Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l'électrophysiologie et d'imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d'étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l'aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.
Abstract
Les stimuli visuels sont détectés et transporté sur une large plage dynamique des intensités de lumière et les variations de fréquence par des neurones spécialisés dans la rétine des vertébrés. Deux classes de neurones rétiniens, les photorécepteurs et les cellules bipolaires, accomplir ceci en utilisant un ruban de type zones actives, qui permettent la libération des neurotransmetteurs soutenue et à haut débit sur de longues périodes. SUR-type mixte bipolaire cellule (Mo) de terminaux dans la rétine des poissons rouges, qui dépolarise à des stimuli lumineux et recevoir tige mixtes et l'entrée des photorécepteurs cônes, sont appropriés pour l'étude de ruban de type synapses tant en raison de leur grande taille (~ 10-12 um de diamètre) et à leurs nombreuses latéraux et réciproque connexions synaptiques avec les dendrites des cellules amacrines. L'accès direct aux terminaux Mb cellule bipolaire en tranches le poisson rouge de la rétine avec la technique de patch-clamp permet la mesure de Ca 2 + présynaptiques courants, les changements de capacitance de membrane, et la rétro-inhibition réciproque synaptique médiée par le GABA <sub> A et récepteurs GABA C exprimée sur les bornes. Présynaptiques mesures capacitance membranaire de l'exocytose permettent d'étudier la plasticité à court terme de la libération des neurotransmetteurs excitateurs 14,15. De plus, la plasticité à court terme et à long terme de la libération du neurotransmetteur inhibiteur des cellules amacrines peut aussi être étudiée par les enregistrements de la rétro-inhibition réciproque arrivant au terminal Mb 21. Plus de courtes périodes de temps (par exemple, ~ 10 s), la rétro-inhibition GABAergique réciproque de cellules amacrines subit double choc de dépression à travers l'épuisement des vésicules piscine GABA 11. La dynamique de microcircuits synaptique rétinienne dans la couche plexiforme interne de la rétine peut donc être étudiées directement.
La technique du cerveau-tranche a été introduit plus de 40 ans mais est encore très utile pour les enquêtes sur les propriétés électriques des neurones, à la fois au corps cellulaire unique, simple ou dendrite axone, et microcircuit niveau synaptique 19. Les tissus qui sont trop petits pour être collé directement sur la chambre de tranchage sont souvent les premiers embarqués dans l'agar (ou placé sur un papier filtre), puis en tranches 20, 23, 18, 9. Dans cette vidéo, nous employons la technique agar pré-enrobage en utilisant la rétine des poissons rouges. Certaines des bornes géantes cellules bipolaires dans nos tranches de la rétine poissons rouges sont axotomisés (axone-cut) pendant la procédure de découpage. Cela nous permet d'isoler seule terminaison nerveuse présynaptique entrées, parce que l'enregistrement à partir de terminaux axotomisés exclut les signaux à partir du compartiment soma-dendritique. Alternativement, on peut également enregistrer à partir intactes les cellules bipolaires Mb, en enregistrant à partir de terminaux attachés à axones qui n'ont pas été coupés lors de la procédure de trancher. Globalement, l'utilisation de ce protocole expérimental d'aide dans les études de la physiologie synaptique rétinienne, microcircuit analyse fonctionnelle, et la transmission synaptique dans les synapses de ruban.
Protocol
1. Solutions internes et externes
- Préparer la solution de tranchage (calcium) de solution mère 10x et ajouter MgCl 2, CaCl 2, et le D-glucose quotidien. La solution finale se compose de 1x (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, 3,2 MgCl 2, CaCl 2 0,25, 12 D-glucose, 0,2 acide L-ascorbique, 12 HEPES. Régler le pH à 7.4 (avec NaOH), et ajuster l'osmolarité de 260 mOsm (en utilisant H 2 O et de la solution stock de 10x).
- Peser 3% à faible température gélifiant agar (Agarose de type VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) et mélanger avec le tranchage solution. Chauffer la solution d'agar contenant dans un micro-ondes pendant 1-2 min, ou jusqu'à ce qu'elle se dissout complètement, et incuber la gélose dans un bain-marie (30-33 ° C) afin d'éviter la solidification rapide (température de transition gel: 26 ± 2 ° C).
- Préparer une solution d'enregistrement (calcium normal) de solution mère 10x et ajouter MgCl 2, CaCl 2, et le D-glucose quotidien. La solution finale cohé 1xts d'(en mM): NaCl 100, KCl 2,5, MgCl 2 1, 25 NaHCO3, 0,2 acide L-ascorbique, 2,5 CaCl2, 12 D-glucose. Après bouillonnement de la solution dans 95% de CO O 2 / 5% 2 (carbogène) pendant 5-10 minutes, régler le pH à 7.4 (avec NaOH), et ajuster l'osmolarité de 260 mOsm (en utilisant H 2 O et de la solution stock de 10x).
- Des aliquotes (1 ml chacune) de solutions de pipette internes sont préparés à l'avance et stockés dans un congélateur (-20 ° C). Deux solutions pipette internes sont typiquement utilisés pour isoler des courants bipolaires calcium cellulaire (en mM):
- 40 CsCl, 60 Cs-gluconate, 10 tétraéthylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, une Na-GTP, et 2 EGTA. Ajuster le pH à 7.2 (avec CsOH) et l'osmolarité fixé à 250 mOsm. Cette solution de chlorure interne élevée fournit généralement plus faible résistance série d'enregistrements (de meilleures conditions de voltage clamp) et les grands courants postsynaptiques inhibiteurs (CPSI) à un potentiel de repos membranaire des cellules bipolaires de -60 mV.
- 95 Cs-gluconate, une0 TEA-Cl, HEPES 25, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, et 0,5 EGTA. Ajuster le pH à 7.2 (avec CsOH), et définissez l'osmolarité de 250 mOsm 22. Cette faible EGTA internes solution entraîne généralement une hausse des modifications capacitance membranaire induite par dépolarisation des impulsions étape et permet donc des études d'épuisement du gisement de vésicules et à court terme de dépression.
2. Électrodes pipette de patch-clamp
- Préparer à paroi épaisse (1,5 mm de diamètre extérieur) en verre borosilicate (1B150F-4; Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride) et tirez les pipettes de patch aide d'un extracteur vertical (Narishige, PP830, Tokyo, Japon). Ouvrez résistances pipette à pointe patch dans les solutions d'enregistrement sont 7-8 MQ lorsque la pipette est remplie avec pipette solution interne n ° 1.
- Manteau du patch-pipette uniformément, de la pointe au niveau de l'arbre qui atteint le porte-pipette, avec de la cire dentaire (Cavex, West Chester, PA). Cela permettrait de minimiser la capacité de pipette et le bruit électrique et permettre auxplus précis et à faible bruit mesures de capacité. Une capacité de la pipette à faible contribue également à la compensation électronique C-rapide (fast capacité) de la CBE-9 (ou EPC-10) amplificateur de patch-clamp.
3. Préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes
- Sélectionnez un poisson rouge (Carassius auratus; 8-16 cm) et placer dans un seau couvert dans une pièce sombre pendant 30 min d'adaptation à l'obscurité. Après l'anesthésie, euthanasier les poissons rouges sous sédation par décapitation rapide et double-jonchage de la moelle épinière et le tronc cérébral. Retirez ensuite les yeux avec la pointe recourbée-ciseaux et incurvée pointe pincettes. Ces procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Oregon Health & Science University.
- Hemisect chaque œil en coupant uniformément autour de la surface de l'œil avec des ciseaux à ressort (15003-08, Outils Fine Science, de lancer coupé en perforant avec des conseils en ciseaux), et placer les œilletons en solution tranche glacée (pauvre en calcium). Si necessary, retirez l'objectif avec des pincettes (l'objectif sera généralement détacher avec l'avant de l'œil). Retirez la rétine avec l'épithélium pigmentaire attachés en utilisant une paire de pinces à 45 ° pointe est inclinée et fine (11251-35, Outils Fine Science) pour éplucher la rétine loin de l'œilleton, progresse lentement autour de la 360 °. Sever ou couper le nerf optique soit avec une pince fine ou des ciseaux à ressort. Retirez délicatement la rétine avec une combinaison de pince angulaire pointe fine et aspiration appliquée à partir d'une pipette Pasteur ou modifiés pipette de transfert (grand bout). Utilisez une pince coudée à pointe fine pour enlever le reste de l'épithélium pigmentaire de la rétine attachée. La surface de la rétine nettoyé et sain devrait apparaître sombre, lisse et de couleur rouge. Pour le retrait complet de toutes les cellules sombres épithélium pigmentaire sombre adaptation de la rétine pendant 1 heure (8, 1992).
- Traiter la rétine isolée avec ~ 0,03% (poids / volume; ~ 0,36 mg / mL dans une solution 1x tranche) hyaluronidase (3; H6254, Sigma) pendant 15-30 min à température ambiantela température (20-23 ° C) pour éliminer les corps vitré. Pendant cette incubation, vous pouvez préparer la solution tranche glacée.
- Coupez un morceau rectangulaire de la rétine (~ 2x2 mm, contenant toute l'épaisseur de la rétine) en enlevant les arêtes courbes avec un petit segment de lame de rasoir (Personna, à double tranchant, nettoyé avec de l'éthanol 70% et H 2 O) attachés à le corps d'une seringue en plastique de 1 ml, et le transfert de la pièce de la rétine à un petit récipient rempli d'une solution d'agar (préparé dans (1.2)). Essayez de minimiser la quantité de solution autour de la rétine comme il est placé dans la gélose liquide. Plongez directement dans la solution tranche glacée (préparé dans (3.3)) pour solidifier la gélose 20, 18, 9. Nous utilisons un petit récipient à la main. En bref, un petit tube cylindrique (Fisherbrand, flacons de polyéthylène de 2,5 ml, 03-338-1B) a été coupé aux deux extrémités et scellés avec du Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging) des correctifs.
- Couper le bloc de gélose solide dans un 1x1x1 cm cube contenant la pièce rectangulaire de la rétine.
- Transfert du bloc dans la chambre de tranche et colle à la surface de la plaque de tranchage. La chambre de tranche est pré-refroidi dans un congélateur (-20 ° C). Couper le bloc en tranches épaisses de 200 à 250 um en utilisant une trancheuse Vibratome (VT1000S ou VT 1200S, Leica) dans une solution glacée tranche. Un total de 5 à 10 tranches peuvent être obtenus, qui sont viables pendant environ 5 à 6 heures.
- Transfert l'une des tranches de la chambre d'enregistrement. Placer une grille de fils de nylon collé à un cadre en platine en forme de U 19 sur le dessus de la tranche, et perfuser en continu (taux de 1-2 ml par minute) avec une solution d'enregistrement à barboter avec 95% d'O 2 / 5% de CO 2 (carbogène ).
Dépannage:
Si la pièce rétine intégrés dans le bloc d'agar est détaché ou sort de l'agar-agar pendant le tranchage, on peut augmenter l'épaisseur de coupe de 200 um à 300 um par incréments de 20 um. Aussi essayer de minimiser la quantité de solution autour de la rétine comme il est transféré et placé dans la gélose liquide en aspirant la solution supplémentaire avec une pointe de roulés "Kimwipe« papier. Une autre façon d'éviter ce problème est de réduire la taille de pièce de la rétine initialement placés dans la gélose. Parce que l'humeur vitrée interdit agar de tirer pleinement attachés à la pièce de la rétine, il peut être nécessaire de faire la hyaluronidase frais ou d'ajuster le temps d'incubation (étape (3.3)).
4. Identification des cellules bipolaires du terminal synaptique dans une tranche rétiniennes
- Position de la tranche la rétine sous le microscope autoporteurs (par exemple BX51WI, Olympus). Nous considérons la tranche la rétine avec l'infrarouge contraste d'interférence différentielle (IR-DIC) optique 60x de l'eau à travers un objectif à immersion (NA 0,90, Olympus) et une caméra CCD (XC-75, Sony). La sortie de la caméra CCD est envoyé à un contrôleur de la caméra (C2400, Hamamatsu) pour l'amélioration de contraste avant la visualisation sur un analogue de Sony 13 "black et blanc moniteur. Le microscope est monté sur une platine de translation XY, et la chambre d'enregistrement est placé sur une scène fixe 14.
- Trouver soit intact et axotomisés (axone-cut) bornes de la cellule bipolaire, qui peuvent être identifiés par leur taille, leur forme et de position dans la tranche (figure 1). Terminaux axotomisés et intact peut également être distingués par l'examen de leur temps de décroissance capacitif transitoire actuelle (simple ou double exponentielle se désintègre-exponentielle, respectivement) et les courants Ca 2 + (figure 2; 12, 14, 15). Terminaux Mo sont situés dans la couche la plus proximale de sublamina B (sur couche de type; adjacente à la couche de cellules ganglionnaires) dans la couche plexiforme interne de la rétine des poissons rouges. Bornes Mo, avec leur surface mate et d'aspect plat, peut être facilement distinguée de ganglion et déplacées soma amacrines, qui apparaissent phase lumineux et sphérique. Par ailleurs, le bord de terminaux Mo est recouvert d'une grandela densité des contacts synaptiques, et apparaît rugueuse et irrégulière par rapport à la surface lisse et propre de ganglion et les cellules amacrines (figure 1a-c). Axotomisés terminaux Mb apparaissent circulaires rondes et près (figure 1c), tandis que les terminaux apparaissent intactes elliptique et tendue, souvent avec un bout pincé pointant vers la couche nucléaire interne de la rétine (figure 1a, b).
- Bornes endommagées ou insalubres regardent souvent gonflé et l'affichage de plusieurs petites structures granulaires sur la surface. Il peut être possible d'obtenir une étanchéité GQ sur ces bornes, mais ils sont susceptibles de se rompre peu après effraction. D'autres signes de terminaux malsaine comprennent un creux apparence, de contraste et / ou la luminosité identique à la tranche environnante, et parfois l'emplacement à la surface de la tranche. Il est possible d'enregistrer à la fois à partir de terminaux saine profonde dans la tranche (avantage: plus intact circuits synaptiques) et aussi près de la surface de la tranche (advantage: un accès plus rapide aux médicaments perfusés dans la solution externe, plus facile à sceller).
5. Enregistrements électrophysiologiques et d'imagerie de Ca 2 +
- En utilisant une seringue avec un embout filtre de 0,2 um (Nalgene), remplir la pipette de patch en verre avec une solution interne à un niveau 1-2 centimètres à l'arrière de la pipette. Après avoir enlevé les bulles d'air de la pointe, sécuriser la pipette dans le support, appliquer une pression positive (1.2 à 1.6 psi), et déplacez-le vers le terminal ciblé à l'aide d'un micromanipulateur (MPC-200, instrument Sutter). Tout en se déplaçant du bout vers le bas par la tranche, déplacez la pipette dans une direction latérale de balayage pour assurer que la tranche n'est pas tiré le long avec la pointe.
- Placez l'extrémité de la pipette dans le terminal pour nettoyer la surface de la membrane. Poussez la pointe vers le bas sur le bord de la borne à créer une fossette (tiret), et la libération de la pression positive. Si un joint GQ ne forme pas immédiatement, appliquer une légère pression négative. Après un joint GQ, basculez vers le mode d'enregistrement sur les cellules de l'amplificateur pince EPC-9 patch et changer le potentiel de maintien à -60 ou -70 mV. Appliquer le C-rapide (fast-capacité) de correction, attendre que le joint se stabiliser entre GQ 5-10, puis la rupture de la membrane avec de fortes, une aspiration douce appliquée par la bouche à établir la configuration de l'enregistrement de cellule entière. Si la configuration cellule entière a été correctement établi, la résistance série sera entre 14 à 30 MQ. Résistance d'entrée sera de 200 à 500 MQ pour les terminaux intact et GQ 1-3 pour terminaux axotomisés 14.
- Observez le transitoire courant capacitif (Figure 2a et 2c), de distinguer entre intact et axotomisés bornes de la cellule bipolaire. Intact et terminaux Mb axotomisés ont une capacité de membrane de base des 9-16 pF et 3-8 pF, respectivement.
- Appliquer une durée de 200 ms voltage-clamp étape de -70 à 0 mV à un terminal axotomisés Mb. Cela permettra auxla mesure directe des grands (~ 200-600 pA), isolés étrangers Ca 2 + courants activés par l'ouverture de voltage-dépendants de type L canaux Ca 2 + (figure 2b). En parallèle, on est capable de surveiller le saut de capacité provoquée par l'exocytose des vésicules synaptiques, et le rapide, le pH-inhibition de Ca 2 + courant qui suit l'exocytose 15, et la rétro-inhibition GABAergique réciproques (figure 3C; 22). Si l'un des correctifs d'un terminal intacte Mb cellule bipolaire, le résultat sera comme dans la figure 2c et 2d. Aucun discernable courants Ca 2 + sont observées en raison de la grande «fuite» des courants en raison de l'écart-jonction de couplage dans les dendrites des cellules bipolaires Mb 1.
- Changements de capacitance membranaire peut être évoquée par une dépolarisation pas du potentiel de maintien de -70 mV à 0 mV en utilisant le "sine + DC" méthode de résolution dans le temps les mesures de capacité membrane 6. Sauts capacitance membranaire indiquer la fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique. A 2 kHz sinusoïdale voltage-clamp commande (30 mV crête à crête) a été ajoutée au potentiel de maintien de -70 mV. Le courant d'enregistrement a été analysée sous deux angles de phase orthogonales par l'EPC-9 de patch-clamp émulation logicielle d'un amplificateur amplificateur lock-in (Heka, Lambrecht, Allemagne). Dans le terminal intact de la figure 2d, une fréquence élevée (2 kHz) confine relance sinusoïdale de la capacitance membranaire qui est analysé pour les terminaisons axonales terminale et qui ont une capacité CM de base ~ 6,8 pF. La membrane du corps cellulaire et les dendrites de la cellule bipolaire sont ainsi filtrés par la fréquence élevée voltage-clamp sinusoïde 13.
- Pour Ca 2 +-imagerie expériences, bien mélanger la solution patch interne pipette avec une Ca 2 + sensibles au colorant fluorescent (par exemple Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 uM; O-6806, Invitrogen)) et de répéter le protocole de 50,1 à 5,5. Cela permettra de combiner l'imagerie par fluorescence et à l'enregistrement électrophysiologiques. Par exemple, il est possible de l'image de la Ca 2 + transitoires associées à une étape de 200 ms de -70 à 0 mV dans les appendices telodendria du terminal du Mb (figure 3a, b). Nous avons intégré notre microscope droit Olympus avec un système de disque laser microscope confocal à filer (CSU-X1, Yokogawa). Le microscope confocal utilise 488 nm et 561 nm laser lignes qui sont modulés par un filtre acousto-optique accordable. Les données sont acquises à l'aide du logiciel Slidebook (3i; Intelligent instruments d'imagerie). Pour plus de détails sur les techniques d'imagerie calcique utilisant des neurones rétiniens goldfish voir 24, 17, 3.
Dépannage:
Si on omet souvent d'établir une configuration de cellule entière, même après la formation d'un joint stables GQ, il peut être utile pour réduire la pression négative utilisé pour perforer le terminal membrane. Il peut également être le cas que la pression d'aspiration optimale pour la création de cellules entières de configuration varie en fonction de la courbure membranaire (soma> terminal). Il est également possible d'utiliser un protocole zap (amplitude: 400 mV, Durée: 100 us) pour entrer dans la configuration cellule entière, que ce soit seul ou en combinaison avec une impulsion forte de la pression négative. Nous avons trouvé le protocole zap pour être particulièrement utile pour le rodage lors de l'utilisation d'une pipette avec une résistance de bain de plus de 12 MQ.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. Identification des bornes Mb cellule bipolaire en tranches le poisson rouge de la rétine. (Ca) IR-DIC images de terminaux Mb cellule bipolaire. Nous pouvons identifier les terminaux susceptible axotomisés (axone-coupe) et intacte dans l'image IR-DIC. Un terminal axotomisés apparaît ronde et circulaire, comme indiqué dans ctout un terminal intacte est plus susceptible d'apparaître elliptique, comme le montre a et b. Cette classification peut être confirmée par la mesure de capacitance transitoire (voir Figure 2) ou par la méthode de teinture de remplissage (D - F). Les flèches rouges indiquaient l'emplacement de l'intersection entre l'axone et terminaison axonale pour les terminaux intact dans a et b. Pointillés rouges indique le contour de terminaux Mb cellule bipolaire. (Df). Images de fluorescence des terminaux Mb cellule bipolaire avec un axone intact (d), un axone partiellement coupé (e), ou un entièrement enlevé axone (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) colorant fluorescent a été rempli avec une solution interne avant l'enregistrement. Immédiatement après patch-clamp, la tranche la rétine a été transféré dans 4% (poids / volume) de paraformaldéhyde (P6148, Sigma) dans une solution tampon phosphate (70 013, GIBCO) et incubées pendant 30min. Les tranches ont été montés sur des lames Superfrost (Fisher Scientific) en milieu de montage aqueux avec des agents anti-décoloration (Biomeda corp). Alexa 555 Mo contenant les terminaux cellulaires bipolaires ont été considérés avec une ligne de 555 nm laser (rouge) en utilisant une eau de 40x objectif à immersion sur un confocale à balayage laser microscope (LSM 710, objectif Carl Zeiss). Notez la présence d'appendices telodendria petite saillie à partir des terminaisons axonales (flèches bleues). La barre d'échelle indiquent 10 um (a - f). INL: couche intérieure nucléaire, IPL: inner couche plexiforme, GCL: couche des cellules ganglionnaires.
Figure 2. Propriétés électriques des bornes Mb axotomisés et intact de cellules bipolaires. (A, c) la réponse transitoire courant activé par une hyperpolarisation étape voltage-clamp de la potentiel de maintien de -60 mV à -70 mV. La réponse à un courant de court -10 mV voltage-clamp étapepeut se traduire par: 1) une seule vitesse de décroissance exponentielle actuelle de la résistance d'entrée élevée à -70 mV (à titre indicatif d'un terminal axotomisés; panneau a), ou 2) une décroissance exponentielle avec double résistance d'entrée basse à -70 mV (indicatif de un terminal intact; panneau de c; voir aussi 12, 14, 15). (B, d) les courants Ca 2 + et des sauts capacitance membranaire ont été évoqués par une dépolarisation étape de -70 à 0 mV. Résolue dans le temps les mesures de capacité de membrane utiliser une relance de 2 kHz sinusoïdale superposée sur le potentiel de repos de la tenue -70 mV 6. La trace rouge est la valeur moyenne des données de la capacité des points. Notez que le saut de capacité dans la figure 2B et 2D sont toutes deux égales à environ 200 FF.
Figure 3. Les mesures directes de Ca 2 + signaux d'imagerie, l'exocytose, et la rétroaction inhibitrice dans un Mterminale b cellule bipolaire. (A) Une élévation transitoire de la concentration de Ca2 + dans le telodendria d'un terminal Mo a été activée par une dépolarisation étape voltage-clamp de -70 à 0 mV pour 200 ms (flèche). Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 M), un indicateur de Ca 2 + colorant, a été inclus dans la pipette de patch. (B) image correspondante de fluorescence de la telodendria Mo (région d'intérêt indiqué par la ligne pointillée rouge). (C) à court terme de la dépression synaptique libération des neurotransmetteurs (exocytose). Capacité de Ca 2 + courants (au milieu de traces) et de la membrane (trace inférieure) évoquée par une paire de dépolarisations 20 ms à 0 mV (trace supérieure; 200 ms entre les impulsions d'intervalle). La flèche indique l'effet de protons exocytosed sur le Ca 2 + et l'inhibition GABAergique réactions réciproques des pays voisins cellules amacrines 15, 21. Notez que l'inhibition médiée par des protons de l'actuelle Ca 2 + et aussi le GABAergic rétroinhibition réciproques ne sont présents que dans la première réponse de dépolarisation, qui a également un saut de capacité due à l'exocytose des vésicules synaptiques.
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Discussion
Une étape cruciale et difficile dans notre protocole est le transfert de la pièce de la rétine dans la solution d'agar (protocole 3.4). Il est nécessaire de retirer délicatement le corps vitré et la solution tranche résiduelle de la pièce de la rétine et le transférer sans distorsion ou de flexion. Afin d'accomplir cela, nous utilisons une petite spatule (21-401-25B, Fisherbrand) avec une pointe recourbée pour former une angle de 90 °, avec une pince la pointe inclinée (11251-35, Outils Fine Science), à la position de la rétine pièce tout au long du processus de transfert dans une solution de tranche. Solution tranche résiduelle sur la tranche de la rétine et une spatule peut être retiré par une surveillance attentive de la surface en tamponnant avec le coin d'une Kimwipes plié ou roulé (Kimberly-Clark).
Une autre manière courante de se préparer transversale tranches rétine est le protocole de filtrage à base de papier 23. En bref, une pièce inversée de la rétine entière est attachée à un morceau rectangle de filtre Millipore disque (cellules ganglionnaires jeterer contre le papier filtre, la couche des photorécepteurs vers le haut) et les couper en tranches épaisses 250 um avec un manuel vertical "pouce" trancheuse (par exemple Narishige ST-20). Nous constatons que les avantages de la filtration sur papier protocole comprennent sain photorécepteurs et un ratio d'augmentation de axotomisés aux bornes Mb intacte. Nous avons donc utiliser cette méthode du papier filtre pour obtenir des réponses lumière évoquée à partir de terminaux embarqués Mb seule en tranches de la rétine.
Les avantages de notre agar-protocole basé sur le filtre à base de papier protocole sont que 1) la tranche de la rétine produite est plat, même, et relativement en bon état avec une séparation claire entre les couches de la rétine, ce qui permet à patcher dans tous les couche nucléaire interne ou plexiformes couche de la rétine cellule qui est désiré, et 2) après l'enregistrement électrophysiologiques immunohistochimie est réalisée plus facilement raison de la géométrie plane intact et de la tranche et les facteurs mentionnés à l'article (1) ci-dessus. Un protocole pour l'enregistrement de réponse à la lumières des neurones rétiniens dans une préparation à base de gélose a été publié dans JoVE 2. Une préparation de tranches horizontales rétiniennes qui a utilisé une combinaison d'agar-agar et les techniques du papier filtre a également été publié antérieurement dans JoVE 5. Nous recommandons à regarder ces vidéos en combinaison avec notre propre pour comparer les différentes techniques.
L'accès direct à un ruban de type terminaux présynaptiques dans les vertébrés tranches rétinienne nous permet d'étudier la transmission synaptique au ruban de type zones actives. Elle nous permet également d'étudier directement la physiologie synaptique dans des microcircuits de la rétine. Cette technique sera particulièrement utile pour les enregistrements appariés de signaux pré-et post-synaptique, notamment avec des partenaires postsynaptiques inhibiteurs cellules amacrines et les cellules ganglionnaires de dopage 1, 16, 10. Enregistrements appariés à un ruban de type synapses entre le rat cochléaire cellules ciliées internes et des dendrites afférentes sont possibles et ont été décrites par 7. Calcium imaginationng de terminaux Mb la cellule bipolaire a été réalisée en acuité cellules dissociées 8 et 17 en tranches rétine, ainsi que dans les cellules amacrines poissons rouges 3. Des études récentes ont montré de grandes améliorations pour les in vivo et in vitro dans les approches optogénétique chez le poisson zèbre transgénique rétine 4. Les orientations futures seront probablement impliquer ces techniques transgéniques, avec des méthodes électrophysiologiques, qui va nous permettre de combler le fossé entre les enregistrements dans les tranches in vitro et in vivo d'imagerie, menant finalement à des études comportementales.
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Disclosures
Nous n'avons pas d'intérêts opposés à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Fred Rieke pour son explication sorte de l'agar-embedded préparation de tranches rétine lorsque nous avons commencé en utilisant le protocole dans notre laboratoire. Nous remercions aussi Lori Vaskalis pour l'illustration de schéma aperçu, et les Drs. Veeramuthu Balakrishnan et Soyoun Cho pour leurs précieux commentaires sur le texte et la vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH RO1 IEN-, et a également été partiellement financé par une subvention Korea Research Foundation financée par le gouvernement coréen [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
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