Summary
מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים ממלאים תפקיד בתהליכים ביולוגיים רבים. יותר מ 700 miRNAs אדם זוהו עד כה עם כל כך עד מאות mRNAs יעד ייחודי. כלים חישוביים, מבחני הביטוי proteomics, וכרומטין-immunoprecipitation טכניקות מבוססות לספק רמזים חשובים לזיהוי mRNAs כי הם מטרות ישירה של מירנה מסוים. בנוסף, 3'UTR-כתב מבחני הפכו מרכיב חשוב של מחקרים מטרה יסודית מירנה משום שהם מספקים ראיות פונקציונלי ו לכמת את ההשפעות של מירנה-3'UTR אינטראקציות ספציפיות במערכת מבוססי תאים. כדי לאפשר לחוקרים יותר 3'UTR-כתב מבחני למנף ולתמוך מדרוג כלפי מעלה של מבחני כזו תפוקה גבוהה רמות, יצרנו אוסף גנום רחב של כתבים 3'UTR האדם בלוציפראז ב בלוציפראז LightSwitch הפערים אופטימיזציה Assay מערכת. המערכת כוללת גם סינתטי היעד מירנה כתב בונה לשימוש שולטת חיובית, שונים אנדוגני כתב בונה 3'UTR, וכן סדרה של פרוטוקולי הניסוי סטנדרטית.
כאן אנו מתארים שיטה transfection משותפת של 3'UTR-כתב מבנים בודדים, יחד עם מירנה לחקות כי הוא יעיל, לשחזור, והוא מקובל ניתוח תפוקה גבוהה.
Protocol
הקדמה
מיקרו RNA התפתחו כמו הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים כי לווסת את פעילותם של רבים תהליכים ביולוגיים חשובים. עם יותר מ 700 miRNAs אדם זוהו עד כה 1, אין זה מפתיע כי מוטציות וויסות לא תקין של miRNAs קושרו במגוון של הפרעות פיזיולוגיות כגון סרטן ומחלות לב 2,3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הרוב המכריע של אתרי מירנה הרגולציה מחייבת נמצאים 3'UTRs 4,5, ו - כמה חוקרים מעריכים כי יש מאות יעדים בכל מירנה בתא 6. לאור החשיבות הביולוגית של miRNAs, מספר גדול של miRNAs כי קיים מספר רב של מטרות עבור כל אחד מהם, זה קריטי, כי החוקרים מסוגלים לזהות מטרות אמין אנדוגני של miRNAs, רצוי על פלטפורמות מקובל תפוקה גבוהה מחקרים.
תוך שימוש בכלים חישוביים כמו miRBase, TargetScan ו PicTar 1,6,7 היא דרך רבת עוצמה כדי ליצור רשימות של מטרות mRNA המשוערת עבור כל מירנה, התחזיות עדיין לא מדויק מספיק כדי לסמוך עליו לבד 8. לכן, החוקרים גם למנף מספר גישות ניסיוניות לזהות מטרות דה נובו או כדי לאמת את מטרות חזה. צוותים רבים הסתמכו על תפוקה גבוהה של אמצעים היציב רמות ה-mRNA או חלבון לזיהוי גנים אשר השינויים ביטוי כאשר פעילות מירנה הוא מוטרד 4,9,10. שינויים כאלה הם ללא ספק משמעות ביולוגית מייצגים צעד ראשון חשוב, אך מדידת שינויים בביטוי הכולל אינו מבחין בין ההשפעות הישירות של מירנה על תעתיק ואפקטים איתות עקיפה או במורד הזרם. כלים רבי עוצמה אחרים המספקים ראיות מירנה-mRNA אינטראקציות ישיר הם הכרומטין-immunoprecipitation (שבב) אסטרטגיות צולבות קישור חלבונים argonaute (ובכך המורכב RISC) כדי miRNAs ו mRNAs, אם כי זיהוי השותפים באינטראקציה לא מיד להצביע על תופעות פונקציונלי אירוע כזה מחייב 5,11. לפיכך, 3'UTR-כתב מבחני המספקים ראיות פונקציונלי אפקט של מירנה על UTR בפרט הפכו מרכיב חשוב של מחקר מעמיק מירנה. תאים כאלה נתונים מבוססי assay נלקח יחד עם תחזיות היעד חישובית או הביטוי נתונים proteomics מספק ראיות חזקות כי 3'UTR מסוים מוסדר ישירות על ידי מירנה של עניין.
ב-assay 3'UTR עיתונאי, 3'UTR מן הגן של הריבית התמזגו בסופו של הגן כתב בלוציפראז. אם 3'UTR הוא יעד של מירנה, התמליל כתב יציבות ו / או יעילות התרגום שלה ישתנה עם וריאציה בריכוז מירנה תפקודית. אז בניגוד תמליל בלבד מבחני מבוסס, מבחני כתב לסייע בזיהוי ההשפעות על מצב יציב הן mRNA ורמות חלבון. מערכות כתב עשוי לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות תפקודית של mutagenizing אתר מירנה המשוערת מחייב 3'UTR כדי לוודא שהוא אכן הכרחי עבור interaction8. ובעוד מחקרים בקנה מידה גדול באמצעות מערכי ביטוי, טכניקות proteomics, וצ'יפ argonaute לספק ערך הגנום כולו נתונים עבור מספר קטן של תנאי הניסוי, המבוסס על תא מבחני הכתב הם נוחים ביותר דרוג לחקר מירנה-3 " אינטראקציות UTR של מאות או אלפי התנאים כפי עשוי להיות נחוץ ההקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות או אחרים המבוססים על ספריה effectors.
מדענים רבים יישמו assay טכנולוגיית הכתב ללימוד מירנה-3'UTR אינטראקציות. עם זאת, הרעיון כי miRNAs רבים כל מאות היעד של תעתיקים שונים, זה כבר קשה עבור החוקרים להשתמש בגישה זו עוצמה בהיקף תפוקה גבוהה בגלל הצעדים שיבוט, אימות, ואופטימיזציה ליצירת אלפי שונות 3'UTR- וקטורים כתב לעיתים עלות אוסרני. במאמץ להפוך את קטן בקנה מידה גדול 3'UTR, כתב מחקרים נגיש כל חוקר, יצרנו אוסף רחב של הגנום האנושי 3'UTRs מראש משובטים לתוך מערכת LightSwitch הפערים אופטימיזציה Assay בלוציפראז. מערכת הכתב כוללת גם וקטורים לשלוט תוקף, קבוצה של יותר מ -700 סינתטי היעד מירנה בונה כתב לשימוש שולטת חיובית, סדרה של פרוטוקולי הניסוי סטנדרטית.
באמצעות פרוטוקול הבאה, אתה יכול לשאול אם 3'UTR אדם מסוים הוא מטרה של מירנה העניין שלך. השלבים הקריטיים בתהליך עבודה זה עיצוב ניסיוני, transfection של מבנים הכתב מחקה מירנה, מבחני כתב בלוציפראז, וניתוח נתונים. עבור תכנון הניסוי, חשוב לבחור קו מחשבה תא transfectable, בונה כתב ניסיוני שליטה, מחקה מירנה ולא מיקוד שולטת. נפוצים מאוד, transfectable ADHשורות תאים erent כמו HT1080, HepG2, HCT-116, הלה, 293, ואחרים לעתים קרובות לעבוד היטב עם פרוטוקול זה.
הערות חשובות על עיצוב ניסיוני
מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch היא מערכת הכתב אופטימיזציה מלאה הכוללת בונה GoClone ניצול גן בלוציפראז RenSP ו ריאגנטים LightSwitch Assay בלוציפראז. שימוש בכל מרכיבי מערכת LightSwitch מומלץ להשיג תוצאות אופטימליות assay הכתב.
Co-transfection של כל oligos / פלסמידים עם בונה switchgear GoClone כתב מפחית אותות בלוציפראז הכוללת באופן לא ספציפי. לכן, חשוב לבצע את שילובים transfection הבאים: רק עיתונאי, עיתונאי + אי - מירנה מיקוד שליטה, כתב + מירנה ספציפיים.
וקטור empty_3UTR שלנו (האמרגן חזק, לא UTR) מספק רמה גבוהה מאוד של האות בלוציפראז ומשמשת כביקורת חיובית עבור יעילות transfection, וכן מירנה סינתטי היעד וקטור הכתב יכול לשמש כביקורת חיובית לחקות פעילות. בנוסף, אנו ממליצים להשתמש 3'UTR שולטת GoClone משק בקרות אקראיות עבור במדויק הפרדת רצף ספציפי לעומת הלא ספציפית אפקטים.
עיון בפרוטוקול שלך בכל הזדמנות אפשרית לעשות מאסטר מתערבב כדי להקטין את השתנות בנתונים בשל טעות pipetting או אידוי.
פרוטוקול זה משתמש DharmaFect מגיב Duo transfection (Dharmacon).
יום 1
טיפ חשוב: בחר קו הסלולרי שלך בתבונה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להשתמש בקו התא ידוע transfectable. מצאנו גם כי התגובה למדידה של כתב UTR '3 עד מירנה לחקות הוא נחלש ב שורות תאים עם רמות גבוהות של מירנה אנדוגני מסוים. אם אתה לא יודע כמה מירנה הקו הסלולרי שלך מבטאת, נסו למקד microRNA סינתטי של SGG בעקיפין אשר מודד את שפע של מירנה מסוים בתא, כמו גם לידע אותך לגבי הטווח הדינמי של assay שלך.
1. בתאי זרע להניב מפגש ≥ 80% בתקופה של transfection.
- זרעים תאים 96-TC גם צלחת לבנה הנפח הכולל 100μl.
- בכל זרע, במקביל במספר המתאים של תאים בצלחת 96-ברור גם להערכת מפגש.
טיפ חשוב 1: מפגש הוא המפתח להשגת תוצאות טובות בניסוי לחקות. עבור מציאה אופטימלי, התאים צריכים להיות 100% ומחוברות בזמן של transfection.
טיפ חשוב 2: השתמש בתאים מעבר נמוך לקבלת התוצאות הטובות ביותר. תאים שהיו passaged פעמים רבות מדי נוטים להניב נתונים transfection רועש.
יום 2
הכן בונה GoClonereporter ו miRNAs, אז transfect לתוך התאים ומחוברות.
2. הכן בונה
- GoClone הפשירי בונה (DNA פלסמיד) בטמפרטורת החדר. מערבבים היטב.
- צנטריפוגה להסיר עיבוי מן הכובע.
3. הכן מיקרו RNAs
- הפשירי רנ"א (מחקה ספציפית ולא מיקוד שולטת) בטמפרטורת החדר צנטריפוגות כדי להסיר התעבות של כמוסות.
- לדלל את ריכוז העבודה של 2 מיקרומטר במים RNase חינם.
בנוסף מירנה ניסוי לחקות תמיד כוללים שליטה ללא מיקוד מירנה. Co-transfecting פלסמיד ו קטן RNA אוליגו מוביל אות נמוך יותר transfecting הפלסמיד בלבד.
כלול אחד או יותר שולטת חיובית. שקול להשתמש באחד ממאות סינתטי היעד מירנה וקטורים כתב בקטלוג של SGG.
כלול אחד או יותר שולטת שלילי או שאינם ספציפיים. SGG יש מגוון של בקרות כולל UTRs '3 גנים משק בית, שברי אקראי ו / או שליטה ריק (אין להכניס UTR). השימוש באחד או יותר פקדים אלה לצד לבנות ניסיונית יאפשר לך לנרמל לכל הלא ספציפית השפעות המיוחס overexpression של מירנה הספציפי שלך או לשלוט ללא מיקוד.
4. הכן Transfections
- במשך כל transfection לשלב את ריאגנטים הבאים assay אחת:
תערובת 1
| כתב הפרט GoClone: | 3.33 μL |
| microRNA: | משתנה * |
| סרום ללא מדיה: | כדי μL 10 |
* ריכוז יעיל של מירנה יכול לנוע בין 10 ננומטר-100 ננומטר. התייעצו עם היצרן מירנה ריכוז מתאים.
טיפ חשוב: אל תוסיף יותר מדי לחקות. טווח סביר עבור לחקות ריכוזי הוא 10-50 ננומטר התגובה 100uL הסופי.
בצע לפחות שלוש העתקtransfections te עבור כל טיפול / שילוב UTR וכוללים נפח נוסף כדי לאפשר pipetting שגיאה.
כך, למשל, להכפיל את כמויות תגובה אחת על ידי 3.5 כדי לקבל תערובת transfection מספיק 3 בארות transfection לשכפל כולל תוספת pipetting שגיאה או אידוי.
עבור כל כתב, להגדיר עבור משכפל הבאות: רק עיתונאי, עיתונאי + ללא מיקוד מירנה מלאה לכתב + מירנה ספציפיים.
הגדרת transfections עבור microRNA את המיקוד באותו זמן כמו אלה עבור פקד אי - המיקוד.
- מאפרים DUO DharmaFECT (Dharmacon) תערובת כדלקמן transfection עבור כל:
תערובת 2
| DharmaFect Duo: | 0.15 μL |
| סרום חינם התקשורת: | 9.85 μL |
כמות DharmaFECT Duo שיתווספו עשוי להיות קו התא תלוי.
הסכומים שצוינו לעיל מתאימים HT1080 תאים.
עיין בתיעוד של היצרן כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור הקו הסלולרי שלך.
טיפ: הכינו תערובת transfection גדול על ידי הכפלת נפח לעיל במספר כתבים, מספר משכפל ומספר miRNAs להיבדק. בעת חישוב כמות לערבב transfection להכין, הקפד לכלול כמות קטנה נוספת כדי להסביר pipetting שגיאות אידוי.
- אפשר תערובת Duo DharmaFECT כדי לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- אחרי 5 דקות, להוסיף 10μL של התערובת Duo DharmaFECT (תערובת 2) אל צינור אחד מוכן של 10uL פלסמיד ו / או מירנה (תערובת 1). צינור כל כך צריך להכיל נפח של 20μL לכל transfection לשכפל.
- דגירה כל התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- אחרי 20 דקות, להוסיף 80 μL של טרום חימם (37 ° C), ללא אנטיביוטיקה, התקשורת מלאה לכל לשכפל את הצינור בכל עבור סכום כולל של 100μL לכל transfection לשכפל. לחסום עמוק גם יכול לשמש להכנת רבים משכפל דגימות בעת ובעונה אחת. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- הסר את צלחת seeded מן החממה. ודא כי התאים הם לפחות 80% ומחוברות.
- בזהירות pipet את התקשורת היטב כל אחד.
- הוסף 100μL של התערובת transfection (20uL DNA / מגיב לערבב + 80uL התקשורת) זה טוב.
- מניחים צלחת בתוך אינקובטור לילה.
אל מעל דגירה. רוב מחקה יהיה לייצר תוצאות משמעותיות על מטרות בתום לב תוך 24 שעות. הרמה של דיכוי למדידה ב 48 שעות עשוי להיות גדול יותר, אבל כך גם משונות יהיה טוב.
מחקים ניסויים קל יותר מאשר ניסויים מעכב. בעוד שרוב מחקה באופן משמעותי להדחיק מטרות נכון בתוך 24 שעות, משמעותי דה דיכוי המיוחס מעכב יכול לקחת 48 שעות כדי להיות מדידים תהיה כמעט תמיד בולטת פחות השפעה של לחקות.
יום 3
הערה: מבחני בלוציפראז יכול להתנהל באופן מיידי או צלחות עשוי להיות קפוא ב -80 ° C (קפוא בדרך כלל מגביר תמוגה התא האות בלוציפראז). להקפיא ולהפשיר תאים לפני assaying לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
זכור לתת קפוא להפשיר תאים לטמפרטורת החדר לפני הוספת מגיב LightSwitch Assay.
5. מדד פעילות בלוציפראז עם LightSwitch AssayReagents
- הסר את צלחת מן החממה ומביאים לטמפרטורת החדר.
- הכן ריאגנטים LightSwitch Assay (עבור ערכת LS010, פרוטוקולים של גדלים ערכת אחרים ניתן למצוא באינטרנט):
- התשתית מחדש 100x ידי הוספת 100μL המצע מרכך את הצינור של המצע Assay lyophilized. הגנה מן האור לצמצם את זמן בטמפרטורת החדר. התשתית 100x עשוי להיות מאוחסן על 20C-2-3weeks. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להשתמש מחדש מצע טרי.
- הכן פתרון Assay על ידי הפשרת בקבוק 10 מ"ל של הצפת Assay באמבט מים בטמפרטורת החדר ולהוסיף 100μL המצע 100x מחדש לפני השימוש. מערבבים היטב.
- השתמש pipettor מרובת ערוצים להוסיף 100μL פתרון LightSwitch Assay (חיץ + המצע) ישירות מדגם זה טוב (המכיל תאים 100uL + מדיה) בצלחת 96-טוב לבן. אם התאים גדלו צלחת או פורמט אחר בקבוק, העברת דגימות אל צלחת 96-טוב לבן הנפח הכולל 100μL (מדיה או PBS).
- מכסים בצלחת, להגן מפני אור, דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Assaying אם אחד או יותר של הצלחת, להתנודד תוספת של פתרון assay כך כל צלחת דוגר במשך 30 דקות לפני הקריאה.
- קראו היטב עבור כל 2 שניות לומי צלחתnometer (SpectraMax L או שווה ערך).
- חשב את מציאה על ידי חישוב יחס אות בלוציפראז לבנות עבור כל אחד עבור מירנה ספציפי על השליטה הלא מיקוד (הארה = מירנה ספציפי / אי - מיקוד שליטה). השתמש נתוני משק בית, אקראי, ובונה ריק כדי לשלוט על ההשפעות הלא UTR טיפול ספציפי.
נציג תוצאות
מטרות 3'UTR בנוכחות מירנה מיקוד להראות מציאה בלוציפראז.
מציאה של פעילות 3'UTR-בלוציפראז הכתב על ידי 7a-לתת נמדדה HT1080 תאים על ידי שיתוף transfecting 100ng של הכתב כל לבנות עם שליטה 20nm לחקות או לא לתת מיקוד, 7 א, דוגרים במשך 24 שעות, ולאחר מכן לקרוא את כתב זורח האות באמצעות ריאגנטים LightSwitch Assay בלוציפראז.
באיור 1. PUNC ו ARID3B 3'UTRs האדם הם מטרות של microRNA בואו-7 א. אותות מן הכתבים 3'UTR אנושי עבור PUNC וגנים ARID3B הם דפקו משמעותית מטה בנוכחות microRNA בואו-7 א לחקות ואילו אותות עבור משק הבית ועל רצף אקראי UTRs לא.
Discussion
יצרנו אוסף גנום רחב של טרום משובטים 3'UTR-הכתב בונה האדם כדי לאפשר מחקרים של מירנה-3'UTR אינטראקציות בתאים חיים. הנה הראינו שיטה לשעתקו תפוקה גבוהה עבור שיתוף transfecting מחקה מירנה עם 3'UTR-לכתבים באמצעות מערכת הכתב בלוציפראז.
שיטה זו מסתמכת על החוקרים באמצעות קו הפערים transfectable התא מביך פעילות מירנה עם טכניקה overexpression. חוקרים באמצעות שורות תאים גרוע-transfectable לשקול שימוש lentiviral לוויה שלנו 3'UTR-הכתב אוסף שנוצר בשיתוף עם סיגמא (Mission 3'UTR Lenti GoClones). טיפול בתאי עם מירנה מחקה תוצאות הניסוי overexpression סוג, ועם כל מחקר כזה, החוקרים חייבים לקחת בחשבון כי זה יכול או לא יכול לייצג מצבים פיזיולוגיים בפועל. כדי לענות על חששות overexpression, חוקרים יכולים להשתמש מעכבי מירנה בנוסף מחקה ללמוד את האינטראקציה עם שני סוגים שונים של ההפרעות 12-14.
לאחר מטרות מירנה סביר מזוהים, החוקרים עשויים לרצות mutagenize האתרים מירנה המשוערת מחייב לקבוע אם האתרים נחוצים האינטראקציה תפקודית. הם יכולים גם רוצה בהיקף של עד מאות בדיקות שונות UTRs היעד הפוטנציאלי (Boutz). בנוסף, אם החוקרים מעוניינים בשאלה האם מירנה משפיע יציבות תמליל או יעילות התרגום, נתונים הכתב בלוציפראז ניתן להשוות מדדים של מצב יציב ברמות התמליל. כל שינוי אות בלוציפראז שלא קשורה לשינוי יחסי ברמות תמליל יצביע על השפעה על יעילות התרגום. לבסוף, החוקרים עשויים להשתמש וקטורים כתב ליצור עקומת התגובה מנה להשוות את הרגישות היחסית של UTRs שונות שינויים בריכוז מירנה 14.
Disclosures
הכותבים הם עובדי Genomics switchgear שעושים כלים ריאגנטים המופיעים במאמר זה. הפקה של מאמר זה מומן על ידי Genomics switchgear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) | VWR international | 82050-736 | |
| Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid | VWR international | 353072 | |
| LightSwitch Luciferase Assay Reagent |  SwitchGear |
LS010 | |
| DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) | Dharmacon | T-2010-02 | |
| Foil Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T592100 | |
| Breathable Plate Sealing Tape | E&K Scientific | T896100-S | |
| Plate Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L |
References
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale. Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).
- Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).
- Baek, D., Villen, J., Shin, C. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance. PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Lall, S., Krek, A., Chen, K. A genome-wide map of conserved microRNA targets in. 16, 460-471 (2006).
- Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122. J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433, 769-773 (2005).
- Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).
- Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA. 10, 544-5450 (2004).
- Liao, J. M., Lu, H. Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p. J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).
