som liknar (figur 3a och b). Dessutom både enskilt läsa och parade slutet bibliotek som produceras av T7LA metoden är mycket lika varandra (figur 3c), som ger forskare möjlighet att jämföra data som genereras av biblioteken tillverkas antingen protokollet. Eftersom dessa bibliotek var beredda från mänskliga embryonala RNA stamceller, sökte viför 30 stamceller specifika gener hos bibliotek och finner att nästan alla av dessa gener (93-100%) identifierats genom biblioteken skall till minst 10 ng start totala RNA (Figur 4) och på så sätt validera våra protokoll. Vi tror att vårt protokoll skulle vara mycket användbart för forskare, särskilt under sådana omständigheter som flöde sorteras celler eller laser-mikro-dissekerat vävnaden där utgångsmaterialet är begränsande. Under sådana omständigheter skulle våra protokoll kan ta fram uppgifter genuttryck jämförbar med bibliotek gjorda av mycket större starta mängder eftersom våra protokoll ger uttryck profiler jämförbara mellan minst tre tiopotenser att starta RNA.

Disclosures

Författarna avslöja att JAT är en av grundarna, stockowner, konsult och styrelseledamot i Cellular Dynamics International (CDI). Han är även vetenskaplig rådgivare till och har ekonomiska intressen i Taktik II Ventures stamceller.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från Morgridge institutet för forskning och University of Wisconsin-stiftelsen. Vi tackar Krista Eastman för redaktionell hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fragmentation reagent Ambion AM8740
Liner Acrylamide Ambion AM9520
MEGAscript T7 Kit Ambion AM1334
Non DEPC treated nuclease free water Ambion AM9932
dNTP set Fermentas R0181
methylated dNTPs Fermentas R0431 For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5 Illumina GD-203-5001 For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles Illumina FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit Illumina IP-102-1001 For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5 Illumina PE-203-5001 For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit Illumina PE-102-1001 For paired end sample prep only
1kb plus ladder Invitrogen 10787-018
E. coli Rnase H Invitrogen 18021-014
Rnase Out Invitrogen 10777-019
2nd strand buffer 5x Invitrogen 10812-014
E. coli DNA polymerase Invitrogen 18010-017
E-gel SYBR safe 2% Invitrogen G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) Invitrogen 18080-085
Trizol Invitrogen 12183555
RNA quibit assay kit Invitrogen Q32852
dsDNA HS qubit assay kit Invitrogen Q32851
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
T4 DNA Polymerase Invitrogen 18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water Invitrogen 10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit Invitrogen 11917-020
Random Primer (invitrogen) Invitrogen 48190-011 For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer IDT N/A For Single Read sample prep only
Oligo dT T7 IDT N/A
Not1 digestion kit New England Biolabs R0189S For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit Qiagen 74204
RNEasy Mini Kit (50) Qiagen 74104
Gel purification kit Qiagen 28604
Dnase set Qiagen 79254
Rneasy MinElute kit Qiagen 74204
DNA clean and concentrator (250X) Zymo Research Corp. D4014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
  2. Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
  5. Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
  7. Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
  8. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  9. mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
  10. ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.

Tags

Molekylärbiologi genetik mRNA-Seq Illumina-Seq profilering av genuttryck hög genomströmning sekvensering
Enstaka Läs och Paired End-mRNA-Seq Illumina bibliotek från 10 nanogram Total RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti,More

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti, V., Nguyen, B. K., Thomson, J. A., Elwell, A. L., Stewart, R. Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA. J. Vis. Exp. (56), e3340, doi:10.3791/3340 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter