Summary
Vi beskriver en metode å utsette tilhenger celler til laminær skjærspenning i et sterilt kontinuerlig flyt krets. Cellenes vedheft, kan morfologi bli undersøkt gjennom de gjennomsiktige kammer, prøver hentet fra kretsen for metabolitten analyse og celler høstet etter shear eksponering for fremtidige eksperimenter eller kultur.
Abstract
Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive en teknikk for å utsette tilhenger celler til laminær forhold og vurdere deres respons til godt kvantifiserbare væske skjærspenninger 1.
Våre flow kammer design og flow krets (Fig. 1) inneholder en gjennomsiktig visning regionen som muliggjør testing av celle adhesjon og avbildning av cellemorfologi umiddelbart før flow (11A Fig., B), på ulike tidspunkter i løpet av flow (Fig. 11C) , og etter flow (Fig. 11D). Disse eksperimentene er illustrert med human navlestreng blod-avledet endoteliale progenitorceller (EPCs) og svin EPCs 2,3.
Denne metoden er også gjeldende for andre tilhenger celletyper, for eksempel glatte muskelceller (SMCs) eller fibroblaster.
Kammeret og alle deler av kretsen er lett sterilisert med damp autoklavering. I motsetning til andrekamre, kan f.eks microfluidic kamre, et stort antall celler (> 1 mill. avhengig celle størrelse) bli realisert etter flyten eksperimentere under sterile forhold for cellekultur eller andre forsøk, for eksempel DNA eller RNA ekstraksjon eller immunhistokjemi (Fig. 11e), eller scanning elektron mikroskopi 5. Den skjærspenning kan justeres ved å variere flow rate av perfusate, væsken viskositet, eller kanalen høyde og bredde. Sistnevnte kan redusere væskevolumet eller celle behov samtidig som endimensjonale flow opprettholdes. Det er ikke nødvendig å måle kammer høyde mellom eksperimenter, siden kammeret høyden ikke er avhengig av bruk av pakninger, noe som kraftig øker brukervennligheten av flere eksperimenter. Videre muliggjør kretsteknikk lett innsamling av perfusate prøver for analyse og / eller kvantifisering av metabolitter utskilt av celler i henhold til væske skjærspenning eksponering, for eksempel nitrogenoksid (Fig. 12) 6
Protocol
1. Endoteliale progenitor celleisolasjon
- Før eventuell samling av perifere menneskelig blod, legg inn ditt Forsøksprotokollen til Institutional Review Board (IRB), og etter godkjenning, skaffe frivillige givere "informert samtykke (perifert blod innsamling og EPC isolasjon hadde blitt godkjent av Duke University IRB og er i full overensstemmelse med amerikanske regulatoriske krav relatert til beskyttelse av menneskers forskning deltakere).
- Når du arbeider med animalske EPCs, har forskningen din protokoll godkjennes av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Alle våre svin forsøkene hadde blitt godkjent av Duke University IACUC og ble utført i samsvar med de høyeste standarder for human behandling.
- For isolering av endoteliale progenitorceller, samle 50 ml av perifert blod via standard phlebotomy teknikk fra en samtykket frivillig donor til blodprøvetaking poser fylt med den antikoagulerende citrate fosfat dekstrose og fortynne løsningen 1:1 med Hank er bufret salt-løsning (uten to CaCl, 2 MgCl, 4 MgSO) og lag på like mengder Histopaque å lage veldefinerte lag.
- Sentrifuge (30 min, 740 g, lav break-innstillingen) og samle mononukleære celler (MNC) (Buffy Coat) lag. Resuspender og vask MNCs x 3 med Dulbecco er Fosfatbufret saltvann (DPBS) med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) x 10 min, 515 g, før plating inn i to 12-brønn plater i full EPC vekst medium (MCDB-131 medium med 5 ml 200 mM L-glutamin, 10% FBS og EGM-2 SingleQuots) ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Sakte endre medium hver 24. time i de første 7 dager, deretter annenhver dag. EPC kolonier kan identifiseres etter en gjennomsnittlig tid på 14 dager basert på deres brosteinsbelagte morfologi. Når EPCs i kultur dekker ¼ av 12-bra areal, utvider cellene og bekreft EPC identitet med flowcytometri ved testing for tilstedeværelse av overflate markørerCD31 og fravær av CD14, CD45 som tidligere beskrevet seks. Andre analyser som kan utføres omfatte cellemorfologi og merking med DII-Ac-LDL.
- For forsøkene beskrevet her, utvide isolert EPCs til de er nesten confluent i 3 T-75 cellekultur kolber i EPC medium i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
2. Skjærspenning beregning
- Vi anbefaler at disse beregningene er utført, før produksjon av kammer og kanal å ha en grundig forståelse av forholdene som kan oppnås. Beregn flow rate av perfusate i kretsen din, basert på ønsket skjærspenninger å bli brukt til cellene i henhold til ligning 1 1,
hvor Q er ønsket flow rate, er τ målet erhører stresset handler tangentially på cellene, er w bredden av flyten kammer, er h høyden av flyten kammer, og μ er viskositeten på perfusate (flow medium).
- En typisk verdi på viskositet (μ) for medium som brukes er 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Merk at viskositeten kan også heves ved hjelp av høy molekylvekt dekstran, hvis ønskelig 7. En typisk verdi på target skjærspenning (τ) som brukes er 15 dynes / cm 2, (typisk arteriell skjærspenning) eller 100 dynes / cm 2, hvis supra-fysiologiske skjærspenning er ønskelig. Våre kammer har vanligvis en bredde (w) på 1,9 cm og høyde (h) i området 166-267 mikrometer.
3. Flow kammer produksjon
- Skjær topp og bunn plater av the kammer fra aluminiumlegering 6061 rektangulær lager med topp dimensjon 7 x 2 x 0.5 "og bunnen dimensjoner 7 x 2 x 0,25".
- Utsparingen topplaten i sentrum delen til 0,125 "dyp, forlater 0,950" per slutten for 1.375 "bred x 0,3125" dypt væske reservoaret.
- Bor 1 / 16 "bred x 0,625" lange spor fra undersiden for å trenge inn til reservoaret på tilsig og utstrømningen ender.
- På slutten av hver topp plate, bore et sentralt 10/32 "spor per tomme (TPI) hull for polypropylen 1 / 8" slange brodd å penetrere væsken reservoaret. På tilsiget slutten, lage en side plug med 10/32 "TPI gjennom hullet for polypropylen 1 / 8" slange brodd.
- Taper toppen undersiden fra væsken tilsig til glass visningsvinduet på 0,518 grader for tilstrekkelig utblanding av væske.
- Skjær et glass skyve vindu i bunnplaten i tråd med toppen visningsvinduet. Ved hjelp av akvarium sement, lim et glass gli inn i kammeret. La det herde i minst 24 timer.Sørg for at visningsvinduet er innfelt slik at en 75 x 25 x 1 mm mikroskop glass skyve vil sitte flush i kammeret.
- Lag en utsparing for en O-ring rundt undersiden av toppen og bunnen plater slik at de er spredt fra hverandre med 0,02. "Sett gummi O-ringer.
- Bor 10 matching 8 / 32 "TPI hull i topp og bunn kamre for bruk med 8 / 32" flat head skruer.
Fire. Flow kretsen montering
- Monter hele flyten krets først, deretter fortsette med sterilisering sin.
- Fest en 36 "segmentet av harde slangen til den ene enden av puls støtdempere (via 1 / 8" tilkobling). Til den andre enden, feste en 18 "segmentet av myk slange.
- Plasser en 1 / 8 "hann luer adapter på slutten av 18" myk slange delen, som nevnt i punkt 4.2. Koble den mannlige luer til en 1 / 8 "kvinnelig luer adapter. Fest den kvinnelige luer til en ny 18" segmentet myk slange.
- Bor tre hull i en 250 ml glass begerglass cap for å passe slangen. Jegnsert en 1.5 "segmentet av myk tubing (som lufteventilen) inn i ett hull og den frie endene av harde og myke slanger gjennom de andre to hull i lokket inn i 250 ml glassflaske (som reservoar) (fig 2). Sørg for at den harde slangen når bunnen av reservoaret (som utstrømning tubing fra reservoaret).
- Steriliser ovennevnte delene av damp autoklavering ved 121 ° C i 60 min. I tillegg autoklav ett komplett flow kammer, 3 x 2 "segmenter av myk slange, en hann og en hunn 1 / 8" luer adapter, 4 x ½ "og 6 x 5 / 16" 8-32 forsenkede skruer, en pinsett , en 75 x 25 x 1 mm glass-slide (eller andre ønskede celleoverflaten materiale), og 2 kirurgiske håndklær.
- Plasser sterile håndklær i laminær flow hette. Plasser flow kretsen, flow kammer, 4 x 4-veis stoppekraner, 1 x 1-veis stoppekran, og alle sterilisert delene fra trinn 4,5 på denne sterile feltet.
- Nå bruker sterile hansker til å koble sammen to 4-veis stoppekraner. Plasser caps på det åpne prøven portene. Ta den mannlige og kvinnelige luer adaptere feste de to myke rør segmenter av flyten kretsen og sett den tilkoblede stoppekraner (Fig. 3).
- Fest den myke rør satt inn i reservoaret for å en 30 ml sprøyte og fjern sprøyten stempelet. Fyll flasken med 125 ml EPC medium (Fig. 4).
- Plasser en steril sprøyte filteret inn i lufteventilen (Fig. 4).
- Flytt flow krets i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Klem den harde slangen inn i valsen pumpehodet indisert for bruk med denne type rør (Fig. 5). Sørg for at slangen ikke overlapper med valsen pumpe montering spor. Marker slangen der den kommer ut av pumpehuset på begge sider med en tusjpenn.
- Kontroller at alle stoppekraner er stengt av mot prøven havner og åpne langs flyten krets. Starte pumpen. Kontroller retningen på strømmen. Den perfusate bør flytte from glasset reservoar gjennom den harde slangen inn pulsen støtdempere.
5. EPC fluorescerende merking
- Mens flyten kretsen varmes til 37 ° C, forberede cellene for seeding på lysbildet. Merk at fluorescerende merking er nødvendig hvis cellene er å bli visualisert på ugjennomsiktig materiale, f.eks titan (Ti).
- Lag en 1 mM stamløsning av Cell Tracker Orange (CTO) ved å fortynne 50 mikrogram CTO pulver med 90 mL av dimethyl sulfoxide (DMSO). Pass på å skjerme denne blandingen fra lyseksponering (slå av lyset mens du arbeider i henhold flow hette).
- Lag en 2 mM arbeider løsning CTO ved å fortynne 36 mL av CTO stamløsningen inn 18 ml av serum-free MCDB-131 medium.
- Skyll EPCs i 3 nær confluent T-75 cellekultur kolber med 10 ml DPBS (uten Ca eller Mg).
- Tilsett 6 ml av de 2 mM CTO arbeider løsning til hver kolbe. Inkuber i 15 min ved 37 ° C. Skyll hver flaske x 2 med 10 ml DPBS (uten Ca eller Mg).
- Vask ved sentrifugering x 5 min på 600g og resuspender i 5 ml EPC medium.
Seks. Cell såing av lysbildet før flow kammer montering
- Et lysbilde laget av glass, titan, eller annet materiale kan brukes, og lysbildet overflaten kan endres av spin coating med polymer eller legge et lag av metall. Plasser gli inn i en steril rektangulær fire-kammer cellekultur fartøy (eller bruk vevskultur gli kolbe hvis polystyren overflate er ønskelig). Telle celler og frø 1,5 x 10 6 celler på raset i 5 ml EPC medium x 6 hr hvis en confluent celle lag er ønsket ved oppstart av flow (Fig. 11A).
- For å teste celle spredning og adhesjon henhold væske skjærspenning, tillate 3 x 10 6 celler til å overholde for bare 15 min før oppstart av flow (Quick-seeding) (
7. Flow kammer montering
- Bruk sterile hansker, kobler en 2 "myk slange segmentet til en 1 / 8" kvinnelig luer adapter. Koble en annen 2 "myk slange segmentet til en 1 / 8" mannlig luer adapter.
- Fest 2 "myke slanger med kvinnelige luer adapter til tilsiget porten. Fest 2" myke slanger med mannlige luer til utstrømningen port. Fest 4-veis stoppekraner til begge disse luer adaptere. Koble de resterende 2 "myke slanger brikken til side port-kontakten kommer av boblen fellen og legge ved en 1-veis stoppekran (Fig. 6).
- Bruk sterile pinsetter, fjerne celle-seeded lysbilde fra cellekultur fartøy (eller hvis du bruker et lysbilde kolbe, fjern kolbe på lysbildet) og plasser den i fordypningen på bunnplaten på flyten kammeret. Pass på at lysbildet er plassert med celle-seeded vendt opp.
- Pipetter 10 ml varm EPC medium på lysbildet. La medium til å dekke slide og flow kammer, bUT ikke søler mediet over O-ringen på bunnplaten.
- Plasser topp platen på flyten kammer på bunnplaten, samkjøre skruehullene. Pass på ikke å innføre luftbobler inn i kammeret i løpet av dette trinnet ved å holde de to platene parallelt.
- Skru platene sammen (en automatisk batteridrevet skrutrekker hastigheter opp denne prosessen).
- Fjern luftbobler fra tilsig boble felle ved å åpne 1-veis kran festet til tilsiget-side boble felle port og forsiktig skylle tilsig tubing med EPC medium å bruke en 10 ml sprøyte. Deretter stenge denne stoppekran og cap den (Fig. 7).
- Nå fjerner luftbobler fra kammeret kanalen ved å åpne utstrømningen port 4-veis stoppekran og ved forsiktig skylle EPC medium gjennom flyten kammer, igjen ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Hvis store bobler fortsatt, heve utstrømming enden av kammeret til en 45 ° vinkel (Fig. 8).
- Cap alle 4-veis stoppekran tilkoblinger og lukkdem av. Flytt flow kammeret i kuvøse med den sammensatte flow krets (Fig. 9).
- Pause flyten kretsen pumpen. Steng flyten kretsen stoppekraner i retning av strømmen for å unngå lekkasje og for å holde innsiden av kammeret sterile. Transport flyten kammer fra flyten hette til flyten kretsen. Koble flow kammeret til flyten kretsen. Åpne stoppekraner i retning av flyten. Fortsett flyten pumpen. Sørg for at perfusate strømmer i riktig retning. Juster strømningshastighet til ønsket skjærspenning.
- Under flow forsøket, kan flyten kammer fjernes fra krets til bildet cellene via lys eller fluoriserende mikroskopi. For å gjøre dette, kobler strømmen kammer fra flyten kretsen ved stoppekran-stoppekran tilkoblinger. For å opprettholde sterilitet kammeret, stenge av strømmen kretsen stoppekraner og flow kammer stoppekraner i retning av flyten og lue alle stoppekraner før fjerne flyten kretsenfra inkubatoren (Fig. 9).
8. Perfusate prøvetaking
- For enkel innsamling av perfusate prøver for analyse, (f.eks nitrogenoksid syntese), første pause pumpen.
- Steng stoppekran plassert nærmest pulsen støtdempere. Fjern den beskyttende hetten og sett en liten størrelse sprøyte, 3 f.eks ml sprøyte, inn prøven porten. Hold cap og sikre at det ikke vil bli forurenset ved å plassere den opp ned.
- Lukk vannkranen i retning av flyten kammer, holde prøven porten og krets i retning av pulsen demper åpen.
- Tegn ønsket mengde av prøven, f.eks 150 mL, fra kretsen. Steng stoppekran mot prøven porten før du tar sprøyten. Oppbevar perfusate prøven i en merket hetteglass og fryse ved - 80 ° C (for nitrogenoksid besluttsomhet på et senere tidspunkt).
- Oppsummering prøven porten og sikre at alle stoppekraner er åpne før du begynner flow.
9. Representative resultater
Ved hjelp av vår raske-frø metoden, kan menneskelig blod-avledet endoteliale progenitorceller bli seedet på titan lysbilder i 15 minutter og holder seg i henhold til fysiologiske (arteriell) skjærkrefter på 15 dynes / cm 2.
Som vist i Figur 10, EPCs spredt under påvirkning av flyten fra 210 ± 11,4 mikrometer 2, umiddelbart etter såing, til 657 ± 39,1 mikrometer 2 etter 3 timer, og til 1152 ± 55,3 mikrometer 2 etter 24 timer med væske skjærspenning av 15 dynes / cm 2 (forskjell mellom gruppene er statistisk signifikant med p <0,0001, 1-veis ANOVA). Parallelt med økningen i celle området, som kan avbildes gjennom de gjennomsiktige kammer med enten lys eller fluoriserende mikroskop, rundheten beregnet i henhold til ligning 2 6
/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>
redusert fra 878 x 10 -3 ± 5,9 x 10 -3, umiddelbart etter såing, til 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 etter 3 timer, og til 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 etter 48 timer av den samme væsken skjærspenning eksponering (forskjell mellom gruppene er igjen statistisk signifikant med p <0,0001, 1-veis ANOVA).
Figur 11D viser at EPCs justere og orientere i retning av strømmen etter 48 timer med væske skjærspenning ved 15 dynes / cm 2 i forhold til deres tilfeldig orientering etter en statisk seeding periode på 6 timer, vist i figur 11A.
Vår metode gjør det også mulig å få prøver av perfusate på forhåndsbestemte tidspunkter for analyse og / eller kvantifisering av utskilles celle metabolitter. Som et representativt eksempel viser vi produksjon av nitritt (NO 2 -) i løpet av en 48 timers flow eksperimentere med svin EPCs i Figur 12. Vi direkte målt dette primære oksidasjon produkt av nitrogenoksid (NO) som en surrogat markør for NO i medium prøver samlet inn fra strømmen krets på ulike tidspunkt å være 12,0 nmol på 6 timer, 13,1 nmol på 12 timer, 16,3 nmol ved 24 timer, og 24,6 nmol etter 48 timer for 1 x 10 6 celler ved 15 dynes / cm 2 6.
Figur 1. Skjematisk viser en oversikt over flyten kretsen montering og flyt eksperiment. (A) Flow krets montering uten flyt kammeret. Inkludert her er reservoaret, puls støtdempere, hard tubing, myk slange, 4-veis stoppekraner og tilkoblet luer adaptere, samt luftfilter. (B) Koble strømmen kammeret via den harde slangen segmentet til flyten pumpehuset. (C) I sertion av EPC-seeded gli inn bunnplaten av flyten kammeret (D). Komplett montering av flyten krets med strømmen kammeret.
Figur 2. Ferdig montert flow krets for sterilisering.
Figur 3. Assembled flow krets etter sterilisering med stoppekraner inkludert.
Figur 4. Fylling glasset reservoaret med 125 ml av EPC medium.
Figur 5. Flow krets klemt inn i flyten pumpehodet før flow kammer innsetting.
jpg "/>
Figur 6. Top kammer plate montering.
Figur 7. Flushing boblen fellen med EPC medium for å fjerne bobler fra tilsig side av kammeret.
Figur 8. Flushing kammeret med EPC medium for å fjerne bobler fra raset og utstrømning side av kammeret.
Figur 9. Ferdig montert flow krets med innsatte flow kammer under en flyt eksperiment.
Figur 10. EPC-området (i mikrometer 2) øker over tid løpet av flyten forsøket.
files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
Figur 11.. (A) Lys mikroskop bilde av HUCB EPCs seeded på en fibronektin belagt glass-slide x 6 timer før flow ved 100 x forstørrelse. (B) HUCB EPCs merket med CTO og rask-seeded på en Ti skyv x 15 min før flow, visualiseres med fluoriserende mikroskopi ved 100 x forstørrelse. (C) Samme Ti lysbilde med HUCB EPCs som under (B), etter 3 timer med flyt på 100 dynes / cm 2 og avbildes gjennom de gjennomsiktige kammer på 100 x forstørrelse. Merk spredning av celler, men likevel tilfeldig orientering etter 3 timer med flyt. (D) Samme Ti lysbilde, nå etter 48 timer med flyt eksponering på 100 x forstørrelse. EPCs er merket med CTO og cellekjerner er beiset med Hoechst fargestoff (blå) etter flyt. Merk justeringen av celler i retning av flyten. (E) Porcint EPCs for sammenligning på Ti etter 48 timer med flyt og 15 dynes / cm 
Figur 12. Graf viser ingen produksjon av svin EPCs under 48 timer flyt. En primær oksidasjon produkt av NO, nitritt (NO 2 -), ble målt som et surrogat markør for NO fra medium prøver samlet inn ved ulike tidspunkt i løpet av flyt. 
Figur 13. Flyten kammeret er laget av aluminium legering 6061 rektangulær lager, med den øverste delen (A) er 0.5 "x 2" x 7 "og den nederste delen (B) 0.25" x 2 "x 7" i dimensjon. Den øverste erhøvlet på undersiden O-ring kontaktflate til 0,45 "for å forsikre planhet for forsegling. Den øverste delen er innfelt i sitt midtre delen til 0,125", som etterlater 0.95 "per slutten for en 0,3125" x 1,375 "fluid reservoaret. øverste delen er reservoaret er gjenget 3/8-24 TPI og 0,25 "dypt for å få gjenget rustfritt stål plugger. Slots måler 1 / 16 "x 0,625" ble frest inn undersiden som penetrerer til reservoaret. Den tilsiget side plug har en 10/32 "gjennom hull for polypropylen 1 / 8" slange brodd å feste til en stoppekran. Hver enhet ende har en sentralt beliggende gjenget 10/32 TPI med 0,25 "dype delen for en polypropylen 1 / 8" slange brodd i 0.45 "x 2" end. Endene bruker en 0,07 "hull fra bunnen av trådene gjennom å trenge inn i reservoaret. Undersiden av den øverste delen har et konisk område 0,6875" bred, 0.518 grader fra midten av en LH slot for en avstand på 1.460. "Dette taper blander til et flatt område 0,6875 "bred x 0,0118" dype og 0.590 "fra slutten av Glass (eller en annen overflate, for eksempel titan lysbilde) fordypningen. Denne flate må være i flukt med glass (eller en annen overflate, for eksempel titan skyv) når raset er installert. Den taper og flate blir polert. Overflaten av lysbildet er 0,0118 "innfelt fra undersiden overflate. 0,0118" utsparingen fortsetter å reservoaret sporet på RH slutten. En O-ring er innfelt helt rundt sporene og skyv forlate 0.020 "av originale overflaten mellom O-ringen groove og skyv. Øvre og nedre enheter er boret ti hull. Den øverste delen har klarering hull for 8 / 32 TPI forsenket flat skruer. Den nederste delen har hull plassert matching øverste hullene og er gjenget 8 / 32 TPI. Bunnen Enheten har et klart glass skyve vindu innfelt flush med overflaten ligger over celleoverflaten glass-slide (eller titan lysbilde). Enheten har en O-ring groove som omfatter sporene i den øverste enheten med bredde til å forlate 0,04 "av originale overflaten mellom bunnen slide og den indre O-ring groove. O-rings er rød silikon AS568A, Dash Number 044 for den øverste delen og 046 for den nederste delen.
Discussion
Våre flow krets og flyt kammer tillate oss å utsette tilhenger celler, f.eks EPCs, til definerte væske skjærspenninger. Siden kammer topp og bunn er gjennomsiktige, celle adhesjon og morfologi kan evalueres enten i sanntid, gjennom kammeret selv, eller etter en flyt eksperimentere og demontering av flyten kammeret. På dette punktet, kan cellene høstes under sterile forhold og enten re-belagt, eller brukes til å samle sine DNA eller RNA, etc., for videre analyse.
For å oppnå laminær flow, må utformingen av kammeret være slik at flere vilkår er oppfylt.
Først må strømmen være laminære, noe som kan bekreftes ved å beregne sitt Reynolds tall (Re), som er forholdet mellom treghet krefter til viskøse krefter. (Hvis viskøse kreftene dominerer, er Re små og strømningen er laminær eller "fullt utviklet" - som regel for Re <2300.Hvis treghet kreftene dominerer, blir flyten mer og mer tilfeldige til det er turbulent, slik tilfellet er for Re> 4000.) Vi kan beregne Re henhold til ligning 3 8,
Hvor ρ er væsken tetthet, er Q strømningshastigheten er μ viskositet, w og h er bredden og høyden av kammeret, henholdsvis, og D h er den hydrauliske diameter, definert i henhold til ligning 4 8,
Det Reynolds Antallet våre tre flow kamre, med høyder som strekker seg 166-267 mikrometer, range 13,9 til 34,6 ved massestrømmer calculated å få en skjærspenning på 15 dynes / cm 2. På strømningshastigheter beregnet for et skjærspenning på 100 dynes / cm 2, varierte Reynolds antall kamrene 90,4 til 234. Alle disse Reynolds tallene er mye lavere enn 2300 og oppfyller kriteriet for laminær flow.
Sekund til for hastighet feltet og skjærspenning være uavhengig av avstanden langs flyten kanalen (dvs. fullt utviklet), avstanden fra væske inntaket til å skyve må være lengre enn inngangen lengden, L e. Dette kan oppfylles ved beregning inngangen lengden, i henhold til ligning 5 9.
For verdiene ovenfor, varierer inngangen lengde 0,01 til 0,25 cm.
Tredje, for å sikre at hastigheten og skjærspenning i lateral retning ikke varierevesentlig fra den verdien for endimensjonale kanal flow (Δ Ph / 2L), må forholdet h / w være mye mindre enn en. For den gjennomsnittlige veggen skjærspenning under to-dimensjonale strømningsforhold å være 95% av veggen skjærspenning under en-dimensjonal flyt, må h / w være lik 0,10, og for veggen skjærspenning under to-dimensjonale strømningsforhold å være 97,5% av veggen skjærspenning under en-dimensjonal flyt, må h / w være lik 0,05. Med dimensjoner på våre utformet flyt kammer 1,7 cm i bredden og 166-267 mikrometer i høyden, er disse kriteriene oppfylt.
Trykket vil variere kun i retning av strømmen hvis det ikke lateral trykkgradienter ved inngangen. Dette kan vurderes å bruke fargestoffer eller partikler i flyten banen. Videre, for jevn flyt eksperimenter, er en puls støtdempere inn i flyten kretsen. Pulsen demper tar ut mesteparten av Pulsatility forårsaket av valsen pumpe i kretsen, og tillater oss å omtrentlige forutsetningen om jevn flyt. Av notatet, bør pulsen demper utnyttet være kompatibelt med pumpe og slange som brukes i kretsen, slik at det effektivt kan eliminere pulseringer i produksjonen flyt for bestemte frekvenser i valsen pumpen. I demonstrasjonen vår Masterflex L / S puls støtdempere oppnår laminær flow når den brukes på utløpsrøret med noen Masterflex L / S serien pumpe (0-600 RPM) og I / P 26 tubing. For pulsatile flyt, kan en programmerbar pumpe brukes til å generere ulike bølgeformer.
For pulsatile flyt, kan en programmerbar pumpe brukes til å generere ulike bølgeformer.
Videre er kretsen utformet slik at prøver av perfusate kan enkelt hentes på ulike tidspunkt uten å risikere kontaminering av celler eller flow medium. I vårt eksempel konsentrasjonen av NO 2 - ble målt ved chemiluminescence meden Ionics / Sievers Nitric Oxide Analyzer (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO) som tidligere beskrevet 10. Den reductant brukes til nitritt analyse ble kalium iodide i eddiksyre (14,5 M eddiksyre og 0,05 M KI), som har redusert potensial til å konvertere nitritt til NO men er utilstrekkelig for å redusere eventuelle høyere oksider av nitrogen som nitrat og dermed er relativt spesifikke for nitritt. Den totale mengden nitritt produsert ble beregnet som produktet av konsentrasjon produsert og det totale volumet av kretsen mens justert for volumet tapt mens man tar prøver seks.
Følgende trinn er kritiske for en vellykket gjennomføring av flow eksperimenter:
- Det er ønskelig å unngå bobledannelse under flow set-up, da bobler har potensial til å rive av celler fra overflaten deres. Dette kan unngås ved å ta vare når du plasserer den øverste delen av flyten kammeret på den nederste delen, som er bestoppnås ved å holde både parallelt med hverandre og senking øverst på bunn i én bevegelse uten omstillinger. Ved å gjøre det, små luftbobler som kan være til stede og / eller flytende i flyten kanalen, vil bli viderekoblet til boblen feller på hver ende av aluminium.
- Det er viktig å sikre at utstrømningen slangen i reservoaret strekker seg ned til reservoaret i bunnen. Ellers kan luften bli sugd inn i røret som fører fra reservoar til kammer hvis perfusate nivået faller litt under slangen slutten.
- Forskeren bør være kjent med retning av pumpen strømme slik at pumpen ikke tilfeldigvis kjører i motsatt retning ved oppstart av flow, noe som vil resultere i luft blir sugd inn i kretsen og kammer.
- For å unngå dannelse av skum (på grunn av denaturert protein som finnes i serum), anbefaler vi å senke slangen som fører fra kammer til reservoar til omtrent en tomme over perfusate nivået inne i reservoaret. Men å holde den over flyten medium nivå lar deg verifisere strømme inn i reservoaret under forsøket.
- Når skru kammeret delene sammen, er det viktig å godt tak i huset med en hånd mens du bruker den elektriske skrutrekker med den andre hånden. Merk at bevegelse av elektrisk skrutrekker vil bli oversatt til moment som har potensial til å "slenge kammeret rundt" når skruen strammes.
- For å unngå eventuelle trykkbølger fra forming i kretsen og løfte celler av overflaten deres, sørge for at alle stoppekraner er åpne før du begynner flyt.
- Spesielt for lengre sikt flow studier (> 48 timer) anbefaler vi å bruke hardere og mer motstandsdyktig slangen for å settes inn i pumpehuset for å hindre brudd på slangen.
- Det er mulig at slangen 'vandrer' inne i pumpehuset på grunn av dårlig justerte pumpehode tenner. Derfor foreslår vi vier oppmerksomhet til hvordan kareting er sikret i pumpen hodet og merking hver ende av slangen med en tusjpenn slik at du lett kan legge merke til hvis slangen er "dratt i" eller forskyves under forsøket.
- Alltid nøye kontrollere hver enkelt kontakt i kretsen og kammer før du starter perfusjon for å forhindre lekkasje av perfusate under et eksperiment på grunn av en feil tilkobling. Dette er spesielt viktig for tilsig og strøm kontaktene puls dempere!
- Husk å begrense lyseksponering hvis du bruker fluoriserende etiketter.
En mulig begrensning av våre flow kammer er at høyden er fastsatt av høyden på kanalen maskinert i aluminium. Dette har imidlertid fordelen av ikke å måtte verifisere og justere høyden på kanalen før hvert forsøk, og derfor forenkler skjærspenning beregningene bare ved å justere pumpen strømme til ønsket verdi. Avhengig av din forskning mål, kan det være ønskelig åøke skjærspenning uten å øke pumpehastigheten. I dette tilfellet anbefaler vi å øke perfusate er viskositet, f.eks legge dekstran til mediet 11.
En mulig begrensning av flyten krets er det store volum av mediet som brukes, noe som kan være problematisk når du forsøker å kvantifisere svært små konsentrasjoner av celle metabolitter. Selv ikke vist her, er det mulig å betydelig redusere kretsen volumet ved å bruke et mindre reservoar og puls støtdempere og senke rør lengde og diameter.
I tillegg er det flere andre kommersielt tilgjengelige systemer som kan brukes til å søke væske skjærspenning til celler i kultur. Microfluidic-baserte systemer, f.eks BioFlux systemet fra Fluxion, aktiverer samtidig analyser av celler i ulike microfluidic flow kanaler lastet med løsningen i vel plater som fungerer som inngang og utgang reservoarer for disse kanalene 12,13,14. Men disse og andre mikrofluidic systemer er ikke kompatible med standard objektglass og tillater ikke for utvinning av et tilstrekkelig stort antall celler for videre eksperimenter, slik som RT-PCR og Western Blot. Videre, de er mindre brukervennlig, koste minimum $ 40.000 og kan nå totalt mer enn 100.000 dollar, avhengig av tilbehør.
To macrofluidic systemer tilgjengelig fra Flexcell International Corporation, Flexcell Streamer og FlexFlow systemer, har blitt brukt til å studere endotelceller 15,16,17, menneskelige ringrommet celler 18 og fibroblaster 19 i henhold til væskestrøm forhold. Et tredje system, tilgjengelig gjennom GlycoTech, har vært benyttet til å studere svulst celle adhesjon 20 og leukocytter vedheft 21 til endoteliale monolayers.
Streamer systemet tillater flere lysbilder som skal kjøres under samme skjærspenning forhold på en gang, men mangler et vindu og - i motsetning til våredesign - tillater ikke for sanntids visualisering av cellene under flyt.
Det FlexFlow Systemet har en visningsvinduet, men krever en oppreist mikroskop, som kanskje ikke standarden mikroskop brukes i de fleste laboratorier. Videre krever FlexFlow systemet en celle-belagt dekkglass å være invertert når den plasseres inn i flyten kammeret. Dette utelukker visualisering av fluorescerende celler på en ugjennomsiktig overflate, som titan-belagte glass, som vi viser i vår studie. Til slutt, den spesialiserte dekkglass må kjøpes spesielt for FlexFlow systemet, som er i den multi-tusen-dollar prisklasse, ligner på Flexcell Streamer systemet.
GlycoTech tilbyr sirkulære og rektangulære parallell-plate flow kamre, som er betydelig billigere, men produsert av støpt akryl som ikke enkelt kan demme autoklaveres som kammer vår. Av notatet, til andre flow kamre som har blitt beskrevet være autoklaverbarsynes upraktisk fordi de krever spesielle mikroskopiske linser 22,23. Den GlycoTech systemet benytter silikongummi pakninger interposed mellom topp og bunnplater, noe som vil endre seg i tykkelsen med gjentatt bruk og derfor endre kammer høyde over tid (det produsenten anbefaler å kjøpe nye etter hvert tiende bruker). Våre aluminium kammer med innebygd O-ringer gjør for fullstendig opposisjon av topp og bunn plater og sikrer konstant kammer høyde mellom eksperimenter. Til slutt, vakuumpumper er nødvendig for å oppnå en lekkasjesikker segl i mange flyt chamber design, inkludert GlycoTech kamre, som ikke er nødvendige i vårt design.
Mens ikke vist her, kan flyten kammeret holdes under et mikroskop under hele flyten eksperiment for sanntids avbildning av celle adhesjon og / eller atferd. Dersom dette er ønskelig, anbefaler vi at du bruker varme lamper eller et oppvarmet pad under kammeret å opprettholde perfusate temperaturen ved 37 ° C. FurDerfra kan valsen pumpe bli erstattet med en sprøyte pumpe, hvis ingen "resirkulering" av enten celler eller metabolitter eller investigational narkotika eller midler er ønsket 24.
Det er også mulig å flyte annerledes merkede celler over tilhenger celler, for eksempel fluorescerende blodplater over et lag av confluent EPCs (med blodplate analysen beskrevet av Achneck et al. 6,25) til å vurdere celle-til-celle interaksjon henhold væske skjærspenning. Våre flow kammer kombinerer nyttige funksjoner fra andre tilgjengelige flow kamre, for eksempel en perfusate sampling port og et vindu og har den viktige fordelen av kompatibilitet med enten en invertert eller oppreist mikroskop. Det er fullt autoklaverbare og gir mulighet for gjentatte forsøk på konstant kammer høyde og uten behov av vakuumpumper for å oppnå en tett forsegling.
Disclosures
Produksjon og fri tilgang i denne video-artikkelen er sponset av Cole-Parmer Instrument Co
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Joe Owen i Biomedical Instrument og Machine Shop for sin utrettelige innsats i maskinering og montering av flow kammer deler og Matt Maudsley fra Leica Microsystems for å bistå i teknikker for å image cellene gjennom flyt kamre. Vi står i gjeld til Kevin Collins fra Duke Perfusjons Services og Dr. Steve Wallace i Department of Biomedical Engineering for nyttige forslag på flyt krets design. Vi vil også takke National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program for støtte Alexandra Jantzen og NIH for deres støtte gjennom Grant "Autolog EPC fôr for å forbedre biokompatibilitet av sirkulasjons bistå enheter" RC1HL099863-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Cole-Parmer | 07940-12 | |
| 1-Way Stopcoks | Cole-Parmer | 30600-00 | |
| 30 ml Syringe | BD Biosciences | 309650 | |
| 4 -Way Stopcocks | Cole-Parmer | 30600-04 | |
| Aluminum Alloy | N/A | 6061 | |
| Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 267061 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| DMSO | Research Organics | 2162D | |
| DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| EGM-2 Singlequots | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Female Luer Adaptor | Cole-Parmer | SI-45500-04 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |
| Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole-Parmer | 34594-24 | |
| Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-16 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| H–chst Stain Solution | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| Hyclone FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.01 | |
| L-glutamine | Lonza Inc. | 17-605E | |
| Male Luer Adaptor | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV | |
| Barbed Polypropylene Fittings | Cole-Parmer | 06365-90 | |
| O-Rings | N/A | AS568A | |
| Pulse-Dampener | Cole-Parmer | 07596-20 | |
| Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole-Parmer | 7524-40 | |
| Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole-Parmer | 07518-60 | |
| Slide | Cole-Parmer | 48500-00 | |
| Soft Tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 02915-12 | |
| Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 | |
| Trypsin EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza Inc. | CC-5002 | |
References
- Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
- Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
- Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).
- Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
- Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
- Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
- Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
- Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
- Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
- Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
- Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
- Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
- Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
- Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
