Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Enkelt Læs og Forbundne End mRNA-Seq Illumina Biblioteker fra 10 nanogram Total RNA

Published: October 27, 2011 doi: 10.3791/3340

Summary

Her beskriver vi en metode til klargøring af både enkelt læser og parret ende Illumina mRNA-Seq sekvensering biblioteker til genekspressionsanalyse baseret på T7 lineær RNA forstærkning. Denne protokol kræver kun 10 nanogram at starte total RNA og genererer meget konsekvent biblioteker repræsenterer hele udskrifter.

Abstract

Hele transkriptom sekventering af mRNA-Seq er nu udbredt til at udføre globale genekspression, mutation, allel-specifikke udtryk og andre genom-dækkende analyser. mRNA-Seq selv åbner porten for genekspression analyse af ikke-sekventeret genomer. mRNA-Seq byder på høj følsomhed, et stort dynamikområde og tillader måling af udskrift kopiere numre i en prøve. Illumina er Genome Analyzer udfører sekventering af et stort antal (> 10 7) af relativt kort sekvens læser (<150 bp). Den "parrede ende" tilgang, hvori en enkelt lang læse er sekventeret i begge dens ender, giver mulighed for sporing af alternativ splejsning vejkryds , indsættelser og sletninger, og er nyttigt for de novo transkriptom forsamling.

En af de største udfordringer, som forskere er en begrænset mængde af udgangsmateriale. For eksempel starter i eksperimenter, hvor celler høstes ved hjælp af laser mikro-dissektion, samlede disponible RNA may foranstaltning i nanogram. Udarbejdelse af mRNA-Seq biblioteker fra sådanne prøver er blevet beskrevet 1, 2, men indebærer betydelige PCR-forstærkning, der kan introducere bias. Andre RNA-Seq bibliotek konstruktion procedurer med minimal PCR-amplifikation er blevet offentliggjort 3, 4, men kræver mikrogram mængder af startende total RNA.

Her beskriver vi en protokol for Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sekventering for bibliotek forberedelse, der undgår betydelige PCR amplifikation og kræver kun 10 nanogram af total RNA. Mens denne protokol er blevet beskrevet tidligere, og valideres for enkelt-ende sekventering 5, hvor det viste sig at producere retningsbestemt biblioteker uden at indføre væsentlig forstærkning bias, her har vi validere den videre til brug som en parret ende protokol. Vi selektivt at forstærke polyadenylated messenger RNA fra at starte total RNA ved hjælp af T7 baseret Eberwine lineær forstærkning metode, opfundet "T7LA "(T7 lineær forstærkning). Det forstærkede poly-A mRNA er fragmenterede, reverse transkriberet og adapter ligated at producere det endelige rækkefølge biblioteket. For både enkelt læser og parret ende kører, er sekvenser knyttet til den menneskelige transkriptom 6 og normaliseret, således at data fra flere kørsler kan sammenlignes. Vi rapporterer genekspression måling i enheder af afskrifter per million (TPM), som er en overlegen foranstaltning til RPKM, når man sammenligner prøver 7.

Protocol

1. Isoler total RNA

  1. Tilsæt 1 ml Trizol til celler / væv, og homogeniseres med 18-22 gaze nål hvis det er nødvendigt.
  2. Tilsæt 200 μl chloroform, og spin på 14.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C.
  3. Tag toppen vandige lag, Tilsæt 0,5 μl lineær akrylamid, hvorefter der tilsættes 500 μl isopropanol. Lad sidde ved stuetemperatur i 20 minutter.
  4. Spin på 14.000 omdrejninger i minuttet ved 4 ° C, vaske pellet med 70% ethanol, og vakuum tør.
  5. Resuspenderes i 1 ml nuklease frit vand og overføres til 200 μl PCR-rør.

2. Forbered dobbelt strandede cDNA

  1. Til ovenstående 1 ml RNA tilsættes 1 ml af 100 mM oligo-DT-T7 reverse transkription primer (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), varme ved 70 ° C (varmeblok) i 5 min, og snap køligt på is.
  2. Tilsæt 1 ml 5x FS buffer, 0,5 μl DTT, 0,5 μl dNTP mix og 0,5 μl RnaseOUT (fra hævet II kit).
  3. Varme til 42° C i PCR-maskine i 1 minut, tilsæt derefter 0,5 μl Hævet II reverse transkriptase. Inkuber 1 time ved 42 ° C.
  4. Opvarm ved 70 ° C i 10 minutter, afkøles til 4 ° C.
  5. På is, skal du tilføje følgende til ovennævnte reaktion:
  • Nuklease frit vand - 22,75 μl
  • 5X Anden aktionsdel buffer - 7,5 μl
  • dNTP mix - 0,75 μl
  • E. coli DNA ligase - 0,25 μl
  • E. coli DNA-polymerase - 1 ml
  • RnaseH - 0,25 μl

Inkuber i 2 timer ved 16 ° C, hvorefter der tilsættes 1 ml T4 DNA-polymerase, og inkuber i yderligere 10 minutter ved 16 ° C.

  1. Overførsel til 1,5 ml eppendorfrør, og tilsættes 80 μl vand.
  2. Tilsæt 0,5 μl af lineære acrylamid.
  3. Tilsæt 72 μl 3 M NH4OAc og 480 μl af kold 100% ethanol. Bundfaldet til 1 time ved -20 ° C.
  4. Spin på 14.000 omdrejninger i minuttet ved 4 ° C i 30 minutter, vask med 1 mL 70% ethanol, centrifugeres ved 14.000 rpm i 2minutter, og vakuum tørre i cirka 10 minutter.

3. Forstærk poly-A mRNA ved in vitro-transskription

  1. Resuspender ovenstående cDNA i 3,5 μl nuklease frit vand.
  2. Til ovenstående, 1 ml hver af de dNTP'er (i alt 4 μl), 1 ml af 10X Reaktionsbufferen og 1 ml af T7 polymerase, og 0,5 μl af RnaseOUT fra Megascript kit tilføje.
  3. Inkuber ved 37 ° C i PCR-maskinen natten over.
  4. Klar til næste skridt. Kan opbevares ved -80 ° C.

4. Opsplitning af forstærket poly-A mRNA

  1. Tilsæt 26 μl af vand til over reaktionen og 4 μl 10x fragmentering reagens.
  2. Varme i PCR-maskine ved 70 ° C i præcis 7 minutter.
  3. Tilsæt 5 mikroliter af fragmentering stoppe buffer, sætte prøven på is.

5. RNA rydde op

  1. Til ovenstående reaktion, 60 μl vand og 350 μl af buffer RLT fra Rneasy MinElute kit, og bland ved pipettering tilføje.
  2. Tilsæt 250 μl ethanol blandes ved pipettering, og med pipette til spin-kolonne.
  3. Spin ved 8000 RCF i 20 sekunder.
  4. Vask gang med RPE, spin i 20 sekunder, vask anden gang med 80% EtOH, spin for 2 minutter, og tør kolonne med 5 minutter spin.
  5. Elueres RNA i 10 μl nuklease frit vand.

6. cDNA syntese

Første aktionsdel syntese for enlige Læs biblioteket:

  1. I et PCR-rør, tilføje følgende:
  • Fragmenteret Poly-A mRNA - 10 μl
  • Noti Tilfældige nonamer Primer - 1 ml

Inkuber ved 70 ° C i 5 minutter i thermocycler, og hurtig chill på is. Noti Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 '). De 5 'proksimale sekvens er anmel begrænsningen websted, mens den næste sekvens, indtil den tilfældige regionen er den omvendte supplement til Illumina er adapter B-sekvensen fra Chip-Seq kit.

Til ovenstående, følgende på isen (fra hævet III kit) tilføjer:
  • 5X første streng buffer -4 μl
  • DTT - 2 μl
  • dNTP blanding * - 1,5 μl

Tag thermocycler i 2 minutter ved 42 ° C, der tilsættes 1 ml af hævet III reverse transkriptase, og inkuberes ved 42 ° C i 1 time.

* I stedet for enzym med dFdCDP giver, var 5-methyl enzym med dFdCDP giver bruges i dNTP blandingen.

Første aktionsdel syntese for parrede ende biblioteket:

  1. I et PCR-rør, tilføje følgende:
  • Fragmenteret Poly-A mRNA - 10 μl
  • Tilfældige hexamer primer - 1 ml

Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter i thermocycler, og hurtig chill på is.

  1. Til ovenstående, følgende på isen (fra hævet firststrand III kit) tilføjer:
  • 5X første streng buffer - 4 μl
  • DTT - 2 μl
  • dNTP'er (frakit) - 1,5 μl

Tag thermocycler i 1 min ved 45 ° C, der tilsættes 1 ml af hævet III reverse transkriptase, og inkuberes ved 45 ° C i 1 time.

Anden aktionsdel syntese (for begge biblioteker):

  1. Til ovenstående, følgende på isen (fra hævet II kit) tilføjer:
  • Vand (RNase gratis) - 91 μl
  • 5X Anden Strand Buffer - 30 μl
  • dNTP'er (fra kit) - 3 μl
  • E. coli DNA ligase - 1 ml
  • E. coli DNA-polymerase - 4 μl
  • E. coli RNase H - 1 ml

Bland rør ved at vende og give en kort centrifugering og inkuberes ved 16 ° C i 2 timer.

7. Rense cDNA

  1. Rense cDNA prøve med ZymoGenetics kolonner, elueres i 40 μl vand i en enkelt læser og 30 μl af vand for parrede ende bibliotek.

8. Slut reparation

For enlige Læs biblioteket:

  1. Til over 40 μl af cDNA, tilføjer:
  • T4 DNA ligase buffer med 10mM ATP - 5 mikroliter
  • dNTP mix - 2 μl
  • T4 DNA polymerase - 1 ml
  • Klenow enzym (fortyndes i forholdet 1:5 med vand for at 1U / mikroliter) - 1 ml
  • T4 PNK - 1 ml

Inkubér i den termiske variator i 30 minutter ved 20 ° C.

For parret ende biblioteket:

(Brug Illumina parrede slutningen prøve prep kit)

  1. Til over 30 μl cDNA tilsættes:
  • RNase DNase frit vand - 45 μl
  • T4 DNA ligase buffer med 10mM ATP - 10 μl
  • 10mM dNTP mix - 4 μl
  • T4 DNA-polymerase - 5 mikroliter
  • Klenow enzym - 1 ml
  • T4 PNK - 5 mikroliter

Inkubér i den termiske variator i 30 minutter ved 20 ° C.

9. cDNA rydde op

  1. C læne sig op cDNA ved hjælp af ZymoGenetics kolonner. Elueres i 34 μl af EB for enkelt læser og 32 μl af EB for parrede ende bibliotek.

10. Tilføj 'A' baser til 3 'enden af ​​DNA-fragmenter

For enlige Læs biblioteket:

  1. Forbered følgende reaktion mix:
  • DNA-prøve - 34 μl
  • Klenow buffer - 5 mikroliter
  • dATP - 10 μl
  • Klenow EXO - 1 ml

Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.

For parret ende biblioteket:

  1. Forbered følgende reaktion mix:
  • DNA-prøve - 32 μl
  • Klenow buffer - 5 mikroliter
  • dATP - 10 μl
  • Klenow EXO - 3 μl

Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.

11. cDNA rydde op

  1. Ryd op cDNA ved hjælp af ZymoGenetics kolonner. Elueres i 10 μl af EB.

12. Adapter ligering

jove_step "> For enlige Læs biblioteket:

(Brug Illumina Chip-Seq prøve prep kit)

  1. Forbered følgende reaktion mix:
  • DNA-prøve - 10 μl
  • Adapter Oligo Mix - 1 ml
  • 2X DNA ligase Buffer--15 μl
  • DNA ligase - 4 μl

Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Adaptere skal optøs på is og fortyndet 1:20.

For parret ende biblioteket:

(Brug Illumina parrede slutningen prøve prep kit)

  1. Forbered følgende reaktion mix:
  • DNA-prøve - 10 μl
  • PE Adapter Oligo Mix - 10 μl
  • 2X DNA ligase Buffer - 25 μl
  • DNA ligase - 5 mikroliter

Inkuber i 15 minutter ved 20 ° C. Adaptere skal optøs på is og fortyndet 1:20.

13. Ligatur reaktion rydde op

  1. Ryd op i ligatur reaktion ved hjælp af ZYMO kolonner. Elueres i 44 μl vand i en enkelt læser bibliotek og 6 μl af EB efterfulgt af en anden eluering i 5 mikroliter af EB for parrede ende bibliotek.

Udfør en anmel fordøjelsen, men kun for en enkelt læser bibliotek

  • cDNA - 44 μl
  • NEB buffer 3 til 5 μl
  • BSA - 0,5 μl
  • Anmeldt - 1 ml

Inkuber i 2 time til natten ved 37 ° C, og rense reaktion ved hjælp af ZymoGenetics kolonne. Elueres med 6 μl buffer EB efterfulgt af en anden eluering med 5 mikroliter af EB.

14. Valg af størrelse / Gel rensning

Udfør følgende ved hjælp af en 2% Sybr Sikker E-Gel fra Invitrogen.

  1. Kør Program 0-PreRun 2 minutter.
  2. Load 1KB plus stigen fra Invitrogen fortyndet 1:4, og belastning 10 μl.
  3. Indlæs alle DNA-prøve, og fylde tomme baner med 10 μl vand.
  4. Kør Program 1-EGel 2% Kør 28 minutter.
  5. Størrelse Vælg 200-300 bp gel SLICe med en frisk barberblad.

15. Elueres DNA fra gel slice

  1. Afvejes gel skive, og tilsæt 3 dele buffer QG til 1 volumen af ​​gel (brug Gel Extraction kit fra Qiagen)
  2. Inkuber ved 50 ° C i 10 minutter eller indtil gel slice opløst.
  3. Tilsæt 1 del af ispropanol, og bland ved at vende eller pipettering.
  4. Tilføj til kolonne, spin for 1 minut ved maksimal hastighed, og kassér gennemstrømning.
  5. Tilsæt 500 μl buffer QG til kolonne, spin for 1 minut ved maksimal hastighed, og kassér flow igennem.
  6. Tilsæt 750 μl af Buffer PE til kolonne, spin for 1 minut ved maksimal hastighed, og kassér flow igennem.
  7. Centrifuger i 1 minut ved maksimal hastighed.
  8. Elueres i 36 μl af EB for enkelt læser og 23 μl EB for parret ende bibliotek.

16. PCR

For enlige Læs biblioteket:

(Brug Illumina Chip-Seq prøve prep kit)

  1. Forbered following PCR-reaktionsblanding:
  • DNA - 36 μl
  • 5X Phusion buffer - 10 μl
  • dNTP mix - 1,5 μl
  • PCR-primer fra 1,1 til 1 μl
  • PCR-primer fra 2,1 til 1 μl
  • Phusion polymerase - 0,5 μl

Brug følgende PCR-protokol:

  • 30 sekunder ved 98 ° C
  • 10 cykler af:
    • 10 sekunder ved 98 ° C
    • 30 sekunder ved 65 ° C
    • 30 sekunder ved 72 ° C
  • 5 minutter ved 72 ° C
  • Hold ved 4 ° C

* Den første gang, at kittet anvendes, fortyndes PCR primere 1:2 med EB buffer.

For parret ende biblioteket:

(Brug Illumina parrede slutningen prøve prep kit)

  1. Forbered følgende PCR reaktion:
  • DNA - 23 μl
  • Phusion DNA-polymerase - 25 μl
  • PCR-primer PE fra 1,1 til 1 μl
  • PCR-primer PE 2,1 -1 ml

Forstærk ved hjælp af følgende PCR-protokol:

  1. 30 sekunder ved 98 ° C
  2. 10 cykler af:
    • 10 sekunder ved 98 ° C
    • 30 sekunder ved 65 ° C
    • 30 sekunder ved 72 ° C
  3. 5 minutter ved 72 ° C
  4. Hold ved 4 ° C

* Den første gang, at kittet anvendes, fortyndes PCR primere 1:2 med EB buffer.

17. Bibliotek rydde op

  1. Ryd op i biblioteket ved hjælp af ZymoGenetics kolonner. Elueres i 12 μl af EB

18. Kvantificere bibliotek

  1. Kvantificere bibliotek vha. qubit. Det er klar til sekvensering. Brug sekventering primere fra Illumina enkelt læser cluster generation kit V4 eller højere for enlige læse biblioteks-og Illumina parret ende cluster generation kit V4 eller højere for parret ende bibliotek.

19. Dataanalyse

Bowtie 6 blev brugt til mAP læser til RefSeq genet sæt (NCBI Build 36,1). Den enkelte ende læser (30 nukleotider), og parret slutningen læser (42 nukleotider) blev kortlagt giver mulighed for op til 10 kampe til genet sæt, og giver mulighed for op til to uoverensstemmelser pr læse. Udskrifter Per Million (TPM) værdier blev opnået at måle genekspression hjælp RSEM 7 (RNA-Seq ved forventningsudvidede maksimeringsforslag).

20. Repræsentant Resultater: Vi lavede T7LA biblioteker til både enkelt læse og parret ende løber fra 1 mg, 100 mg, 10 mg, 1 mg og 100 pg startende alt RNA (figur 1). Til evaluering af vores protokol, gjorde vi en enkelt læser og parret slutningen biblioteker uden T7 RNA forstærkning startende fra 10 mikrogram total RNA Disse kontrol-biblioteker, kaldet "MinAmp", har minimal forstærkning. Den eneste forstærkning de gennemgår er de 10 cykler af PCR nær slutningen af ​​protokollen til ligate de Illumina sekventering adaptere, et skridt er fælles for alle biblioteker. Alle RNA bruges blev isoleret fra H14humane embryonale stamceller 8.

Vi først evalueret antallet af gener som de forskellige biblioteker (tabel 1 og supplerende tabel 1). For både enkelt læser og parret ende biblioteker, identificerede 10 ng T7LA biblioteker næsten det samme antal gener, som de 10 mikrogram MinAmp biblioteker, med en TPM på 10 eller derover. I tilfælde af det indre læse biblioteker, identificerede 10 ng T7LA bibliotek 100% af de 8500 gener identificeret af 10 mikrog unamplified bibliotek. For parret slutningen biblioteker, identificerede 10 ng T7LA bibliotek 86% af gener identificeret af 10 mikrog unamplified bibliotek (7961 af 9267 gener). Biblioteker lavet af mindre end 10 ng var ikke i stand til at identificere lige så mange gener. For eksempel, i det indre Læs protokollen 1 ng biblioteket kun identificeret ~ 50% af de gener identificeret af 10 mikrog MinAmp bibliotek, hvilket fik os til at begrænse det laveste beløb af det samlede RNA til brug med T7LA protokol til 10 ng. Desuden kortlægning af en husholdning gen, GAPDH (Figur 2) viser, at alle T7LA biblioteker lavet med mindst 10ng at starte RNA identificeret alle exons, herunder den ekstreme 5 'exon. Sammenligning af de 10 ng T7LA enkelt læser og parret ende biblioteker med MinAmp bibliotekerne viser en høj grad af lighed (Spearman korrelation, R = 0,90 og 0,95 henholdsvis figur 3a og b). Vi har også sammenlignet de to enkelt læser og parret slutningen biblioteker lavet af 10 ng total RNA og de havde en meget høj korrelationskoefficient (R = 0,92), hvilket viser, at begge typer af biblioteker foretages ved hjælp af T7LA protokollen producere en meget lignende genekspression underskrift ( Figur 3c.). Derfor er det T7LA metoden er i stand til at producere sekventering biblioteker, der er lige så pålidelige og omfattende som de MinAmp biblioteker, men fra 1000-gange mindre udgangsmateriale.

Figur 1
Figur 1 skema for parret ende og en enkelt læser bibliotek forberedelse protokol.

jove_content "> Figur 2
Figur 2 En genom browser billede af en husholdning gen, GAPDH for alle enkelt læse og parret ende biblioteker. Skalaen bjælke til venstre for det indre læse biblioteker viser 350 I alt læser. Skalaen bar i centrum for de parrede slutningen bibliotekerne viser 5000 Total læser. Den vandrette akse repræsenterer genom sekvens af GAPDH.

Figur 3
Figur 3 Korrelation af genet udtryk mellem de forskellige biblioteker (Spearman er):. A. Mellem enkelt læser 10 ng T7LA og 10 mikrogram MinAmp bibliotek viser, at begge disse biblioteker har en meget lignende genekspression mønster (R = 0,90) B. Mellem parret ende 10 ng T7LA og 10 mikrogram MinAmp Biblioteket viser deres ligheden af genekspression profiler (R = 0,95). C. Korrelation af gen expressions mellem 10 ng parret ende og 10 ng enkelt læser biblioteker viser en høj grad af lighed mellem disse biblioteker udarbejdet af T7LA metoden (R = 0,92).

Figur 4
Figur 4 Identifikation af humane embryonale stamceller bestemte genes5 fra alle de enkelte læse og parret ende biblioteker.

Bibliotek Type ° Rå Klynger % Klynger passerer filter % Justering til genom % Error Rate Gener identificeret
MinAmp 10ug Single læst 225.602 + / - 4952 65,48 + / - 2,58 47,61 + / - 0,53 0,62 + / - 0,06 8500
1ug T7LA Single læst 144.818 + / - 6513 82,21 + / - 6,45 48,09 + / - 0,27 0,42 + / - 0,03 8757
100ng T7LA Single læst 27.385 + / - 1818 81,33 + / - 11,75 44,46 + / - 4,53 0,49 + / - 0,10 8709
10ng T7LA Single læst 11.184 + / - 985 60,70 + / - 3,70 14,96 + / - 1,15 0,99 + / - 0,30 8589
1ng T7LA Single læst 12.695 + / - 1365 53,27 + / - 16,76 4,08 + / - 0,79 2,25 + / - 1,56 4720
100pg T7LA Single læst 10.390 + / - 1398 72,99 + / - 2,90 1,48 + / - 0,20 1,51 + / - 0,39 1121
MinAmp 10ug Forbundne Slut R1 95.786 + / - 12937 90,77 + / - 2,79 58,50 + / - 0,95 0,94 + / - 0,38 9267
Forbundne Slut R2 95.786 + / - 12937 90,77 + / - 2,79 58,13 + / - 1,13 0,99 + / - 0,37
1ug T7LA Forbundne Slut R1 297.669 + / - 10196 91,35 + / - 0,36 46,89 + / - 0,14 0,47 + / - 0,01 7334
Forbundne Slut R2 297.669 + / - 10196 91,35 + / - 0,36 45,52 + / - 0,12 0,51 + / - 0,01
100ng T7LA Forbundne Slut R1 205.602 + / - 9932 90,53 + / - 0,76 63,44 + / - 1,00 0,48 + / - 0,02 8011
Forbundne Slut R2 205.602 + / - 9932 90,53 + / - 0,76 61,80 + / - 8,09 0,60+ / - 0,36
10ng T7LA Forbundne Slut R1 214.622 + / - 11155 89,98 + / - 1,13 56,32 + / - 1,94 0,80 + / - 0,26 7961
Forbundne Slut R2 214.622 + / - 11155 89,98 + / - 1,13 46,41 + / - 18,39 2,48 + / - 2,68 ;
1ng T7LA Forbundne Slut R1 144.951 + / - 19841 90,54 + / - 1,19 3,91 + / - 0,16 8,71 + / - 0,86 8124
Forbundne Slut R2 144.951 + / - 19841 90,54 + / - 1,19 3,27 + / - 1,21 9,11 + / - 3,52
100pg T7LA Forbundne Slut R1 187.600 + / - 11759 89,52 + / - 1,11 1,78 + / - 0,05 13,42 + / - 0,50 6623
Forbundne Slut R2 187.600 + / - 11759 89,52 + / - 1,11 1,99 + / - 0,23 15,29 + / - 0,96

° R1 og R2 er forlæns og baglæns sekvenser af et tag
* ≥ 10 TPM

Tabel 1. Oplysninger om klynge-numre, gener identificeret, fejlprocent, procent tilpasning af det indre læse og parret ende biblioteker.

Supplerende Tabel 1. Liste over alle gener og deres TPM værdier for alle prøver, single læse og parret ende.

Discussion

Nuværende protokoller for at gøre parret slutningen biblioteker kræver mellem 1 mikrogram 9 til 2,5 mikrogram 10 grundbeløbet for total RNA. Her præsenterer vi vores lineære T7 forstærkning baseret (T7LA) metode til at forberede både enkelt læser og parret slutningen Illumina sekventering biblioteker og vise, at denne metode gør det muligt generation af biblioteker fra så lavt som 10 ng af total RNA, der producerer data, der er sammenlignelig med minimalt forstærket (MinAmp) biblioteker lavet fra 1000 gange mere udgangsmaterialet (10 mikrogram total RNA). De 10 ng biblioteker ikke kun identificere lignende samlede antal gener, men også producere genekspression signaturer, der er ens (figur 3a og b). Desuden er både den enkelte læser og parret slutningen biblioteker produceret af T7LA metode er meget lig hinanden (figur 3c), som gør det muligt for forskerne at sammenligne data genereret af biblioteker lavet af enten protokol. Da disse biblioteker var beredt fra humane embryonale stamceller RNA, vi søgtefor 30 stamceller specifikke gener blandt de biblioteker og finde, at næsten alle disse gener (93-100%) er identificeret ved de biblioteker fremstillet af mindst 10 ng om at starte total RNA (figur 4), og dermed validere vores protokol. Vi mener, at vores protokollen ville være meget nyttigt for forskere, især i en situation som flow sorteret celler eller laser-, mikro-dissekerede væv, hvor udgangsmaterialet er begrænsende. Under sådanne omstændigheder ville vores protokol tillader generation af genekspression data kan sammenlignes med biblioteker lavet af meget større starte mængder, da vores protokol giver udtryk profiler sammenlignelige på tværs af mindst 3 størrelsesordener at starte RNA.

Disclosures

Forfatterne afslører, at JAT er en grundlægger, stockowner, konsulent og medlem af bestyrelsen for Cellulær Dynamics International (CDI). Han fungerer også som videnskabelig rådgiver for og har økonomiske interesser i Taktik II Stem Cell Ventures.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Morgridge Institut for Forskning og University of Wisconsin Foundation. Vi takker Krista Eastman til redaktionel assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fragmentation reagent Ambion AM8740
Liner Acrylamide Ambion AM9520
MEGAscript T7 Kit Ambion AM1334
Non DEPC treated nuclease free water Ambion AM9932
dNTP set Fermentas R0181
methylated dNTPs Fermentas R0431 For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5 Illumina GD-203-5001 For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles Illumina FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit Illumina IP-102-1001 For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5 Illumina PE-203-5001 For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit Illumina PE-102-1001 For paired end sample prep only
1kb plus ladder Invitrogen 10787-018
E. coli Rnase H Invitrogen 18021-014
Rnase Out Invitrogen 10777-019
2nd strand buffer 5x Invitrogen 10812-014
E. coli DNA polymerase Invitrogen 18010-017
E-gel SYBR safe 2% Invitrogen G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) Invitrogen 18080-085
Trizol Invitrogen 12183555
RNA quibit assay kit Invitrogen Q32852
dsDNA HS qubit assay kit Invitrogen Q32851
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
T4 DNA Polymerase Invitrogen 18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water Invitrogen 10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit Invitrogen 11917-020
Random Primer (invitrogen) Invitrogen 48190-011 For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer IDT N/A For Single Read sample prep only
Oligo dT T7 IDT N/A
Not1 digestion kit New England Biolabs R0189S For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit Qiagen 74204
RNEasy Mini Kit (50) Qiagen 74104
Gel purification kit Qiagen 28604
Dnase set Qiagen 79254
Rneasy MinElute kit Qiagen 74204
DNA clean and concentrator (250X) Zymo Research Corp. D4014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
  2. Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
  5. Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
  7. Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
  8. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  9. mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
  10. ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.

Tags

Molekylær Biologi Genetik mRNA-Seq Illumina-Seq genekspression profilering high throughput sekventering
Enkelt Læs og Forbundne End mRNA-Seq Illumina Biblioteker fra 10 nanogram Total RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti,More

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti, V., Nguyen, B. K., Thomson, J. A., Elwell, A. L., Stewart, R. Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA. J. Vis. Exp. (56), e3340, doi:10.3791/3340 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter