Summary
MikroRNA (miRNA) är viktiga regulatorer av genuttryck och har visat sig spela en roll i många biologiska processer. För att bättre förstå miRNA-UTR interaktioner har vi skapat en genomet hela samlingen av 3 UTR luciferas reportrar ihopkopplad med en ny luciferas gen och analys reagens, det lightswitch systemet.
Abstract
MikroRNA (miRNA) är viktiga regulatorer av genuttryck och spela en roll i många biologiska processer. Mer än 700 människor miRNA har identifierats hittills med var och en har upp till hundratals unika mål mRNA. Computational verktyg, uttryck och proteomik analyser, och kromatin-immunoprecipitation-baserad teknik ger viktiga ledtrådar för att identifiera mRNA som är direkta mål för en viss miRNA. Dessutom har 3'UTR-reporter analyser blivit en viktig del av grundliga studier miRNA mål eftersom de ger funktionella bevis för och kvantifiera effekter av specifika miRNA-3'UTR interaktioner i en cell-baserat system. För att möjliggöra fler forskare att utnyttja 3'UTR-reporter analyser och för att stödja skala upp av sådana analyser till hög kapacitet nivåer, har vi skapat en genomet hela samling av mänskliga 3'UTR luciferas reportrar i högt optimerade lightswitch luciferas analyssystem. Systemet omfattar även syntetiska miRNA konstruktioner mål reporter för användning som positiva kontroller, olika endogena 3'UTR konstruerar reporter, och en serie av standardiserade försöksprotokoll.
Här beskriver vi en metod för samarbete transfektion av enskilda 3'UTR-reporter konstruerar tillsammans med en miRNA härma som är effektiv, reproducerbar och mottaglig för hög genomströmning analys.
Protocol
Inledning
MikroRNA har dykt upp som viktiga regulatorer av genuttryck som modulerar aktiviteten i många viktiga biologiska processer. Med mer än 700 mänskliga miRNA som hittills upptäckts 1, är det inte förvånande att mutationer och felaktig reglering av miRNA har kopplats till en mängd olika fysiologiska sjukdomar som cancer och hjärtsjukdomar 2,3. Nyligen genomförda studier har visat att majoriteten av miRNA reglerande bindningsställen finns i 3'UTRs 4,5, och vissa forskare har beräknat att det finns hundratals mål per miRNA i cellen 6. Med tanke på den biologiska betydelsen av miRNA, det stora antalet miRNA som finns och det stora antalet mål för varje av dem, är det viktigt att forskarna säkert klarar av att identifiera endogena mål miRNA, helst på plattformar som lämpar sig för hög genomströmning studier.
Samtidigt utnyttjar computational verktyg som miRBase, TargetScan och PicTar 1,6,7 är ett kraftfullt sätt att generera listor med förmenta mRNA mål för alla miRNA, förutsägelser är ännu inte tillräckligt noggranna för att kunna åberopas ensam 8. Därför hävstång forskarna också ett antal experimentella metoder för att identifiera mål de novo eller att validera förutspådde mål. Många lag har förlitat sig på hög genomströmning åtgärder av steady-state mRNA eller protein nivåer för att identifiera gener som uttryck ändras när miRNA verksamheten störs 4,9,10. Sådana förändringar är utan tvekan biologiskt meningsfulla och utgör ett viktigt första steg, men att mäta förändringar i övergripande uttrycket skiljer inte mellan direkta effekter av en miRNA på en utskrift och indirekt eller nedströms signalering effekter. Andra kraftfulla verktyg som ger belägg för direkta miRNA-mRNA interaktioner kromatin-immunoprecipitation (chip) strategier som cross-link argonaute proteiner (och därmed RISC komplexa) till miRNA och mRNA, men att identifiera de samverkande parterna inte omedelbart ange funktionella effekter av en sådan bindande händelse 5,11. Därför har 3'UTR-reporter analyser som ger funktionella bevis för ett miRNA effekt på en viss UTR blivit en viktig del av en grundlig miRNA studie. En sådan cell-baserad analys data som tas tillsammans med datoriserad mål förutsägelser eller uttryck och proteomik data ger starka belägg för att en viss 3'UTR direkt regleras av miRNA av intresse.
I en 3'UTR-reporter analys är 3'UTR från en gen av intresse smält till slutet av en luciferas reporter gen. Om 3'UTR är ett mål för en miRNA kommer reportern avskriften stabilitet och / eller dess översättning effektiviteten förändras med variationer i funktionella miRNA koncentration. Så till skillnad avskrift enbart baserade analyser, reporter analyser hjälpa till att identifiera effekter på både steady state mRNA-och proteinnivåer. Reporter system kan också användas för att studera den funktionella effekterna av mutagenizing en förmodad miRNA bindningsställe i en 3'UTR att bekräfta att det verkligen är nödvändigt för interaction8. Och medan storskaliga studier med hjälp av uttryck arrayer, proteomik tekniker och argonaute ChIP ge värdefull genomet hela data för ett litet antal experimentella förhållanden, cellbaserade reporter analyser är mest mottagliga för att skala upp för att studera miRNA-3 " UTR interaktioner i hundratals eller tusentals villkor som kan bli nödvändiga för high-throughput screening av små molekyler eller andra biblioteks-baserade effectors.
Många forskare har sökt teknik reporter assay för studier av miRNA-3'UTR interaktioner. Men med tanken att många miRNA varje mål hundratals olika avskrifter, har det varit svårt för forskare att utnyttja denna kraftfulla metod på en hög genomströmning skala eftersom kloning, validering och optimering steg för att skapa tusentals olika 3'UTR- reporter vektorer kostar ofta oöverkomliga. I ett försök att göra små-och storskaliga 3'UTR-reporter studier tillgängliga för alla forskare, har vi skapat en Genomvid grupp mänskliga 3'UTRs före klonad i högt optimerade lightswitch luciferas analyssystem. Reportern systemet ingår även validerade kontrollmetoder vektorer, en uppsättning av mer än 700 syntetiska reporter miRNA mål konstruktioner för användning som positiva kontroller och en rad av standardiserade försöksprotokoll.
Med hjälp av följande protokoll, kan du be om en viss människa 3'UTR är ett mål för din miRNA av intresse. Den kritiska steg i detta arbetsflöde är experimentell design, transfektion av reportern konstruerar och härmar miRNA, luciferas analyser reporter och analys av data. För experimentell design är det viktigt eftertänksamt välja en transfectable cellinje, experimentella och kontroll bygger reporter, och härmar miRNA och icke-riktade kontroller. Vanliga högt transfectable ADHerent cellinjer som HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, och andra fungerar ofta bra med detta protokoll.
Viktiga anvisningar om experimentell design
Den lightswitch luciferas analyssystem är ett helt optimerat reporter som omfattar GoClone konstruerar utnyttja RenSP luciferas genen och lightswitch luciferas reagenser analys. Använd alla komponenter i lightswitch System som rekommenderas för att uppnå optimala resultat reporter analys.
Co-transfektion av någon oligos / plasmider med ställverk GoClone reporter konstruktioner minskar den totala luciferas signaler på ett icke-specifikt sätt. Därför är det viktigt att utföra följande transfektion kombinationer: reporter endast reportern + icke-riktade kontroll miRNA och reporter + specifika miRNA.
Vår empty_3UTR vektor (stark promotor, ingen UTR) ger en mycket hög nivå av luciferas signal och fungerar som en positiv kontroll för transfektion effektivitet, och ett syntetiskt miRNA mål reporter vektor kan tjäna som en positiv kontroll för härma aktivitet. Dessutom rekommenderar vi att du använder GoClone 3'UTR hushållning kontroller och slumpmässiga kontroller för exakt separera sekvensspecifika kontra icke-specifika effekter.
Studera dina protokoll och om möjligt göra huvudmixar att minska variabiliteten i dina data på grund av pipettera fel eller avdunstning.
Detta protokoll använder DharmaFect Duo transfektion reagens (Dharmacon).
Dag 1
VIKTIGT TIPS: Välj cellinje klokt. För bästa resultat, använd en cellinje som är kända för att vara transfectable. Vi har också funnit att det mätbara svar på en 3 "UTR reporter till en miRNA härma dämpas i cellinjer med höga endogena nivåerna av just miRNA. Om du inte vet hur mycket miRNA din cellinje uttrycker, försök SGG är syntetiska mikroRNA mål som indirekt mäter förekomsten av en viss miRNA i en cell och informera dig om det dynamiska omfånget av din analys.
1. Seed celler för att ge ≥ 80% sammanflödet vid tidpunkten för transfektion.
- Seed celler i ett 96-såväl vita TC plattan i 100μl totala volymen.
- Parallellt frö rätt antal celler i en tydlig 96-brunnar för att bedöma sammanflödet.
VIKTIGT Tips 1: Confluence är nyckeln till att uppnå goda resultat i ett härma experiment. För optimal ÖVERVÄLDIGANDE bör celler vara 100% sammanflytande vid tidpunkten för transfektion.
VIKTIGT TIPS 2: Använd låg passage celler för bästa resultat. Celler som har passerats för många gånger tenderar att ge bullriga transfektion data.
Dag 2
Förbered GoClonereporter konstruerar och miRNA, sedan transfektera i konfluenta cellerna.
2. Förbered Konstruerar
- Tina GoClone konstruktioner (plasmid DNA) vid rumstemperatur. Blanda väl.
- Centrifugera att ta bort kondensvatten från locket.
3. Förbered Micro RNA
- Tina mikroRNA (specifika härmar och icke-riktade kontroller) vid rumstemperatur och centrifugera att ta bort kondensvatten från mössor.
- Späd till en fungerande koncentration på 2 nm i RNase-fritt vatten.
Förutom en experimentell miRNA imitera innehåller alltid en icke-inriktning miRNA kontroll. Co-transfecting en plasmid och en liten RNA oligo leder till lägre signal än transfecting plasmiden ensam.
Omfatta en eller flera positiva kontroller. Överväg att använda en av de hundratals syntetiska reporter miRNA mål vektorer i SGG katalog.
Omfatta en eller flera negativa eller icke-specifika kontroller. SGG har en rad kontroller inklusive 3 "UTRs av hushållning gener, slumpmässiga fragment och / eller den tomma (ingen UTR infoga) kontroll. Användning av en eller flera av dessa kontroller vid sidan av en experimentell konstruktion kommer du att kunna normalisera för alla icke-specifika effekter hänförliga till överuttryck av din specifika miRNA eller icke-targeting kontroll.
4. Förbered Transfections
- För varje transfektion kombinera följande reagenser för en enda analysen:
Blandning 1
| Individuella GoClone reporter: | 3,33 mikroliter |
| mikroRNA: | Varierar * |
| Serum-fria medier: | till 10 mikroliter |
* Effektiv koncentration av miRNA kan variera från 10 nm-100 nm. Kontakta miRNA tillverkaren för lämplig koncentration.
VIKTIGT TIPS: Lägg inte alltför mycket efterlikna. Ett rimligt intervall för härma koncentrationer är 10-50 nM i finalen 100uL reaktion.
Utför minst tre replikTe transfections för varje behandling / UTR kombination och inkluderar extra volym för att möjliggöra för pipettering fel.
Till exempel, multiplicera den enda reaktionen volymerna med 3,5 för att få tillräckligt transfektion mix för 3 replikera transfektion brunnar inklusive extra för pipettering fel eller avdunstning.
För varje reporter, inrättat replikat för följande: reporter endast reportern + icke-riktade kontroll miRNA och reporter + specifika miRNA.
Ställ in transfections för inriktning mikroRNA samtidigt som de som för en icke-inriktning kontroll.
- Fyll DharmaFECT Duo (Dharmacon) blandning enligt följande för varje transfektion:
Blandning 2
| DharmaFect Duo: | 0,15 mikroliter |
| Serum fria medier: | 9,85 mikroliter |
Mängden DharmaFECT Duo som ska tillsättas får cellinje beroende.
De belopp som anges ovan är lämpliga för HT1080 celler.
Konsultera dokumentationen från tillverkaren för att bestämma lämplig storlek på din cell linje.
Tips: Gör en stor transfektion blandning genom att multiplicera volymen ovan med antalet reportrar, replikerar antalet och antalet miRNA som ska testas. Vid beräkningen av transfektion mix för att förbereda, se till att inkludera en liten mängd extra att redogöra för pipettering fel och avdunstning.
- Låt DharmaFECT Duo blandningen inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Efter 5 minuter, tillsätt 10μL av DharmaFECT Duo blandning (Blandning 2) till var beredd tub med 10uL plasmid och / eller miRNA (Blandning 1). Varje rör ska då innehålla en mängd 20μL per replikat transfektion.
- Inkubera varje blandning i 20 minuter i rumstemperatur.
- Efter 20 minuter, tillsätt 80 mikroliter av förvärmda (37 ° C), antibiotika-fri, komplett medier per replikeras till varje rör för totalt 100μL per replikera transfektion. En djup-och blocket kan användas för framställning av många replikat och prover samtidigt. Blanda lösningen genom att pipettera upp och ned.
- Ta bort seedade plattan från kuvösen. Kontrollera att cellerna är minst 80% konfluenta.
- Försiktigt pipettera bort media från varje brunn.
- Tillsätt 100μL av transfektion blandningen (20uL DNA / reagens mix + 80uL medier) i varje brunn.
- Placera plattan i kuvös över natten.
Inte över-inkubera. De flesta härmar kommer att ge betydande resultat om trovärdiga mål inom 24 timmar. Graden av förtryck mätbara på 48 timmar kan vara större, men så kommer det väl till väl variabilitet.
Mimic experiment är lättare än hämmare experiment. Medan de flesta härmar kommer att avsevärt undertrycka sanna mål inom 24 timmar, stora de-förtryck hänförligt till hämmare kan ta 48 timmar att vara mätbara och kommer nästan alltid att vara mindre uttalad än effekten av härma.
Dag 3
Obs: luciferas tester kan göras omedelbart eller Plattorna kan frysas vid -80 ° C (frysning i allmänhet ökar cellslys och luciferas signal). Frysa och tina dina celler innan testmetoder för bästa resultat.
KOM IHÅG att låta frusna celler tina till rumstemperatur innan du lägger lightswitch analys reagens.
5. Mät luciferas aktivitet med lightswitch AssayReagents
- Avlägsna plattan från kuvösen och sätta till rumstemperatur.
- Förbered lightswitch analysreagenser (för LS010 kit, kan protokoll från andra kit storlekar finns på nätet):
- Rekonstituera 100X substrat genom att lägga till 100μL substrat lösningsmedel tub med frystorkat analys substrat. Skyddas från ljus och minimera tiden vid rumstemperatur. 100X Substrat kan förvaras vid-20C för 2-3weeks. För bästa resultat, använd nyrekonstituerade substrat.
- Förbered analyslösningen med upptining 10 ml flaska av analysbuffert i rumstemperatur vattenbad och tillsätt 100μL rekonstituerad 100X Substrat före användning. Blanda väl.
- Använd en flerkanals pipett för att lägga till 100μL lightswitch analyslösningen (buffert + substrat) direkt till varje prov väl (innehållande 100uL celler + media) i en vit 96-brunnar. Om cellerna odlades i en annan tallrik eller kolv-format, överföra prover till en vit 96-brunnar i 100μL totala volymen (media eller PBS).
- Täckplåt, skydda mot ljus och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Om testmetoder för mer än en platta, ragla tillägg av analysens lösning så att varje platta ruvar i 30 minuter innan du läser.
- Läs varje brunn i 2 sekunder i en tallrik Luminometer (SpectraMax L eller motsvarande).
- Beräkna knockdown genom att beräkna luciferas signal förhållandet för varje bygga för specifika miRNA över den icke-riktade kontrollen (luminiscens = specifik miRNA / icke-targeting kontroll). Använd data från städning, slumpmässiga, och tomma konstruktioner för att kontrollera för icke-UTR specifika behandlingseffekter.
Representativa resultat
3'UTR mål i närvaro av en inriktning miRNA show luciferas knockdown.
Den ÖVERVÄLDIGANDE av 3'UTR-luciferas reporter verksamhet genom att låta-7a mättes i HT1080 celler genom samtidig transfecting 100 ng av varje reporter bygga med 20nm låt-7a härma eller icke-riktade kontroll, inkubation under 24 timmar, sedan läsa självlysande reportern signalen med lightswitch luciferas analysreagenser.
Figur 1. Punktlighet och ARID3B mänskliga 3'UTRs är mål för låt-7a mikroRNA. Signaler från mänskliga 3'UTR reportrar för punktlighet och ARID3B gener är betydligt omkull i närvaro av den låt-7a mikroRNA härma, medan signaler för städning och slumpvis ordning UTRs inte.
Discussion
Vi har skapat en genomet hela samling av pre-klonade 3'UTR-reporter konstruktioner för att möjliggöra studier av miRNA-3'UTR interaktioner i levande celler. Här har vi visat ett reproducerbart och hög genomströmning metod för samarbete transfecting miRNA härmar med 3'UTR-reportrar med hjälp av en luciferas reporter system.
Denna metod förlitar sig på forskare som använder ett högt transfectable cellinje och störande miRNA aktivitet med ett överuttryck teknik. Forskare med dåligt transfectable cellinjer kan överväga att använda vår följeslagare Lentiviral 3'UTR-reporter samling som skapats i samband med Sigma (Mission 3'UTR Lenti GoClones). Att behandla cellerna med miRNA härmar resulterar i ett överuttryck av typen experiment, och med en sådan studie, måste forskare ta hänsyn till att detta kanske eller kanske inte representerar faktiska fysiologiska förhållanden. För att lösa överuttryck problem, kan forskarna använda miRNA hämmare utöver härmar för att studera interaktionen med två olika typer av störning 12-14.
När sannolikt miRNA mål identifieras, kan forskarna vill mutagenize den förmodade miRNA bindningsställen för att avgöra om områden är nödvändiga för funktionell interaktion. De kanske också vill skala upp till testa hundratals olika potentiellt mål UTRs (Boutz). Dessutom, om forskarna är intresserade av om miRNA påverkar avskrift stabilitet eller översättning effektivitet får luciferas reporter data jämföras till åtgärder av steady-state avskrift nivåer. Alla förändringar i luciferas signal som inte är förknippad med en proportionell förändring i avskrift nivåer kommer att peka på en effekt på översättning effektivitet. Slutligen kan forskarna använda reporter vektorer skapa en kurva dos respons för att jämföra den relativa känsligheten av olika UTRs till förändringar i miRNA koncentration 14.
Disclosures
Författarna är anställda av ställverk Genomics som gör verktyg och reagens som förekommer i denna artikel. Produktionen av denna artikel var sponsrad av ställverk Genomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) | VWR international | 82050-736 | |
| Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid | VWR international | 353072 | |
| LightSwitch Luciferase Assay Reagent |  SwitchGear |
LS010 | |
| DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) | Dharmacon | T-2010-02 | |
| Foil Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T592100 | |
| Breathable Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T896100-S | |
| Plate Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L |
References
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale. Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).
- Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).
- Baek, D., Villen, J., Shin, C. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance. PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Lall, S., Krek, A., Chen, K. A genome-wide map of conserved microRNA targets in. 16, 460-471 (2006).
- Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122. J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433, 769-773 (2005).
- Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).
- Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA. 10, 544-5450 (2004).
- Liao, J. M., Lu, H. Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p. J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).
