Summary
Микро РНК (миРНК) являются важными регуляторами экспрессии генов и, как было показано, чтобы играть роль во многих биологических процессах. Чтобы лучше понять, микроРНК-УТР взаимодействий, мы создали генома коллекция 3 УТР люциферазы журналистам в паре с новым гена люциферазы и анализа реагента, система LightSwitch.
Abstract
Микро РНК (миРНК) являются важными регуляторами экспрессии генов и играют роль во многих биологических процессах. Более 700 человеческих микроРНК были определены до сих пор с каждым, имеющих до сотни уникальных мРНК мишени. Вычислительных средств, выражения и протеомики анализы, и хроматин-иммунопреципитации методы на основе обеспечивают важную информацию для определения мРНК, которые являются прямыми целями частности микроРНК. Кроме того, 3'UTR-репортер тесты стали важным компонентом тщательные исследования целевой микроРНК, поскольку они обеспечивают функциональную доказательств и количественной оценки последствий конкретных микроРНК-3'UTR взаимодействий в клеточной системе. Для того чтобы больше исследователей использовать 3'UTR-репортер анализов и поддержать расширение масштабов таких анализов с высокой пропускной уровнях, мы создали генома коллекция человека 3'UTR люциферазы журналистам в высоко оптимизированной люциферазы LightSwitch Анализ системы. Система также включает в себя синтетические микроРНК целевой репортер конструкций для использования в качестве положительного контроля, различные эндогенные конструкций репортер 3'UTR, и ряд стандартизованных экспериментальных протоколов.
Здесь мы опишем метод котрансфекцию отдельных 3'UTR-репортер строит вместе с микроРНК подражать, которая является эффективной, воспроизводимых и поддающихся высокой пропускной способностью анализа.
Protocol
Введение
Микро РНК стали важными регуляторами экспрессии генов, которые модулируют активность многих важных биологических процессах. Обладая более чем 700 человеческих микроРНК выявленных к настоящему времени 1, это не удивительно, что мутации и неправильного регулирования микроРНК были связаны с различными физиологическими расстройствами, такими как рак и болезни сердца 2,3. Недавние исследования показали, что большинство нормативных микроРНК сайты связывания находятся в 3'UTRs 4,5, а некоторые исследователи подсчитали, что Существуют сотни целей на микроРНК в ячейке 6. Учитывая биологическую важность микроРНК, большое количество микроРНК, которые существуют и большое число целей для каждого из них, крайне важно, чтобы исследователи могут надежно идентифицировать эндогенной цели микроРНК, предпочтительно на платформах поддаются высокой пропускной исследований.
Хотя использование вычислительных средств, как miRBase, TargetScan и PicTar 1,6,7 является мощным средством для создания списков предполагаемых целей мРНК для любой микроРНК, прогнозы пока еще не достаточно точны, чтобы полагаться только 8. Таким образом, исследователи также использовать ряд экспериментальных подходов определить цели заново или для проверки предсказанных целей. Многие команды сделали ставку на высокую пропускную способность меры стационарных мРНК или белка, чтобы идентифицировать гены, для которых выражение меняется, когда микроРНК деятельности возмущается 4,9,10. Такие изменения, несомненно, являются биологически значимых и представляют собой важный первый шаг, однако измерения изменений в общие выражения не делает различия между прямыми последствиями микроРНК по стенограмме и косвенных или вниз по течению сигнализации эффектов. Другие мощные инструменты, которые предоставляют доказательств прямого миРНК-мРНК взаимодействия хроматин-иммунопреципитации (чип) стратегии, которые сшивки Argonaute белки (и, таким образом комплекс RISC) для микро-РНК и мРНК, хотя определение взаимодействующих партнеров не сразу указывают на функциональную эффекты такого события связывания 5,11. Таким образом, 3'UTR-репортер анализов, которые обеспечивают функциональную доказательства эффекта микроРНК на частности УТР стали важной составляющей всестороннего изучения микроРНК. Такая клетка основе анализа данных, взятых вместе с вычислительной прогнозы целевой или выражения и протеомики данных предоставляет убедительные доказательства, что особенно 3'UTR напрямую регулируется микроРНК интересов.
В 3'UTR-репортер анализа, 3'UTR от интересующего гена сливается с конца гена люциферазы репортер. Если 3'UTR является целью микроРНК, стабильности репортер стенограмму и / или ее эффективность перевода будет меняться при изменении функционального концентрации микроРНК. Так в отличие от стенограммы, только на основании анализов, репортер анализы помогают определить влияние как на устойчивое состояние мРНК и белка. Репортер системы могут также быть использованы для изучения функциональных последствий mutagenizing предполагаемый сайт связывания микроРНК в 3'UTR, чтобы подтвердить, что это действительно необходимо для interaction8. И в то время крупномасштабных исследований с использованием выражения массивы, протеомики методы, и Argonaute ChIP ценную генома данные по небольшому числу экспериментальных условиях, клеточных анализов репортер являются наиболее поддаются расширению для изучения микроРНК-3 ' УТР взаимодействий в сотни или тысячи условий, которые могут стать необходимыми для высокопроизводительного скрининга малых молекул или других библиотечных эффекторов.
Многие ученые применили технологию репортер анализа для изучения микроРНК-3'UTR взаимодействий. Тем не менее, с идеей, что многие микроРНК каждой целевой сотни различных стенограммы, было трудно для исследователей, чтобы использовать этот мощный подход к высокой пропускной способности, поскольку масштаб клонирования, проверки и оптимизации шаги для создания тысяч различных 3'UTR- Репортер векторы часто стоят непомерно высокими. В попытке сделать малого и крупного 3'UTR-репортер исследования доступными для любого исследователя, мы создали генома коллекция человека 3'UTRs предварительно клонирован в высоко оптимизированной LightSwitch люциферазы Система анализа. Репортер система также включает в себя проверку управляющие векторы, набор из более чем 700 синтетических миРНК целевой репортер конструкций для использования в качестве положительного контроля, а также ряд стандартизованных протоколов экспериментальным.
Используя следующий протокол, вы можете спросить, есть ли особенности человеческого 3'UTR является целью вашего микроРНК интересов. Критические шаги в этом рабочем процессе являются опытно-конструкторских, трансфекции репортер конструкции и микроРНК мимика, люциферазы анализов репортер, и анализа данных. Для экспериментального дизайна, важно вдумчиво выбрать transfectable клеточной линии, экспериментальные и управляющие конструкции репортер, и микроРНК мимику и ненацеливании управления. Общие высоко transfectable АДГотлична клеточных линий, как HT1080, HepG2, HCT-116, Хела, 293, и другие часто работают с этим протоколом.
Важные замечания по опытно-конструкторских
LightSwitch люциферазы Система анализа является полностью оптимизирован репортер система, которая включает в себя GoClone конструкций использованием RenSP гена люциферазы и LightSwitch люциферазы Реагенты анализа. Использование всех компонентов системы LightSwitch в соответствии с рекомендациями для получения оптимальных результатов анализа репортер.
Котрансфекцию любых олигонуклеотидов / плазмиды с конструкциями распределительных GoClone репортер снижает общую люциферазы сигналы в не-определенным образом. Поэтому, очень важно выполнять следующие комбинации трансфекции: репортер только, репортера + ненацеливании контролем микроРНК, и репортер + конкретных микроРНК.
Наши empty_3UTR вектор (сильный промотор, не УТР) обеспечивает очень высокий уровень люциферазы сигнала и служит в качестве положительного контроля для трансфекции эффективности и синтетических миРНК целевой репортер вектор может служить в качестве положительного контроля для мимической активности. Кроме того, мы рекомендуем использовать GoClone 3'UTR хозяйства управления и случайные элементы управления для точного разделения последовательности конкретных против неспецифических эффектов.
Изучите свой протокол и по возможности сделать мастер смеси для уменьшения изменчивости в данных из-за ошибки пипетирования или испарения.
Этот протокол использует DharmaFect Duo трансфекции реагента (Dharmacon).
День 1
Важный совет: Выберите клеточной линии с умом. Для достижения наилучших результатов используйте линии клеток, которые, как известно, transfectable. Мы также обнаружили, что измеримые реакции репортер 3 'UTR, чтобы имитировать микроРНК ослабляется в клеточных линиях с высоким уровнем эндогенного этой конкретной микроРНК. Если вы не знаете, сколько микроРНК вашей клеточной линии выражает, попробуйте синтетических целевой микроРНК СГГ, которое косвенно меры обилие частности миРНК в клетки, а также информировать вас о том, динамический диапазон вашего анализа.
1. Семенной клетки выход ≥ 80% слияния во время трансфекции.
- Семенной клеток в 96-луночного белая пластина ТЦ в общем объеме 100 мкл.
- Параллельно с этим, семян соответствующее количество клеток в четкой 96-луночного планшета для оценки слияния.
ВАЖНО Совет 1: Слияние является ключом к достижению хороших результатов в мимические эксперимента. Для оптимального нокдаун, камеры должны быть на 100% сливной во время трансфекции.
ВАЖНО TIP 2: использование низких клетки проход для достижения наилучших результатов. Клетки, которые пассировали слишком много раз, как правило, доходность зашумленных данных трансфекции.
День 2
Подготовка GoClonereporter конструкции и микроРНК, то трансфекции в сливной клеток.
2. Подготовка Создает
- Оттепель GoClone конструкции (плазмиды ДНК) при комнатной температуре. Хорошо перемешайте.
- Центрифуга для удаления конденсата от шляпки.
3. Подготовка Микро РНК
- Оттепель микроРНК (конкретные мимику и ненацеливании контроля) при комнатной температуре и центрифуги для удаления конденсата из шапки.
- Развести в рабочую концентрации 2 мкМ в РНКазы без воды.
В дополнение к экспериментальным микроРНК имитировать всегда включают ненацеливании микроРНК контроля. Сотрудничество трансфекции плазмиды и малых РНК олиго приводит к снижению сигнала, чем трансфекции плазмиды в одиночку.
Включите один или более положительными элементами управления. Рассмотрите возможность использования одного из сотни синтетических миРНК целевой репортер векторов в каталоге SGG в.
Включите один или несколько отрицательных или неспецифический управления. SGG имеет диапазон контроля, включая UTRs 3 'ведения хозяйства генов, случайные фрагменты и / или пустые (без УТР вставка) контроля. Использования одного или нескольких из этих элементов управления наряду с экспериментальными построить позволит нормализовать для любого неспецифические эффекты связаны с гиперэкспрессией вашей конкретной микроРНК или ненацеливании контроля.
4. Подготовка трансфекции
- Для каждой трансфекции объединить следующие реагенты для одного анализа:
Смесь 1
| Индивидуальные репортер GoClone: | 3,33 мкл |
| микроРНК: | Варьируется * |
| Сыворотка-свободные средства массовой информации: | до 10 мкл |
* Эффективная концентрация микроРНК может варьироваться от 10 нМ-100 нМ. Проконсультируйтесь микроРНК производителя соответствующей концентрации.
Важный совет: Не добавляйте слишком много имитировать. Разумный диапазон для мимических концентрация составляет 10-50 нм в финале 100 мкл реакции.
Выполните не менее трех репликТе трансфекции для каждого лечения / УТР комбинации и включают в себя дополнительный объем для обеспечения пипетирования ошибки.
Например, умножение одного тома реакция на 3,5, чтобы получить достаточно перемешать трансфекции в течение 3 повторить скважин трансфекции с учетом доплаты за пипетирования ошибки или испарения.
Для каждого репортера, создать репликацию для следующих целей: репортер только, репортера + ненацеливании микроРНК контроля и репортер + конкретных микроРНК.
Настройка трансфекции для таргетинга микроРНК в то же время, как для ненацеливании контроля.
- Макияж DharmaFECT DUO (Dharmacon) смеси следующим образом для каждого трансфекции:
Смесь 2
| DharmaFect Duo: | 0,15 мкл |
| Сыворотка СМИ бесплатно: | 9,85 мкл |
Количество DharmaFECT Duo, которые будут добавлены могут быть линии клеток зависимым.
Сумм, указанных выше, являются подходящими для HT1080 клеток.
Обратитесь к документации изготовителя, чтобы определить необходимое количество для вашего клеточной линии.
Совет: Сделайте большой смесь трансфекции путем умножения объема выше по числу журналистов, число дубликатов и количество микроРНК к тестированию. При расчете суммы трансфекции смесь для подготовки, не забудьте включить небольшое количество дополнительных к ответственности за ошибки пипетирования и испарения.
- Разрешить DharmaFECT смесь Duo для инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Через 5 минут, добавить 10 мкл смеси DharmaFECT Duo (Смесь 2) каждому подготовленные трубки 10uL плазмиды и / или микроРНК (смесь 1). Каждая трубка должна тогда содержать объеме 20 мкл в репликации трансфекции.
- Инкубируйте каждую смесь в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Через 20 минут, добавить 80 мкл предварительно нагревается (37 ° С), антибиотиков, средств массовой информации в полной репликации в каждую пробирку на общую сумму 100 мкл на репликацию трансфекции. Глубоких скважин блок может быть использован для приготовления многих повторяет и образцов одновременно. Смешайте раствор с помощью пипетки вверх и вниз.
- Удалите пластину посеяны из инкубатора. Убедитесь, что элементы не менее 80% вырожденная.
- Тщательно пипетки от средств массовой информации из каждой лунки.
- Добавьте 100 мкл трансфекции смеси (20 мкл ДНК / реагента микс + 80uL средств массовой информации) в каждую лунку.
- Место пластины в инкубаторе в течение ночи.
Не по-инкубировать. Большинство имитирует даст значительных результатов на добросовестных цели в течение 24 часов. Уровень репрессий измеримых на 48 часов может быть больше, но так будет скважины к скважине изменчивости.
Мимические эксперименты проще, чем ингибитор экспериментов. Хотя большинство имитирует значительно подавляют истинные цели в течение 24 часов, значительная де-репрессий связано с ингибитором может занять 48 часов, чтобы быть измеримыми и почти всегда будет менее выражен, чем эффект имитируют.
День 3
Примечание: люциферазы анализы могут проводиться сразу же или пластины могут быть заморожены при температуре -80 ° С (замораживание обычно увеличивает лизис клеток и люциферазы сигнала). Замораживания и оттаивания ваши клетки до опробование для лучших результатов.
ПОМНИТЕ, чтобы замороженные клетки оттепели до комнатной температуры перед добавлением LightSwitch Пробирной реагентов.
5. Мера активности люциферазы с LightSwitch AssayReagents
- Удалить пластины из инкубатора и довести до комнатной температуры.
- Подготовка LightSwitch Пробирной реагентов (для комплекта LS010, протоколы других размеров комплект может найти в Интернете):
- Развести 100X основания путем добавления 100 мкл субстрата растворителя в трубку лиофилизированного субстрата Пробирной. Защищенном от света и минимизации времени при комнатной температуре. 100X Субстрат можно хранить при температуре-20С в течение 2-3weeks. Для достижения наилучших результатов используйте только что восстановленный субстрат.
- Подготовка Пробирной Решение оттаивания 10 мл бутылка буфером в комнате ванна Температура воды и добавить 100 мкл восстановленного 100X Субстрат перед использованием. Хорошо перемешайте.
- Использование многоканальных дозаторов добавить 100 мкл LightSwitch Пробирной Решение (буфер + подложка) непосредственно к каждому образцу и (содержащие 100 мкл + клеток СМИ) в белом 96-луночного планшета. Если клетки были выращены в другую тарелку или колбу формата, передача образцов на белой 96-луночного планшета в общем объеме 100 мкл (СМИ или PBS).
- Крышка, защищенном от света, и инкубировать 30 минут при комнатной температуре. Если опробование более одной пластины, шатаются добавлением анализа решения, с тем, что каждая пластина насиживает в течение 30 минут, прежде чем читать.
- Прочитайте каждую лунку в течение 2 секунд в пластине люминесценцииnometer (SpectraMax L или эквивалент).
- Рассчитать нокдаун, вычисляя люциферазы соотношение сигнал для каждой конструкции для конкретных микроРНК более ненацеливании контроля (люминесценции = конкретной микроРНК / ненацеливании контроля). Использование данных из домашнего хозяйства, случайные, и пустые конструкции для контроля за неисполнение УТР специфические эффекты лечения.
Представитель Результаты
3'UTR целей в наличии таргетинга микроРНК показать люциферазы нокдаун.
Нокдаун 3'UTR-репортер люциферазы деятельности давайте-7а измерялось в HT1080 клеток совместно трансфекции 100ng каждого репортера построить с 20 нм давайте-7а контроль имитировать или не-таргетинг, инкубирования в течение 24 часов, затем чтение люминесцентных репортер сигнала с помощью LightSwitch люциферазы Реагенты анализа.
Рисунок 1. PUNC и ARID3B человека 3'UTRs являются объектом давайте-7а микроРНК. Сигналы от человека журналистам 3'UTR для PUNC и ARID3B генов значительно сбил в присутствии давайте-7а микроРНК имитировать в то время как сигналы для домашнего хозяйства и случайной последовательности UTRs таковыми не являются.
Discussion
Мы создали генома коллекция предварительно клонированных человеческих 3'UTR-репортер конструкций включить изучение микроРНК-3'UTR взаимодействий в живых клетках. Здесь мы показали, воспроизводимость и высокую пропускную способность метода для совместной трансфекции миРНК имитирует с 3'UTR-репортеров использованием люциферазы системы репортер.
Этот метод основан на использовании исследователи высоко transfectable клеточной линии и возмущающих микроРНК деятельность с гиперэкспрессией техники. Исследователи использованием плохо transfectable клеточных линий, могут рассмотреть возможность использования нашего спутника лентивирусов 3'UTR-репортер коллекция, созданная совместно с Sigma (Миссия 3'UTR Lenti GoClones). Лечение клеток с микроРНК имитирует результаты в гиперэкспрессия типа эксперимента, и с любым из таких исследований, исследователи должны учитывать, что это может быть или может не отражать фактических физиологических условиях. Для решения проблемы гиперэкспрессия, исследователи могут использовать ингибиторы микроРНК в дополнение к имитирует для изучения взаимодействия с двумя различными типами возмущений 12-14.
Как только вероятными мишенями микроРНК идентифицируются, исследователи, возможно, пожелают mutagenize предполагаемого микроРНК сайты связывания для определения участков, необходимых для функционального взаимодействия. Они могут также пожелать масштабироваться до тестирования сотни различных потенциальных UTRs цели (Boutz). Кроме того, если исследователи заинтересованы в отношении того микроРНК влияет на стабильность транскрипта или перевод эффективности, люциферазы данным репортера, можно сравнить с мерами стационарных уровней стенограммы. Любое изменение в люциферазы сигнал, который не связан с пропорциональным изменением в протоколе уровня будет указывать на влияние на эффективность перевода. Наконец, исследователи могут использовать репортер векторов создать кривую дозовой сравнивать относительную чувствительность различных UTRs к изменениям в микроРНК концентрации 14.
Disclosures
Авторы сотрудников распределительного устройства Genomics, которые делают инструменты и реактивы, входящие в эту статью. Производство этой статье был организован распределительное Genomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) | VWR international | 82050-736 | |
| Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid | VWR international | 353072 | |
| LightSwitch Luciferase Assay Reagent |  SwitchGear |
LS010 | |
| DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) | Dharmacon | T-2010-02 | |
| Foil Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T592100 | |
| Breathable Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T896100-S | |
| Plate Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L |
References
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale. Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).
- Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).
- Baek, D., Villen, J., Shin, C. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance. PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Lall, S., Krek, A., Chen, K. A genome-wide map of conserved microRNA targets in. 16, 460-471 (2006).
- Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122. J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433, 769-773 (2005).
- Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).
- Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA. 10, 544-5450 (2004).
- Liao, J. M., Lu, H. Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p. J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).
