Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.

Abstract

Whole Transkriptom-Sequenzierung von mRNA-Seq ist nun weitgehend auf globale Genexpression, Mutation, Allel-spezifische Expression und anderen genomweiten Analysen durchzuführen verwendet. mRNA-Seq selbst öffnet das Tor zur Genexpressionsanalyse der nicht-sequenzierten Genomen. mRNA-Seq bietet eine hohe Empfindlichkeit, einen großen Dynamikbereich und erlaubt die Messung der Niederschrift Kopienzahl in einer Probe. Illumina Genome Analyzer führt die Sequenzierung einer großen Anzahl (> 10 ⁷⁾ von relativ kurzer Sequenzabschnitte (<150 bp). Der "paired end"-Ansatz, wobei eine einzelne lange lesen an seinen beiden Enden ist sequenziert, erlaubt für die Verfolgung von alternativen Spleißstellen , Insertionen und Deletionen, und ist für de novo Transkriptom Montage nützlich.

Eine der wichtigsten Herausforderungen, denen Forscher gegenüberstehen wird eine begrenzte Menge des Ausgangsmaterials. Zum Beispiel in Experimenten, bei denen Zellen durch Laser-Mikrodissektion, zur Verfügung geerntet werden ab Gesamt-RNA may Maßnahme Nanogramm. Vorbereitung der mRNA-Seq-Bibliotheken aus solchen Proben wurden ^{1, 2} beschrieben, aber mit erheblichen PCR-Amplifikation, dass Bias einführen kann. Andere RNA-Seq Bibliothek Bauverfahren mit minimalen PCR-Amplifikation wurden ^{3, 4} veröffentlicht, aber benötigen Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA ab.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Illumina Genome Analyzer II Plattform für mRNA-Seq-Sequenzierung für die Bibliothek Vorbereitung, die erhebliche PCR-Amplifikation vermeidet und benötigt nur 10 Nanogramm Gesamt-RNA. Während dieses Protokoll wurde zuvor auch für Single-End-Sequenzierung ^5, wo sie gezeigt, dass direktionale Bibliotheken, ohne dabei signifikante Verstärkung Bias produzieren beschrieben wurde validiert, hier sind wir zu validieren es weiter für die Verwendung als ein gekoppeltes Ende-Protokoll. Wir selektiv zu verstärken polyadenyliert Boten-RNAs aus beginnend Gesamt-RNA mit der T7 basiert Eberwine lineare Verstärkung Methode geprägt "T7LA "(T7 lineare Verstärkung). Die verstärkten Poly-A-mRNAs fragmentiert sind, revers transkribiert und Adapter ligiert, um die endgültige Sequenzierung Bibliothek zu erzeugen. Für beide gelesen und gepaart Ende läuft, Sequenzen des menschlichen Transkriptom ⁶ sind abgebildet und so normiert, dass Daten aus mehreren Läufen kann verglichen werden. Wir berichten über die Messung der Genexpression in Einheiten von Transkripten pro Million (TPM), die eine überlegene Maßnahme RPKM beim Vergleich Proben ⁷ ist.

Protocol

1. Isolieren der Gesamt-RNA

1. 1ml Trizol Zellen / Gewebe und homogenisieren mit 18-22 Gaze Nadel, wenn nötig.
2. Add 200 ul Chloroform und Spin bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C.
3. Nehmen Sie top wässrige Schicht, fügen 0,5 ul linear Acrylamid, fügen Sie dann 500 ul Isopropanol. Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
4. Spin bei 14.000 rpm bei 4 ° C, waschen Pellet mit 70% Ethanol und Vakuum zu trocknen.
5. Resuspendieren in 1 ul Nuclease freies Wasser und Transfer zum 200 ul PCR-Röhrchen.

2. Bereiten doppelsträngigen cDNA

1. Um die oben genannten 1 ul RNA add 1 ul 100 uM Oligo-dT-T7 reverse Transkription Primer (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), bei 70 ° C (Heizblock) für 5 min, und rasten auf Eis kühlen.
2. Fügen Sie 1 ul 5x FS-Puffer, 0,5 ul DTT, 0,5 ul dNTP-Mix und 0,5 ul RnaseOUT (von SuperScript II Kit).
3. Hitze bis 42° C in PCR-Maschine für 1 Minute, dann fügen Sie 0,5 ul Superscript II Reverse Transkriptase. Inkubation für 1 h bei 42 ° C.
4. Wärme bei 70 ° C für 10 Minuten abkühlen auf 4 ° C.
5. Auf Eis, fügen Sie die folgenden auf die obige Reaktion:

• Nuclease freies Wasser - 22,75 ul
• 5X Zweiter Aktionsbereich Puffer - 7,5 ul
• dNTP-Mix - 0,75 ul
• E. coli-DNA-Ligase - 0,25 ul
• E. coli-DNA-Polymerase - 1 ul
• RNaseH - 0,25 ul

Inkubieren für 2 h bei 16 ° C dann 1 ul T4 DNA Polymerase und Inkubation für weitere 10 Minuten bei 16 ° C.

6. Transfer zum 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen, und fügen Sie 80 ul Wasser.
7. Add 0,5 ul linear Acrylamid.
8. Add 72 ul 3 M NH4-Acetat und 480 ul kaltem 100% Ethanol. Niederschlag für 1 Stunde bei -20 ° C.
9. Spin bei 14.000 rpm bei 4 ° C für 30 Minuten, mit 1 ml 70% Ethanol waschen, zentrifugieren bei 14.000 rpm für 2Minuten, und im Vakuum trocken für etwa 10 Minuten.

3. Amplify poly-A mRNA durch in vitro Transkription

1. Resuspendieren oben cDNA in 3,5 ul Nuclease freies Wasser.
2. Um die oben genannten, fügen Sie 1 ul jeder der dNTPs (insgesamt 4 ul), 1 ul 10x Reaktionspuffer und 1 ul der T7-Polymerase und 0,5 ul RnaseOUT aus Megascript kit.
3. Bei 37 ° C in PCR-Maschine über Nacht.
4. Bereit für den nächsten Schritt. Kann bei -80 ° C gelagert werden

4. Die Fragmentierung der verstärkten Poly-A mRNA

1. Add 26 ul Wasser zu obiger Reaktion und 4 ul 10x Fragmentierung Reagenz.
2. Hitze in PCR-Maschine bei 70 ° C für genau 7 Minuten.
3. Zugabe von 5 ul der Fragmentierung Anschlagpuffer, legte Probe auf Eis.

5. RNA bereinigen

1. Um die obige Reaktion, fügen Sie 60 ul Wasser und 350 ul Puffer RLT aus Rneasy MinElute Kit, und durch Pipettieren gründlich mischen.
2. Add 250 ul Ethanol, durch Pipettieren gründlich mischen und Pipette in Spin-Säule.
3. Spin bei 8000 rcf für 20 Sekunden.
4. Wash einmal mit RPE, Spin für 20 Sekunden, waschen zweites Mal mit 80% EtOH, Spin für 2 Minuten und trockenen Säule mit 5 Minuten zu drehen.
5. Eluieren RNA in 10 ul Nuclease freies Wasser.

6. cDNA-Synthese

Erststrangsynthese für einzelne Lese-Bibliothek:

1. In einem PCR-Röhrchen, fügen Sie die folgenden Schritte aus:

• Fragmentierte Poly-A mRNA - 10 ul
• NotI Zufällige Nonamer Primer - 1 ul

Inkubation bei 70 ° C für 5 Minuten in Thermocycler und schnelles Abkühlen auf Eis. NotI Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT nnnnnnnnn -3 '). Die 5 'proximalen Sequenz ist die NotI Restriktionsschnittstelle während der nächsten Sequenz, bis die zufällige Region ist die reverse Komplement von Illumina-Adapter B-Sequenz von Chip-Seq-Kit.

Um die oben genannten, fügen Sie die folgenden auf dem Eis (aus SuperScript III Kit):

• 5x Erststrang Puffer -4 ul
• DTT - 2 ul
• dNTP-Mischung ^* - 1,5 ul

Setzen Sie auf Thermocycler für 2 Minuten bei 42 ° C, fügen Sie 1 ul SuperScript III-Reverse-Transkriptase, und Inkubieren bei 42 ° C für 1 Stunde.

* Anstelle von dCTP, wurde 5-methyl dCTP in der dNTP-Gemisch verwendet.

Erststrangsynthese für gepaarte Ende Bibliothek:

1. In einem PCR-Röhrchen, fügen Sie die folgenden Schritte aus:

• Fragmentierte Poly-A mRNA - 10 ul
• Zufällige Hexamer Primer - 1 ul

Inkubation bei 65 ° C für 5 Minuten in Thermocycler und schnelles Abkühlen auf Eis.

2. Um die oben genannten, fügen Sie die folgenden auf dem Eis (aus SuperScript firststrand III Kit):

• 5x Erststrang Puffer - 4 ul
• DTT - 2 ul
• dNTPs (vonkit) - 1,5 ul

Setzen Sie auf Thermocycler für 1 min bei 45 ° C, fügen Sie 1 ul SuperScript III-Reverse-Transkriptase, und Inkubieren bei 45 ° C für 1 Stunde.

Zweitstrangsynthese (für beide Bibliotheken):

3. Um die oben genannten, fügen Sie die folgenden auf dem Eis (aus SuperScript II Kit):

• Wasser (RNase frei) - 91 ul
• 5X Zweiten Strand Buffer - 30 ul
• dNTPs (aus Kit) - 3 ul
• E. coli-DNA-Ligase - 1 ul
• E. coli-DNA-Polymerase - 4 ul
• E. coli RNase H - 1 ul

Mix Rohr durch Inversion, eine kurze Spin und Inkubieren bei 16 ° C für 2 Stunden.

7. Purify cDNA

1. Purify cDNA Probe mit Zymo Säulen, Elution in 40 ul Wasser für einzelne Lese-und 30 l Wasser für gepaarte Ende Bibliothek.

8. End Reparatur

Für einzelne Lese-Bibliothek:

1. Um die oben genannten 40 ul cDNA, hinzuzufügen:

• T4 DNA-Ligase-Puffer mit 10 mM ATP - 5 ul
• dNTP-Mix - 2 ul
• T4-DNA-Polymerase - 1 ul
• Klenow-Enzym (1:5 mit Wasser verdünnt, um 1U / ul) - 1 ul
• T4 PNK - 1 ul

Inkubieren in den Thermocycler für 30 Minuten bei 20 ° C.

Für gepaart Ende Bibliothek:

(Verwenden Sie Illumina gepaart Ende Probenvorbereitung kit)

1. Um die über 30 ul cDNA, hinzuzufügen:

• RNase DNase freies Wasser - 45 ul
• T4 DNA-Ligase-Puffer mit 10 mM ATP - 10 ul
• 10 mM dNTP-Mix - 4 ul
• T4-DNA-Polymerase - 5 ul
• Klenow-Enzym - 1 ul
• T4 PNK - 5 ul

Inkubieren in den Thermocycler für 30 Minuten bei 20 ° C.

9. cDNA bereinigen

1. C schlanke bis cDNA mit Zymo Spalten. Eluieren in 34 ul von EB für einzelne Lese-und 32 ul von EB für gepaarte Ende Bibliothek.

10. Add 'A' Basen an das 3'-Ende der DNA-Fragmente

Für einzelne Lese-Bibliothek:

1. Bereiten Sie die folgende Reaktion mix:

• DNA-Probe - 34 ul
• Klenow Puffer - 5 ul
• dATP - 10 ul
• Klenow exo - 1 ul

Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C.

Für gepaart Ende Bibliothek:

1. Bereiten Sie die folgende Reaktion mix:

• DNA-Probe - 32 ul
• Klenow Puffer - 5 ul
• dATP - 10 ul
• Klenow exo - 3 ul

Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C.

11. cDNA bereinigen

1. Clean up cDNA mit Zymo Spalten. Eluieren in 10 ul EB.

12. Adapter Ligation

jove_step "> Für einzelne Lese-Bibliothek:

(Verwenden Sie Illumina Chip-Seq Probenvorbereitung kit)

1. Bereiten Sie die folgende Reaktion mix:

• DNA-Probe - 10 ul
• Adapter Oligo Mix - 1 ul
• 2X DNA Ligase Buffer--15 ul
• DNA-Ligase - 4 ul

Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur. Adapter sollte auf Eis und 1:20 verdünnt aufgetaut werden.

Für gepaart Ende Bibliothek:

(Verwenden Sie Illumina gepaart Ende Probenvorbereitung kit)

1. Bereiten Sie die folgende Reaktion mix:

• DNA-Probe - 10 ul
• PE-Adapter Oligo Mix - 10 ul
• 2X DNA Ligase Puffer - 25 ul
• DNA-Ligase - 5 ul

Inkubieren für 15 Minuten bei 20 ° C. Adapter sollte auf Eis und 1:20 verdünnt aufgetaut werden.

13. Ligationsreaktion bereinigen

1. Clean up the Ligationsreaktion mit zymo Spalten. Eluieren in 44 ul Wasser für einzelne Lese-Bibliothek und 6 ul von EB von einem anderen Elution in 5 ul der EB für gepaarte Ende Bibliothek folgte.

Führen Sie eine NotI Verdau, nur für einzelne Lese-Bibliothek

• cDNA - 44 ul
• NEB-Puffer 3 bis 5 ul
• BSA - 0,5 ul
• NotI - 1 ul

Inkubieren für 2 h bis über Nacht bei 37 ° C, und reinigen Reaktion mit Zymo Spalte. Eluieren mit 6 ul Puffer EB gefolgt von einer zweiten Elution mit 5 ul der EB.

14. Größe Auswahl / Gel Reinigung

Führen Sie die folgenden mit einem 2% Sybr Sichere E-Gel von Invitrogen.

1. Run Program 0-PreRun 2 Minuten.
2. Laden 1kb Plus Leiter von Invitrogen im Verhältnis 1:4 verdünnt und Last 10 pl.
3. Legen Sie alle DNA-Probe, und füllen leere Gassen mit 10 l Wasser.
4. Run Program 1-Egel 2% Run 28 Minuten.
5. Größe wählen 200-300 bp Gel SLICe mit einer frischen Rasierklinge.

15. Eluieren DNA aus Gelscheibe

1. Wiegen Gelscheibe und fügen Sie 3 Volumina Puffer QG zu 1 Volumen-Gel (Verwendung Gel Extraction Kit von Qiagen)
2. Inkubation bei 50 ° C für 10 Minuten oder bis Gelscheibe auflöst.
3. Add 1 Volumen Isopropanol und mischen durch Umdrehen oder Pipettieren.
4. Fügen Sie in die Spalte, Spin für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit und Durchfluss abschütten.
5. Add 500 ul Puffer QG Spalte, Spin für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit, und entsorgen Sie durchströmen.
6. Add 750 ul Puffer PE auf die Spalte, für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit drehen, und entsorgen Sie durchströmen.
7. Säule für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit.
8. Eluieren in 36 ul von EB für einzelne Lese-und 23 ul EB für gepaarte Ende Bibliothek.

16. PCR

Für einzelne Lese-Bibliothek:

(Verwenden Sie Illumina Chip-Seq Probenvorbereitung kit)

1. Bereiten Sie die following PCR-Reaktion-Mix:

• DNA - 36 ul
• 5X Phusion Puffer - 10 ul
• dNTP-Mix - 1,5 ul
• PCR-Primer von 1,1 bis 1 ul
• PCR-Primer von 2,1 bis 1 ul
• Phusion Polymerase - 0,5 ul

Verwenden Sie die folgenden PCR-Protokoll:

• 30 Sekunden bei 98 ° C
• 10 Zyklen von:
  • 10 Sekunden bei 98 ° C
  • 30 Sekunden bei 65 ° C
  • 30 Sekunden bei 72 ° C
• 5 Minuten bei 72 ° C
• Halten bei 4 ° C

^* Das erste Mal, dass das Kit verwendet wird, verdünnten PCR-Primer 1:2 mit EB-Puffer.

Für gepaart Ende Bibliothek:

(Verwenden Sie Illumina gepaart Ende Probenvorbereitung kit)

1. Bereiten Sie den folgenden PCR-Reaktion:

• DNA - 23 ul
• Phusion DNA-Polymerase - 25 ul
• PCR-Primer PE von 1,1 bis 1 ul
• PCR-Primer PE 2,1 -1 ul

Amplify mit folgendem PCR-Protokoll:

1. 30 Sekunden bei 98 ° C
2. 10 Zyklen von:
   • 10 Sekunden bei 98 ° C
   • 30 Sekunden bei 65 ° C
   • 30 Sekunden bei 72 ° C
3. 5 Minuten bei 72 ° C
4. Halten bei 4 ° C

^* Das erste Mal, dass das Kit verwendet wird, verdünnten PCR-Primer 1:2 mit EB-Puffer.

17. Bibliothek aufräumen

1. Clean up-Bibliothek mit Hilfe Zymo Spalten. Eluieren in 12 ul von EB

18. Quantifizieren Bibliothek

1. Quantifizieren Bibliothek mit Qubit. Sie ist bereit für die Sequenzierung. Verwenden Sie Sequenzierungsprimern von Illumina gelesen Cluster Generation Kit V4 oder höher für einzelne Lese-Bibliothek und Illumina gepaart End-Cluster-Generation-Kit V4 oder höher für gepaarte Ende Bibliothek.

19. Datenanalyse

Bowtie ⁶ wurde m verwendetap liest die RefSeq Gen-Set (NCBI Build-36,1). Das einzelne Ende liest (30 Nukleotide) und das Paar Ende liest (42 Nukleotide) wurden kartiert, wodurch bis zu 10 Spiele, um das Gen gesetzt, und damit bis zu zwei Mismatches pro gelesen. Transcripts Per Million (TPM)-Werte wurden erhalten, um die Genexpression mittels RSEM ⁷ (RNA-Seq von Expectation-Maximierung) zu messen.

20. Repräsentative Ergebnisse: Wir haben T7LA Bibliotheken sowohl für einzelne Lese-und gepaart Ende läuft von 1 pg, 100 pg, 10 pg, 1 pg und 100 pg Gesamt-RNA ab (Abbildung 1). Für die Auswertung unseres Protokolls, haben wir einzelne Lese-und End-Bibliotheken gepaart ohne T7-RNA-Amplifikation ab 10 ug Gesamt-RNA Diese Kontrolle Bibliotheken, genannt "MinAmp", haben eine minimale Verstärkung. Die einzige Verstärkung durchlaufen sie sind die 10 PCR-Zyklen in der Nähe des Ende des Protokolls der Illumina Sequenzierung Adapter, ein Schritt in allen Bibliotheken zu unterbinden. Alle RNA wurden aus H14 isolierthumanen embryonalen Stammzellen ^8.

Zunächst die Zahl der Gene, die durch die verschiedenen Bibliotheken (Tabelle 1 und ergänzende Tabelle 1) identifiziert ausgewertet. Für beide gelesen und gepaart Ende Bibliotheken, identifizierte die 10 ng T7LA Bibliotheken fast die gleiche Anzahl von Genen wie die 10 ug MinAmp Bibliotheken, mit einem TPM von 10 oder mehr. Im Falle der einzelnen Bibliotheken zu lesen, wurden die 10 ng T7LA Bibliothek 100% der 8500 Gene, die durch die 10 ug unverstärkte Bibliothek identifiziert. Für gepaart Ende Bibliotheken, identifizierte die 10 ng T7LA Bibliothek 86% der Gene, die durch die 10 ug unverstärkte Bibliothek (7961 von 9267 Gene) identifiziert. Bibliotheken von weniger als 10 ng, wurden nicht in der Lage, so viele Gene zu identifizieren. Zum Beispiel in den einzelnen Lese-Protokoll stellte die 1 ng Bibliothek nur ~ 50% der Gene von den 10 ug MinAmp Bibliothek identifiziert, sodass wir die niedrigste Menge an Gesamt-RNA für den Einsatz mit dem T7LA Protokoll bis 10 ng begrenzen. Darüber hinaus Zuordnung eines Housekeeping-Gen, GAPDH (Abbildung 2) zeigt, dass alle T7LA Bibliotheken mit mindestens 10ng der Ausgangs-RNA aus aller Exons identifiziert, darunter die extreme 5 'Exon. Vergleich der 10 ng T7LA einzigen gelesen und gepaart End-Bibliotheken mit den MinAmp Bibliotheken zeigt ein hohes Maß an Ähnlichkeit (Spearman-Korrelation, R = 0,90 bzw. 0,95, 3a und b). Wir haben auch die beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Bibliotheken aus 10 ng Gesamt-RNA aus verglichen und sie hatten eine sehr hohe Korrelation (R = 0,92), die zeigen, dass beide Arten von Bibliotheken mit dem T7LA Protokoll erzeugen ein sehr ähnliches Gen-Expression Signatur vorgenommen ( Abbildung 3c.). Daher ist die T7LA Methode in der Lage, Sequenzierung Bibliotheken, die als zuverlässig und umfassend wie die MinAmp Bibliotheken sind zu produzieren, sondern aus 1000-fach weniger Ausgangsmaterial.

Abbildung 1 Schema der gekoppelten Ende und einzelne Lese-Bibliothek Vorbereitung Protokoll.

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Abbildung 2 A-Genom-Browser Bild von einem Housekeeping-Gen, GAPDH, für alle ein Lese-und gepaart Ende Bibliotheken. Der Maßstab auf der linken Seite für die einzelnen Lese-Bibliotheken gibt 350 insgesamt liest. Der Balken in der Mitte für das gekoppelte Ende Bibliotheken gibt 5000 Gesamtvolumen liest. Die horizontale Achse stellt die Genomsequenz von GAPDH.

Abbildung 3 Korrelation der Genexpression zwischen den verschiedenen Bibliotheken (Spearman):. A. Zwischen einzelnen Lese 10 ng T7LA und 10 ug MinAmp Bibliothek zeigt, dass sowohl diese Bibliotheken ein sehr ähnliches Genexpressionsmuster (R = 0,90) haben B. zwischen gekoppelten Ende 10 ng T7LA und 10 ug MinAmp Bibliothek zeigt ihre Ähnlichkeit der Genexpressionsprofile (R = 0,95). C. Korrelation der GenexpressionEindrücke zwischen 10 ng gepaart Ende und 10 ng gelesen Bibliotheken zeigen einen hohen Grad der Ähnlichkeit zwischen diesen Bibliotheken durch die T7LA Methode (R = 0,92) vorbereitet.

Abbildung 4: Identifizierung von humanen embryonalen Stammzellen bestimmten genes5 von allen gelesen und gepaart Ende Bibliotheken.

Bibliothek	Typ ·	Raw-Cluster	% Clusters vorbei Filter	% Ausrichten an Genoms	% Error Rate	Gene identifiziert
MinAmp 10ug	Einzel lesen	225.602 + / - 4952	65,48 + / - 2.58	47,61 + / - 0,53	0,62 + / - 0,06	8500
1UG T7LA	Einzel lesen	144.818 + / - 6513	82,21 + / - 6,45	48,09 + / - 0,27	0,42 + / - 0,03	8757
100 ng T7LA	Einzel lesen	27.385 + / - 1818	81,33 + / - 11.75	44,46 + / - 4.53	0.49b / - 0,10	8709
10ng T7LA	Einzel lesen	11.184 + / - 985	60,70 + / - 3,70	14,96 + / - 1,15	0,99 + / - 0,30	8589
1NG T7LA	Einzel lesen	12.695 + / - 1365	53,27 + / - 16,76	4,08 + / - 0,79	2,25 + / - 1.56	4720
100PG T7LA	Einzel lesen	10.390 + / - 1398	72,99 + / - 2,90	1,48 + / - 0,20	1,51 + / - 0,39	1121
MinAmp 10ug	Gepaart End R1	95.786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,50 + / - 0,95	0,94 + / - 0,38	9267
	Gepaart End R2	95.786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,13 + / - 1,13	0,99 + / - 0,37
1UG T7LA	Gepaart End R1	297.669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	46,89 + / - 0,14	0,47 + / - 0,01	7334
	Gepaart End R2	297.669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	45,52 + / - 0,12	0,51 + / - 0,01
100 ng T7LA	Gepaart End R1	205.602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	63,44 + / - 1,00	0,48 + / - 0,02	8011
	Gepaart End R2	205.602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	61,80 + / - 8,09	0,60+ / - 0,36
10ng T7LA	Gepaart End R1	214.622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	56,32 + / - 1,94	0,80 + / - 0,26	7961
	Gepaart End R2	214.622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	46,41 + / - 18,39	2,48 + / - 2.68	;
1NG T7LA	Gepaart End R1	144.951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,91 + / - 0,16	8,71 + / - 0,86	8124
	Gepaart End R2	144.951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,27 + / - 1,21	9,11 + / - 3.52
100PG T7LA	Gepaart End R1	187.600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1,78 + / - 0,05	13,42 + / - 0,50	6623
Gepaart End R2	187.600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1.99 + / - 0,23	15,29 + / - 0,96

¯ r1 und R2 sind Forward-und Reverse-Sequenzen eines Tags
* ≥ 10 TPM

Tabelle 1. Informationen zu Cluster-Nummern, Gene identifiziert, Fehlerrate, Prozent Ausrichtung der einzelnen Lese-und gepaart Ende Bibliotheken.

Ergänzende Tabelle 1. Liste aller Gene und deren TPM-Werte für alle Proben, single gelesen und gepaart Ende.

Discussion

Aktuelle Protokolle für die Herstellung gepaart Ende Bibliotheken benötigen zwischen 1 pg ⁹ bis 2,5 pg ¹⁰ ab Höhe der Gesamt-RNA. Hier präsentieren wir unsere lineare T7 Amplifikation (T7LA)-Methode, um sowohl ein Lese-und gepaart Ende Illumina Sequenzierung Bibliotheken und Show vorzubereiten, dass diese Methode ermöglicht die Erstellung von Bibliotheken aus so niedrig wie 10 ng Gesamt-RNA, Herstellung Daten, die vergleichbar mit der ist minimal verstärkt (MinAmp) Bibliotheken von 1000 fold Ausgangsmaterial mehr (10 ug Gesamt-RNA) hergestellt. Die 10 ng Bibliotheken nicht nur identifizieren, ähnlich Gesamtzahl der Gene, sondern auch zu produzieren Genexpressionssignaturen, die ähnlich sind (Abb. 3a und b). Darüber hinaus sind sowohl die einzelnen Lese-und gepaart Ende Bibliotheken durch die T7LA Verfahren hergestellte sehr ähnlich zueinander (Abbildung 3c), denen die Forscher die Daten von Bibliotheken aus beiden Protokolle erwirtschaftet vergleichen können. Da diese Bibliotheken aus humanen embryonalen Stammzellen RNA bereit waren, suchten wirfür 30 Stammzell-spezifische Gene unter den Bibliotheken und feststellen, dass fast alle diese Gene (93-100%) durch die Bibliotheken von mindestens 10 ng Gesamt-RNA ab (Abbildung 4) gemacht werden identifiziert, damit die Validierung unseres Protokolls. Wir glauben, dass unser Protokoll wäre sehr nützlich für die Forscher, besonders in Fällen wie flow sortierten Zellen oder Laser-Mikro-seziert Gewebe, in dem Ausgangsmaterial ist begrenzt. In einem solchen Fall würde unser Protokoll erlauben Generation von Genexpressionsdaten vergleichbar mit Bibliotheken aus viel größeren Mengen ab gemacht, da unser Protokoll produziert Expressionsprofile vergleichbar mindestens 3 Größenordnungen der Ausgangs-RNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fragmentation reagent	Ambion	AM8740
Liner Acrylamide	Ambion	AM9520
MEGAscript T7 Kit	Ambion	AM1334
Non DEPC treated nuclease free water	Ambion	AM9932
dNTP set	Fermentas	R0181
methylated dNTPs	Fermentas	R0431	For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5	Illumina	GD-203-5001	For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles	Illumina	FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit	Illumina	IP-102-1001	For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5	Illumina	PE-203-5001	For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit	Illumina	PE-102-1001	For paired end sample prep only
1kb plus ladder	Invitrogen	10787-018
E. coli Rnase H	Invitrogen	18021-014
Rnase Out	Invitrogen	10777-019
2nd strand buffer 5x	Invitrogen	10812-014
E. coli DNA polymerase	Invitrogen	18010-017
E-gel SYBR safe 2%	Invitrogen	G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080-085
Trizol	Invitrogen	12183555
RNA quibit assay kit	Invitrogen	Q32852
dsDNA HS qubit assay kit	Invitrogen	Q32851
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
T4 DNA Polymerase	Invitrogen	18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water	Invitrogen	10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit	Invitrogen	11917-020
Random Primer (invitrogen)	Invitrogen	48190-011	For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer	IDT	N/A	For Single Read sample prep only
Oligo dT T7	IDT	N/A
Not1 digestion kit	New England Biolabs	R0189S	For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit	Qiagen	74204
RNEasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104
Gel purification kit	Qiagen	28604
Dnase set	Qiagen	79254
Rneasy MinElute kit	Qiagen	74204
DNA clean and concentrator (250X)	Zymo Research Corp.	D4014