Summary
Nous décrivons une méthode pour objet des cellules adhérentes à la contrainte de cisaillement à flux laminaire dans un circuit à débit continu stérile. L'adhérence des cellules, la morphologie peut être étudiée à travers la chambre transparente, des échantillons obtenus à partir du circuit pour l'analyse de métabolites et cellules récoltées après une exposition de cisaillement pour les expériences futures ou la culture.
Abstract
L'objectif global de cette méthode est de décrire une technique à soumettre des cellules adhérentes aux conditions d'écoulement laminaire et d'évaluer leur réponse au cisaillement du fluide ainsi quantifiables souligne 1.
Notre conception de la chambre de flux et de circuit d'écoulement (Fig. 1) contient une zone de visualisation transparente qui permet de tester l'adhésion cellulaire et l'imagerie de la morphologie des cellules immédiatement avant l'écoulement (Fig. 11A, B), à divers moments durant l'écoulement (Fig. 11C) , et après l'écoulement (Fig. 11D). Ces expériences sont illustrées avec cordon ombilical humain dérivés du sang des cellules progénitrices endothéliales (EPC) et les porcins EPC 2,3.
Cette méthode est également applicable à d'autres types de cellules adhérentes, par exemple, les cellules musculaires lisses (SMC) ou des fibroblastes.
La chambre et toutes les parties du circuit sont facilement stérilisées à l'autoclave à vapeur. Contrairement à d'autreschambres, p.ex. chambres microfluidiques, un grand nombre de cellules (> 1 million en fonction de la taille des cellules) peuvent être récupérés après l'expérience de flux dans des conditions stériles pour culture cellulaire ou d'autres expériences, par exemple, l'ADN ou l'extraction d'ARN, ou immunohistochimie (fig. 11E), ou le balayage 5 microscopie électronique. La contrainte de cisaillement peut être ajustée en faisant varier le débit de la perfusion, la viscosité du fluide, ou la hauteur et la largeur de canal. Celui-ci peut réduire le volume de fluide ou de besoins tout en assurant que la cellule unidimensionnelle d'écoulement est maintenu. Il n'est pas nécessaire de mesurer la hauteur entre les expériences de chambre, car la hauteur de la chambre ne dépend pas de l'utilisation de joints d'étanchéité, ce qui augmente considérablement la facilité d'expériences multiples. Par ailleurs, la conception du circuit permet facilement la collecte des échantillons de perfusat pour l'analyse et / ou la quantification des métabolites sécrétés par les cellules sous-exposition du stress de cisaillement du fluide, par exemple, l'oxyde nitrique (fig. 12) 6
Protocol
1. Endothéliales progénitrices des cellules d'isolement
- Préalablement à toute collecte de sang périphérique humain, soumettre votre protocole de recherche à votre Institutional Review Board (IRB), et après son approbation, obtenir des donateurs bénévoles «consentement éclairé (collecte du sang périphérique et de l'isolement CBE avait été approuvée par l'IRB et de l'Université Duke est en pleine conformité avec les exigences réglementaires américaines relatives à la protection des participants humains).
- Lorsque vous travaillez avec des animaux issus EPC, votre protocole de recherche approuvé par votre Animal Care institutionnel et l'utilisation comité (IACUC). Toutes nos expériences porcine avait été approuvé par le IACUC l'Université Duke et ont été menées en conformité avec les plus hautes normes de soins humanitaires.
- Pour l'isolement de cellules progénitrices endothéliales, recueillir 50 ml de sang périphérique via la technique standard de phlébotomie d'un donneur bénévole consenti dans des sacs remplis de collecte de sang avec l'anticoagulant citratee-phosphate-dextrose et de diluer la solution de 1:1 avec une solution de Hank saline tamponnée (sans CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) et couche sur des volumes égaux d'Histopaque de créer des couches bien définies.
- Centrifuger (30 min, 740 g, la mise briser basse) et de recueillir les cellules mononucléaires (MNC) (buffy coat) couche. Resuspendre et laver les multinationales x 3 avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) avec 10% sérum de veau fœtal (SVF) x 10 min, 515 g, avant l'étalement en deux plaques de 12 puits dans le milieu de croissance complète CBE (MCDB-131 moyen avec 5 ml de 200 mM de L-glutamine, 10% de FBS et EGM-2 SingleQuots) à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Lentement changement de milieu toutes les 24 heures pendant les 7 premiers jours, puis tous les autres jours. CBE colonies peuvent être identifiés après un délai moyen de 14 jours en fonction de leur morphologie pavées. Une fois EPC en ¼ de couvrir la culture de la superficie de 12 puits, développez cellules et confirmer l'identité EPC avec la cytométrie de flux par des tests pour la présence de marqueurs de surfaceCD31 et l'absence de CD14, CD45, comme décrit précédemment 6. D'autres essais qui peuvent être effectués comprennent la morphologie cellulaire et de l'étiquetage avec DII-Ac-LDL.
- Pour les expériences décrites ici, développez EPC isolés jusqu'à ce qu'ils soient presque confluentes dans 3 flacons T-75 de culture de cellules dans un milieu de CPE dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2.
2. Calcul de la contrainte de cisaillement
- Nous recommandons que ces calculs sont effectués avant la fabrication de la chambre et le canal d'avoir une compréhension approfondie des conditions qui peuvent être atteints. Calculer le débit de la perfusion dans votre circuit sur la base de cisaillement désiré souligne à être appliquée aux cellules selon l'équation 1 1,
où Q est le débit souhaité, τ est la cible de sentendez le stress agissant tangentiellement sur les cellules, w est la largeur de la chambre d'écoulement, h est la hauteur de la chambre d'écoulement, et μ est la viscosité du liquide de perfusion (fluide).
- Une valeur typique de la viscosité (μ) pour support utilisé est de 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Notez que la viscosité peuvent également être soulevées par l'aide de haut poids moléculaire du dextrane, si désiré 7. Une valeur typique de la contrainte de cisaillement cible (τ) utilisée est de 15 dynes / cm 2, (typique contrainte de cisaillement artériel) ou 100 dynes / cm 2, si supra-physiologiques du stress de cisaillement est souhaitée. Notre chambre a typiquement une largeur (w) de 1,9 cm et la hauteur (h) de l'ordre de 166 à 267 um.
3. Fabrication de la chambre de flux
- Couper les plaques supérieure et inférieure de echambre e en alliage d'aluminium 6061 de stock rectangulaires avec une dimension supérieure de 7 «dimensions et en bas de 7 x 2 x 0,25" x 0,5 x 2.
- Recess la plaque supérieure dans la partie centrale à 0,125 "de profondeur, laissant 0.950" par extrémité pour 1,375 "de largeur x 0,3125" réservoir de liquide de profondeur.
- Percer 1 / 16 "de largeur x 0,625" longues fentes du dessous afin de pénétrer dans le réservoir sur les entrées et les sorties se termine.
- A la fin de chaque plaque supérieure, percer un situé 10/32 "pistes par pouce (TPI) pour les trous en polypropylène 1 / 8" cannelé de pénétrer dans le réservoir de fluide. Sur la fin afflux, créer un plug côté avec 10/32 "TPI à travers le trou pour le polypropylène 1 / 8" cannelé.
- Taper le dessous dessus de l'afflux de liquide dans la fenêtre de visualisation en verre à 0.518 degrés pour un mélange adéquat de liquide.
- Couper une fenêtre lame de verre dans la plaque de fond en ligne avec la fenêtre de visualisation haut. L'utilisation de ciment d'aquarium, de la colle une lame de verre dans la chambre. Laisser durcir au moins 24 heures.Assurez-vous que la fenêtre de visualisation est encastré de sorte qu'un 75 x 25 x 1 mm lame de verre de microscope va affleurer dans la chambre.
- Créer un évidement pour un joint torique autour de la partie inférieure des plaques supérieure et inférieure de telle sorte qu'ils sont espacés de 0,02 ". Insérez le toriques en caoutchouc.
- Percez 10 corresponds à 8 / 32 "trous TPI dans des chambres haut et en bas pour une utilisation avec 8 / 32" vis à tête plate.
4. Débit assemblage de circuits
- Assemblez le circuit d'écoulement entière d'abord, puis procéder à sa stérilisation.
- Joindre un 36 "segment de tuyau dur à une extrémité de l'amortisseur d'impulsion (par 1 / 8"). Pour l'autre bout, attachez un 18 "segment de tuyau souple.
- Placez un 1 / 8 "adaptateur Luer mâle à la fin du 18" section tuyau souple, mentionné à l'étape 4.2. Branchez le luer mâle d'un 1 / 8 "adaptateur Luer femelle. Fixez le luer femelle à un nouveau 18" tube segment souple.
- Percer trois trous dans un plafond de 250 ml récipient en verre afin de s'adapter tube. J'ainsert une 1.5 "segment de tuyau souple (comme grille d'aération) dans un trou et les extrémités libres des tubes durs et mous à travers les deux autres trous dans le bouchon dans la bouteille en verre de 250 ml (sous forme de réservoir) (Fig. 2). Assurez-vous que le tuyau dur atteint le fond du réservoir (comme tuyau d'écoulement du réservoir).
- Stériliser les pièces ci-dessus par autoclave à vapeur à 121 ° C pendant 60 min. De plus l'autoclave une chambre de flux complète, 3 x 2 "segments de tuyaux souples, 1 mâle et 1 femelle 1 / 8" adaptateur Luer, 4 x ½ "et 6 x 5 / 16" 8 à 32 vis à tête plate, une paire de brucelles , un 75 x 25 x 1 mm lame de verre (ou autre matériau désiré surface de la cellule), et 2 serviettes chirurgicales.
- Placez des serviettes stériles dans hotte à flux laminaire. Placez le circuit d'écoulement, chambre d'écoulement, 4 x 4 voies robinets, 1 x 1 voies robinet, et toutes les pièces stérilisées à l'étape 4.5 sur ce champ stérile.
- Maintenant, utilisez des gants stériles pour relier deux robinets à 4 voies. Placez bouchons sur les ports de l'échantillon ouvert. Détacher les adaptateurs mâles et femelles Luer attacher les deux segments de tube souple du circuit d'écoulement et d'insérer les robinets raccordés (fig. 3).
- Fixez le tube souple introduit dans le réservoir pour une seringue de 30 ml et retirer le piston de la seringue. Remplir la bouteille avec 125 ml d'EPC moyenne (fig. 4).
- Placer un filtre seringue stérile dans la bouche d'aération (fig. 4).
- Déplacez le circuit d'écoulement dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Fixer le tube dur dans la tête de la pompe à rouleaux indiqué pour une utilisation avec ce type de tube (fig. 5). Assurez-vous que le tuyau ne se chevauchent pas avec les pistes de la pompe rouleau de montage. Marquer le tube où il sort la tête de pompe sur les deux côtés avec un marqueur.
- S'assurer que tous les robinets sont fermés vers les ports de l'échantillon et ouvert le long du circuit d'écoulement. Démarrer la pompe. Vérifiez la direction du flux. Le perfusat doit se déplacer enom le réservoir par le tube en verre dur dans la amortisseur d'impulsions.
5. CBE fluorescentes étiquetage
- Alors que le circuit d'écoulement se réchauffe à 37 ° C, préparer les cellules d'ensemencement sur la lame. Notez que le marquage fluorescent est nécessaire si les cellules doivent pouvoir être visualisés sur des matériaux opaques, par exemple le titane (Ti).
- Créer une solution à 1 mM de Cell Tracker Orange (CTO) en diluant 50 g de poudre avec CTO 90 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). Soyez sûr de bouclier de ce mélange d'exposition à la lumière (éteindre la lumière tout en travaillant sous hotte à flux).
- Créer une solution 2 uM de travail de CTO en diluant 36 pl de solution de stock de CTO dans 18 ml de sérum MCDB-131 moyen.
- Rincer EPC en 3 près confluentes T-75 flacons de culture cellulaire avec 10 ml DPBS (sans Ca ou Mg).
- Ajouter 6 ml de la solution 2 uM CTO de travail dans chaque flacon. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. Rincez chaque flacon x 2 avec DPBS 10 ml (sans Ca, Mg).
- Laver par centrifugation x 5 min à 600g et remettre en suspension dans 5 ml de milieu CBE.
6. Ensemencement cellulaire de diapositives avant de couler ensemble de chambre
- Une diapositive en verre, titane, ou d'autres matériaux peuvent être utilisés, et la surface de la lame peut être modifié par spin-coating avec un polymère ou en ajoutant une couche de métal. Placer la lame dans une stérile rectangulaire de quatre navires de chambre de culture de cellules (ou tissu utilisez glisser culture en fiole si la surface de polystyrène est souhaitée). Compter les cellules et les graines de 1,5 x 10 6 cellules sur la lame dans 5 ml d'EPC moyenne x 6 heures si une couche de cellules confluentes est souhaitée lors de l'initiation de flux (Fig. 11A).
- Afin de tester étalement cellulaire et l'adhérence en cisaillement des fluides, permettent de 3 x 10 6 cellules d'adhérer pour seulement 15 minutes avant le début de l'écoulement (rapide ensemencement) (
7. Ensemble de chambre de débit
- Utiliser des gants stériles, connecter un 2 "segment de tube souple pour un 1 / 8" adaptateur Luer femelle. Branchez un autre 2 "segment de tube souple pour un 1 / 8" adaptateur luer mâle.
- Fixez les deux «tubes souples avec adaptateur Luer femelle pour le port entrant. Fixez les deux« tubes doux avec Luer mâle à l'orifice de sortie. Fixer à 4 voies robinets à ces deux adaptateurs Luer. Branchez le reste, soit 2 "morceau tuyau souple pour le connecteur du port côté se détacher du piège à bulles et joignez un robinet à 1 voie (fig. 6).
- En utilisant une pince à épiler stérile, retirer la lame de cellules semées à partir du récipient de culture cellulaire (ou si vous utilisez un flacon glisser, enlever le ballon de la diapositive) et le placer dans le renfoncement sur la plaque de fond de la chambre de flux. Assurez-vous que la lame est placée avec le côté pile-semées vers le haut.
- Pipeter 10 ml de milieu CBE chaude sur la diapositive. Laisser le milieu afin de couvrir la lame et chambre d'écoulement, but ne pas renverser le support sur le joint torique sur la plaque inférieure.
- Placer la plaque supérieure de la chambre de circulation sur la plaque de fond, alignant les trous des vis. Prenez soin de ne pas introduire de bulles d'air dans la chambre lors de cette étape en gardant les deux plaques parallèles.
- Plaques à visser ensemble (une vitesse automatiques tournevis à piles jusqu'à ce processus).
- Retirer les bulles d'air du piège à bulles apport en ouvrant le robinet 1 voie fixé au port afflux côté bulles piège et délicatement rincer la tubulure avec apport moyen CBE en utilisant une seringue de 10 ml. Puis fermer ce robinet et le bouchon qu'il (fig. 7).
- Maintenant enlever les bulles d'air à partir du canal de chambre en ouvrant l'orifice de sortie 4-way robinet et en douceur de rinçage EPC dans la chambre d'écoulement, en utilisant encore une seringue de 10 ml. Si de grosses bulles restent, soulèvent la fin des sorties de la chambre à un angle de 45 ° (fig. 8).
- Cap toutes les connexions robinet à 4 voies et à proximitéuns. Déplacer la chambre de circulation dans l'incubateur avec le circuit d'écoulement assemblés (fig. 9).
- Pause de la pompe du circuit d'écoulement. Fermez les robinets du circuit d'écoulement dans la direction de l'écoulement pour empêcher la fuite et à garder l'intérieur de la chambre stérile. Transports la chambre d'écoulement de la hotte à flux d'une circulation. Connectez la chambre de circulation dans le circuit d'écoulement. Ouvrez les robinets dans le sens d'écoulement. Reprendre la pompe de débit. Assurez-vous que le perfusat flux dans la direction correcte. Régler le débit de la contrainte de cisaillement désiré.
- Pendant l'expérience de flux, la chambre d'écoulement peut être retiré du circuit à l'image des cellules par l'intermédiaire de lumière ou microscopie à fluorescence. Pour ce faire, débranchez la chambre de circulation du circuit d'écoulement au niveau des connexions robinet-robinet. Pour maintenir la stérilité de la chambre, fermer les robinets du circuit de débit et robinets chambre de circulation dans le sens d'écoulement et le bouchon tous les robinets avant de retirer le circuit d'écoulementde l'incubateur (fig. 9).
8. Collecte d'échantillons de perfusat
- Pour faciliter la collecte d'échantillons de perfusat pour l'analyse, (par exemple la synthèse d'oxyde nitrique), première pause de la pompe.
- Fermer le robinet le plus proche du amortisseur d'impulsions. Retirer son capuchon de protection et d'insérer une seringue de petite taille, par exemple, une seringue de 3 ml, dans le port de l'échantillon. Garder le capuchon et de s'assurer qu'il ne sera pas contaminé en le plaçant à l'envers.
- Fermer le robinet en direction de la chambre de flux, en gardant le port d'échantillon et circuit dans le sens de l'ouverture amortisseur d'impulsions.
- Dessinez la quantité désirée de l'échantillon, par exemple, 150 pl, du circuit. Fermez le robinet vers le port de l'échantillon avant de retirer la seringue. Conserver l'échantillon dans un flacon de perfusion étiquetée et congeler à - 80 ° C (pour la détermination de l'oxyde nitrique à un point plus tard).
- Reboucher le port d'échantillon et de s'assurer que tous les robinets sont ouverts avant de commencer débit.
9. Les résultats représentatifs
En utilisant notre méthode rapide semences, dérivés du sang humain des cellules progénitrices endothéliales peuvent être ensemencées sur des lames en titane de 15 minutes et se conformer sous physiologiques (artérielle) des forces de cisaillement de 15 dynes / cm 2.
Comme le montre la figure 10, EPC se propagent sous l'influence du flux à partir de 210 ± 11,4 um 2, immédiatement après le semis, à 657 ± 39,1 um 2 après 3 heures, et à 1152 ± 55,3 um 2 après 24 heures de la contrainte de cisaillement du fluide de 15 dynes / cm 2 (différence entre les groupes est statistiquement significative avec p <0,0001, 1-way ANOVA). Parallèlement à l'augmentation de la surface cellulaire, ce qui peut être imagée par la chambre transparente avec le microscope soit léger ou fluorescentes, la rondeur calculé selon l'équation 2 6
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diminué, passant de 878 x 10 -3 ± 5,9 x 10 -3, immédiatement après le semis, à 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 au bout de 3 heures, et à 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 après 48 heures de l'exposition au stress de cisaillement du fluide même (différence entre les groupes est de nouveau statistiquement significatives avec p <0,0001, 1-way ANOVA).
Figure 11D illustre que les PEC aligner et orienter dans le sens d'écoulement après 48 heures de la contrainte de cisaillement du fluide à 15 dynes / cm 2 par rapport à leur orientation aléatoire après une période d'ensemencement statique de 6 heures, la figure 11A.
Notre méthode permet également d'obtenir des échantillons de la perfusat à des moments prédéterminés pour l'analyse et / ou la quantification des métabolites sécrétés cellulaire. Comme un exemple représentatif, nous dépeindre la productiontion de nitrite (NO 2 -) lors d'une expérience de flux 48 heures avec des EPC porcine dans la figure 12. Nous mesuré directement ce produit d'oxydation de l'oxyde nitrique (NO) comme un marqueur de substitution de NO dans les échantillons recueillis moyenne du circuit d'écoulement au niveau des points de temps différentes à 12,0 nmol moins 6 heures, 13,1 nmol à 12 heures, 16,3 nmol moins 24 heures, et 24,6 nmol après 48 heures pour 1 x 10 6 cellules à 15 dynes / cm 2 6.
Figure 1. Schéma montrant un aperçu de l'ensemble du circuit d'écoulement et d'expérimenter de flux. (A) l'assemblage de circuits de débit sans la chambre de circulation. Inclus ici sont le réservoir, amortisseur d'impulsions, des tubes durs, tuyaux souples, robinets à 4 voies et connecté adaptateurs Luer, ainsi que le filtre à air. (B) Raccordement de la chambre d'écoulement via le segment de tube dur à la tête de pompe débit. (C) Dans sertion de la diapositive EPC-ensemencées dans la plaque de fond de la chambre de circulation (D). Compléter l'assemblage du circuit d'écoulement avec la chambre d'écoulement.
Figure 2. Circuit d'écoulement complètement monté pour la stérilisation.
Figure 3. Circuit d'écoulement assemblé après stérilisation avec robinets inclus.
Figure 4. Remplissage du réservoir en verre de 125 ml de milieu de CBE.
Figure 5. Débit du circuit serré dans la tête de pompe de débit avant l'insertion chambre d'écoulement.
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Figure 6. Haut assemblage de plaque de chambre.
Figure 7. Rinçage du piège à bulles avec des moyennes EPC pour éliminer les bulles d'un côté d'entrée de la chambre.
Figure 8. Flushing la chambre avec un milieu de CPE pour éliminer les bulles de la diapositive et le côté sortie de la chambre.
Figure 9. Entièrement assemblé circuit d'écoulement avec chambre d'écoulement inséré lors d'une expérience de flux.
Figure 10. Zone de CBE (en um 2) augmente au cours du temps de l'expérience de flux.
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Figure 11 (A). Image du microscope Lumière de HUCB EPC ensemencées sur une lame de verre recouvert de fibronectine x 6 heures avant de couler au grossissement de 100 x. (B) HUCB EPC étiquetés avec CTO et rapide ensemencées sur une diapositive Ti x 15 min avant de couler, visualisé par microscopie de fluorescence à 100 grossissement x. (C) La même lame Ti avec EPC HUCB que sous (B), après 3 heures du flux à 100 dynes / cm 2 et imagé à travers la chambre transparente au grossissement de 100 x. Notez l'orientation propagation des cellules, mais encore aléatoire après 3 heures de l'écoulement. (D) La même lame Ti, maintenant, après 48 heures d'exposition de flux à 100 grossissement x. EPC sont étiquetés avec CTO et noyaux cellulaires sont colorés avec le colorant Hoechst (bleu), après l'écoulement. Notez l'alignement des cellules dans le sens d'écoulement. (E) EPC porcin pour la comparaison sur le Ti après 48 heures de flux et 15 dynes / cm 
Graphique Figure 12. Dépeint pas de production d'EPC porcine au cours des 48 heures de flux. Un produit d'oxydation de NO, les nitrites (NO 2 -), a été mesuré comme un marqueur de substitution pour le NO à partir d'échantillons recueillis moyennes à différents moments pendant l'écoulement. 
Figure 13. La chambre d'écoulement est en alliage d'aluminium 6061 de stock rectangulaire, avec la section du haut (A) étant de 0,5 "x 2" x 7 "et la section du bas (B) 0,25" x 2 "x 7" en dimension. Le dessus estrabotées sur sa surface de contact inférieure torique à 0,45 ", afin d'assurer la planéité d'étanchéité. La partie supérieure est évidée dans sa partie centrale à 0,125", ce qui laisse 0,95 "pour une fin par 0,3125" x 1,375 "réservoir de liquide. Le section supérieure du réservoir est fileté 3/8-24 TPI et 0,25 "de profondeur pour recevoir les bouchons filetés en acier inoxydable. Slots mesure 1 / 16 "x 0,625" ont été usinées dans la partie inférieure qui pénètrent dans le réservoir. La prise côté afflux a un 10/32 "à travers le trou d'un polypropylène 1 / 8" cannelé à attacher à un robinet. Chaque unité a une fin situé fileté 10/32 TPI de 0,25 "pour une partie profonde en polypropylène 1 / 8" cannelé dans le 0.45 "x 2" de fin. Les extrémités 0,07 utilisez un «trou du fond de discussions par le biais de pénétrer dans le réservoir. Le dessous de la partie supérieure a une zone conique 0,6875" de large, 0.518 degrés du centre d'une fente LH pour une distance de 1,460 ". Ce cône mélanges à une zone plate 0.6875 "de large x 0,0118" de profondeur et 0.590 "de la fin du Glass (ou toute autre surface, faites glisser le titane par exemple) la récréation. Ce plat doit être aligné avec le verre (ou une autre surface, faites glisser le titane par exemple) une fois la lame est installé. Le cône et le plat sont polis. La surface de la lame est 0,0118 "en retrait de la surface inférieure. Le 0,0118" la récréation continue à l'emplacement du réservoir sur la fin de RH. Un joint torique est encastré entièrement autour de fentes et faites glisser laissant 0.020 "de la surface originale entre la rainure torique et un toboggan. Le haut et le bas sont percés d'unités pour les dix trous. La partie supérieure a des trous de dégagement pour les 8 / 32 TPI plate fraisée Vis à tête. La partie inférieure a des trous placés correspondant aux trous du haut et sont filetés 8 / 32 TPI. L'unité de fond a une couleur verre clair glisser la fenêtre encastrée avec sa surface située sur la lame de verre à la surface cellulaire (ou slide titane). L'unité comporte une gorge torique qui englobe fentes dans l'unité supérieure avec une largeur de 0,04 à laisser »de la surface originale entre la lame du bas et l'intérieur O-ring. Le O-rinGS sont silicone rouge AS568A, numéro 044 Ajouter à la partie supérieure et 046 pour la section du bas.
Discussion
Notre circuit d'écoulement et de la chambre de flux nous permet de soumettre des cellules adhérentes, EPC, par exemple, pour définir des contraintes de cisaillement du fluide. Depuis le sommet de chambre et le fond sont transparents, l'adhésion cellulaire et de morphologie peuvent être évalués soit en temps réel, à travers la chambre elle-même, ou après une expérience de débit et de démontage de la chambre de circulation. A ce stade, les cellules peuvent être récoltées dans des conditions stériles et soit re-plaqué, ou utilisés pour recueillir leur ADN ou d'ARN, etc, pour une analyse ultérieure.
Pour parvenir à un écoulement laminaire, la conception de la chambre doit être telle que plusieurs conditions soient remplies.
Tout d'abord, le débit doit être laminaire, ce qui peut être vérifié par le calcul de son nombre de Reynolds (Re), qui est le rapport des forces d'inertie aux forces visqueuses. (Si les forces visqueuses prédominent, Re est faible et l'écoulement est laminaire ou «totalement développé» - habituellement pour Re <2300.Si les forces d'inertie dominent, l'écoulement devient de plus en plus aléatoire jusqu'à ce qu'il soit turbulent, comme c'est le cas pour Re> 4000). Nous pouvons calculer Re, selon l'équation 3 8,
Où ρ est la densité du fluide, Q est le débit, μ est la viscosité, L et H sont la largeur et la hauteur de la chambre, respectivement, et D h est le diamètre hydraulique, défini selon l'équation 4 8,
Le nombre de Reynolds de nos chambres d'écoulement trois, avec des hauteurs allant de 166 à 267 um, large de 13,9 à 34,6 à des débits calculated d'obtenir une contrainte de cisaillement de 15 dynes / cm 2. A des débits calculés pour une contrainte de cisaillement de 100 dynes / cm 2, le nombre de Reynolds des chambres varie de 90,4 à 234. Tous ces nombres de Reynolds sont bien inférieurs à 2300 et répond au critère de l'écoulement laminaire.
Deuxièmement, pour le champ de vitesse et la contrainte de cisaillement à être indépendant de la distance le long du canal d'écoulement (ie complètement développé), la distance de l'entrée de fluide à la diapositive doit être plus long que la longueur d'entrée, e L. Cela peut être satisfaite par le calcul de la longueur de l'entrée, selon l'équation 5 9.
Pour les valeurs énumérées ci-dessus, la longueur d'entrée varie de 0,01 à 0,25 cm.
Troisièmement, afin de s'assurer que la vitesse et la contrainte de cisaillement dans la direction latérale ne varient passignificativement de la valeur pour un débit de canal unidimensionnel (Ph Δ / 2L), le ratio H / W doit être bien inférieure à 1. Pour la contrainte de cisaillement moyenne de paroi dans des conditions d'écoulement à deux dimensions à 95% de la contrainte de cisaillement mur sous unidimensionnelle, h / w doit être égale à 0,10, et pour la contrainte de cisaillement mur sous des conditions d'écoulement à deux dimensions pour être 97,5% de la contrainte de cisaillement mur sous unidimensionnelle, h / w doit être égale à 0,05. Avec les dimensions de notre chambre d'écoulement conçus 1,7 cm de largeur et de 166 à 267 um de hauteur, ces critères sont satisfaits.
La pression varie seulement dans le sens d'écoulement s'il n'ya pas de gradients de pression latérale à l'entrée. Cela peut être évaluée en utilisant des colorants ou des particules dans le chemin d'écoulement. En outre, pour des expériences de flux constant, un amortisseur d'impulsions est inséré dans le circuit d'écoulement. L'amortisseur d'impulsions sort la plupart des pulsatility provoqué par la pompe à rouleaux dans le circuit, et nous permet de rapprocher l'hypothèse d'un débit constant. Fait à noter, l'amortisseur d'impulsions utilisé doit être compatible avec la pompe et les tubes utilisés dans le circuit, de sorte qu'il peut éliminer efficacement les pulsations dans le flux de sortie pour les fréquences spécifiques de la pompe à rouleaux. Dans notre démonstration de la Masterflex L / S amortisseur d'impulsions réalise un écoulement laminaire lorsqu'il est utilisé sur la ligne de refoulement avec une pompe Masterflex série L / S (0 à 600 RPM) et I / P 26 tubes. Pour un flux pulsatile, une pompe programmable peut être utilisée pour générer des signaux différents.
Pour un flux pulsatile, une pompe programmable peut être utilisée pour générer des signaux différents.
Par ailleurs, le circuit est conçu de telle sorte que des échantillons de perfusat peuvent être facilement recueillies à différents moments sans risque de contamination des cellules ou moyen débit. Dans notre exemple, la concentration de NO 2 - a été mesurée par chimioluminescence avecun analyseur de Ionics / Sievers d'Oxyde Nitrique (NOA 280, Instruments Sievers, Boulder, CO), comme décrit précédemment 10. Le réducteur utilisé pour l'analyse des nitrites a été l'iodure de potassium dans l'acide acétique (14,5 M d'acide acétique et de 0,05 M KI), qui a le potentiel de réduction de convertir nitrite en NO, mais est insuffisante pour réduire les oxydes d'azote plus élevé tels que les nitrates et est donc relativement spécifique pour les nitrites. Le nitrite quantité totale produite a été calculée comme le produit de la concentration de produit et le volume total du circuit tout en ajustant pour la perte de volume tout en prenant des échantillons 6.
Les étapes suivantes sont essentielles pour l'exécution réussie des expériences de flux:
- Il est souhaitable d'éviter la formation de bulles lors de la mise en place de flux, depuis les bulles ont le potentiel pour arracher les cellules de leur surface. Ceci peut être évité en prenant soin lorsque vous placez la partie supérieure de la chambre d'écoulement sur la partie inférieure, qui est le mieuxaccomplie en gardant à la fois parallèles les uns aux autres et à abaisser le dessus sur le fond dans un mouvement sans réajustements. Ce faisant, petites bulles d'air qui peuvent être présents et / ou flottant dans le canal d'écoulement, sera détournée dans les pièges à bulles à chaque extrémité du boîtier en aluminium.
- Il est important de s'assurer que le tuyau d'écoulement dans le réservoir descend au fond du réservoir. Sinon, l'air peut être aspiré dans le tuyau qui mène à la chambre du réservoir si le niveau de perfusat tombe légèrement en dessous de l'extrémité du tuyau.
- Le chercheur doit se familiariser avec la direction du débit de la pompe pour que la pompe ne lancez accidentellement dans la direction opposée dès le début des flux, ce qui aboutirait à l'air d'être aspiré dans le circuit et la chambre.
- Pour éviter la formation de mousse (en raison de protéines dénaturées contenues dans le sérum), nous vous conseillons de baisser le tuyau qui mène de la chambre au réservoir d'environ un pouce au-dessus du perfusaniveau de te l'intérieur du réservoir. Toutefois, le garder au-dessus du niveau moyen de flux vous permet de vérifier le débit dans le réservoir pendant l'expérience.
- Lors du vissage des pièces de chambre ensemble, il est important de saisir fermement le boîtier avec une main pendant le fonctionnement du tournevis électrique avec votre autre main. Notez que le mouvement du tournevis électrique sera traduit en couple qui a le potentiel de «jeter la chambre autour de« une fois que la vis est serrée.
- Afin d'éviter toute formation de vagues de pression dans le circuit et la levée des cellules hors de leur surface, s'assurer que tous les robinets sont ouverts avant de commencer l'écoulement.
- Surtout pour les études de flux à plus long terme (> 48 heures), nous vous recommandons d'utiliser le tuyau de plus en plus résistants pour être inséré dans la tête de pompe pour éviter la rupture des tubes.
- Il est possible que le tube «migre» dans la tête de la pompe due à de mauvais ajustés dents tête de pompe. Nous suggérons donc attentifs à la manière dont la baignoireING est fixé dans la tête de la pompe et le marquage de chaque extrémité du tube avec un marqueur tel que vous pouvez facilement constater si le tube est «tiré dans 'ou délogés pendant l'expérience.
- Toujours vérifier soigneusement chaque connecteur simple du circuit et de la chambre avant de commencer la perfusion afin d'empêcher la fuite de liquide de perfusion lors d'une expérience due à une mauvaise connexion. Ceci est particulièrement important pour les connecteurs d'entrées et de sorties des amortisseurs pouls!
- N'oubliez pas de limite d'exposition à la lumière si vous utilisez des étiquettes fluorescentes.
Une éventuelle limitation de notre chambre d'écoulement est que la hauteur est fixée par la hauteur du canal usiné dans l'aluminium. Cependant, cela a l'avantage de ne pas avoir à vérifier et à ajuster la hauteur du canal avant chaque expérience et simplifie donc le calcul des contraintes de cisaillement en se contentant de réglage du débit de la pompe à la valeur désirée. Selon vos objectifs de recherche, il peut être souhaitable deaugmentation de la contrainte de cisaillement, sans vitesse de la pompe augmente. Dans ce cas, nous recommandons d'augmenter la viscosité du liquide de perfusion, par ex ajoutant dextran aux 11 moyennes.
Une limitation possible du circuit de débit est le volume important de support utilisé, qui peut être problématique lorsque l'on tente de quantifier de très faibles concentrations de métabolites de la cellule. Bien que non représenté ici, il est possible de réduire considérablement le volume du circuit en utilisant un plus petit réservoir et un amortisseur de pulsation et de diminuer la longueur du tube et le diamètre.
De plus, il existe plusieurs autres systèmes disponibles dans le commerce qui peut être utilisé pour appliquer la contrainte de cisaillement du fluide dans les cellules en culture. Microfluidique à base de systèmes, par exemple le système d'BioFlux Fluxion, permettre des analyses simultanées de cellules dans les différents canaux d'écoulement microfluidique chargée avec une solution en plaques ainsi agir comme entrée et de sortie pour ces réservoirs 12,13,14 canaux. Cependant, les micro et d'autressystèmes fluidiques sont pas compatibles avec des lames de microscope standard et ne permettent pas la récupération d'un nombre suffisamment grand de cellules pour d'autres expériences, comme la RT-PCR ou Western Blot. En outre, ils sont moins conviviaux, le coût d'un minimum de 40 000 $ et peut atteindre un total de plus de 100.000 dollars, selon l'équipement accessoire.
Deux systèmes macrofluidic disponibles auprès de la Société internationale de Flexcell, le Streamer Flexcell et les systèmes FlexFlow, ont été utilisés avec succès pour étudier les cellules endothéliales 15,16,17, les cellules humaines anneau 18 et 19 fibroblastes dans des conditions d'écoulement des fluides. Un troisième système, disponible via GlycoTech, a été utilisée pour étudier l'adhérence des cellules tumorales 20 et adhérence des leucocytes de 21 à monocouches endothéliales.
Le système permet streamer plusieurs diapositives pour être exécuté dans les mêmes conditions de cisaillement à la fois, mais il lui manque une fenêtre de visualisation et - contrairement à nosconception - ne permet pas de visualiser en temps réel des cellules sous écoulement.
Le système FlexFlow a une fenêtre de visualisation, mais nécessite un microscope droit, qui pourrait ne pas être le microscope standard utilisé dans la plupart des laboratoires. En outre, le système nécessite FlexFlow une lamelle de cellules enduits d'être inversée lorsqu'il est placé dans la chambre de circulation. Cela empêche la visualisation des cellules fluorescentes sur une surface opaque, tels que le titane revêtu de verre, ce qui nous faisons preuve dans notre étude. Enfin, les lamelles spécialisés doivent être achetés spécifiquement pour le système FlexFlow, qui est dans la fourchette de prix de plusieurs milliers de dollars, semblable au système de streamer Flexcell.
GlycoTech offre circulaires et rectangulaires chambres d'écoulement à plaques parallèles, qui sont nettement moins chers, mais fabriqués à partir d'acrylique moulé qui ne peuvent pas être convenablement la tige autoclavés comme notre chambre. Fait à noter, d'autres chambres d'écoulement qui ont été décrits pour être autoclavableapparaissent impraticables car ils nécessitent des lentilles spéciales microscopiques 22,23. Le système utilise des joints en caoutchouc GlycoTech de silicium interposé entre les plaques supérieure et inférieure, ce qui va changer dans l'épaisseur avec un usage répété et donc modifier la hauteur de la chambre au cours du temps (le fabricant recommande l'achat de nouveaux tous les dix utilisations). Notre chambre en aluminium avec haut-toriques permet une complète opposition de plaques supérieure et inférieure et assure hauteur de la chambre constant entre expériences. Enfin, les pompes à vide sont nécessaires pour obtenir un joint étanche dans de nombreux designs chambre de circulation, y compris les chambres GlycoTech, qui ne sont pas nécessaires dans notre conception.
Attendu que non représenté ici, la chambre d'écoulement peuvent être conservés sous un microscope pendant l'expérience totalité du flux d'images en temps réel de l'adhésion cellulaire et / ou de comportement. Si cela est souhaité, nous recommandons d'utiliser les lampes chauffantes ou d'un coussin chauffé sous la chambre pour maintenir la température du perfusat à 37 ° C. Fourrurelà, la pompe à rouleaux peuvent être remplacés par une pompe seringue, si aucun «recirculation» des cellules ou des métabolites ou des médicaments expérimentaux ou des agents est souhaitée 24.
Il est également possible de circuler cellules étiquetées différemment sur les cellules adhérentes, par exemple, les plaquettes fluorescentes sur une couche de EPC confluentes (en utilisant le test décrit par Achneck plaquettes et al. 6,25) pour évaluer de cellule à cellule d'interaction sous la contrainte de cisaillement du fluide. Notre chambre d'écoulement combine des fonctionnalités précieuses des autres chambres de débit disponible, comme un port de prélèvement perfusat et une fenêtre de visualisation et a l'avantage important de la compatibilité avec soit un microscope inversé ou debout. Il est entièrement autoclavable et permet à des expériences répétées à hauteur de la chambre constante et sans avoir besoin de pompes à vide pour obtenir un joint étanche.
Disclosures
Production et l'accès gratuit de cette vidéo article est sponsorisé par Cole-Parmer Instrument Co.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Joe Owen dans l'Instrument biomédicales et atelier d'usinage pour ses efforts inlassables dans l'usinage et l'assemblage des parties chambre d'écoulement et Matt Maudsley de Leica Microsystems pour aider dans les techniques d'image à travers les cellules chambres d'écoulement. Nous sommes redevables à Kevin Collins à partir des services de perfusion Duke et Steve Wallace dans le Département de génie biomédical pour des suggestions utiles sur la conception du circuit d'écoulement. Nous tenons également à remercier la National Science Foundation Graduate Programme de bourses de recherche pour soutenir Alexandra Jantzen et le NIH pour leur soutien par le biais de subvention "doublure autologue CBE afin d'améliorer la biocompatibilité des dispositifs d'assistance circulatoire" RC1HL099863-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Cole-Parmer | 07940-12 | |
| 1-Way Stopcoks | Cole-Parmer | 30600-00 | |
| 30 ml Syringe | BD Biosciences | 309650 | |
| 4 -Way Stopcocks | Cole-Parmer | 30600-04 | |
| Aluminum Alloy | N/A | 6061 | |
| Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 267061 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| DMSO | Research Organics | 2162D | |
| DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| EGM-2 Singlequots | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Female Luer Adaptor | Cole-Parmer | SI-45500-04 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |
| Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole-Parmer | 34594-24 | |
| Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-16 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| H–chst Stain Solution | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| Hyclone FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.01 | |
| L-glutamine | Lonza Inc. | 17-605E | |
| Male Luer Adaptor | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV | |
| Barbed Polypropylene Fittings | Cole-Parmer | 06365-90 | |
| O-Rings | N/A | AS568A | |
| Pulse-Dampener | Cole-Parmer | 07596-20 | |
| Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole-Parmer | 7524-40 | |
| Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole-Parmer | 07518-60 | |
| Slide | Cole-Parmer | 48500-00 | |
| Soft Tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 02915-12 | |
| Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 | |
| Trypsin EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza Inc. | CC-5002 | |
References
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