موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

Summary

نحن تصف طريقة لخلايا ملتصقة تخضع لتدفق الصفحي إجهاد القص في دائرة التدفق المستمر العقيمة. التصاق الخلايا "، ويمكن من خلال دراسة مورفولوجية غرفة شفافة ، والعينات التي تم الحصول عليها من الدوائر لتحليل المستقلب والخلايا التي تحصد بعد التعرض لتجارب القص في المستقبل أو الثقافة.

Abstract

الهدف العام لهذا الأسلوب هو لوصف تقنية لموضوع الخلايا تمسكا ظروف التدفق الصفحي وتقييم استجابتها للالقص السوائل القابلة للقياس الكمي كذلك تشدد ^1.

لدينا تصميم غرفة تدفق وتدفق الدائرة (الشكل 1) يحتوي على منطقة العرض الشفافة التي يمكن اختبار خلية التصاق والتصوير من مورفولوجية الخلية مباشرة قبل تدفق (الشكل رقم 11A ، B) ، في نقاط زمنية مختلفة خلال التدفق (الشكل رقم 11C) وبعد تدفق (الشكل 11D). وتتجلى هذه التجارب مع دم الحبل السري الإنسان المستمدة من الخلايا الاصلية البطانية (EPCs) والخنازير EPCs ^2،3.

هذا الأسلوب ينطبق أيضا على غيرها من أنواع الخلايا الملتصقة ، مثل خلايا العضلات الملساء (SMCs) أو الليفية.

يتم تعقيمها بسهولة الغرفة وجميع أجزاء الدائرة مع التعقيم بالبخار. على النقيض من غيرهاالغرف ، يمكن استرداد مثل غرف ميكروفلويديك ، فإن أعدادا كبيرة من الخلايا (> 1000000 اعتمادا على حجم الخلية) بعد التجربة تدفق تحت ظروف معقمة للثقافة الخلية أو تجارب أخرى ، مثل الحمض النووي الريبي أو استخراج ، أو المناعية (الشكل 11E) ، أو المجهر الإلكتروني ^5. يمكن تعديل إجهاد القص من خلال تغيير معدل تدفق سائل الإرواء ، واللزوجة السوائل ، أو ارتفاع وعرض القناة. يمكن لهذا الأخير خفض حجم السائل أو احتياجات الخلية مع ضمان الحفاظ على تدفق ذات بعد واحد. ليس من الضروري لقياس ارتفاع الغرفة بين التجارب ، منذ ذروة الغرفة لا تعتمد على استخدام حشوات ، مما يزيد كثيرا من سهولة تجارب متعددة. وعلاوة على ذلك ، وتصميم الدوائر تمكن بسهولة جمع عينات سائل الإرواء و / أو التحليل الكمي للالأيضات يفرز من قبل خلايا السائل تحت التعرض للإجهاد القص ، مثل أكسيد النيتريك (الشكل 12) ⁶

Protocol

1. العزلة السلف الخلية البطانية

1. قبل الشروع في أي مجموعة من الدم البشري المحيطية ، يقدم البروتوكول الخاص البحوث لمجلس المراجعة المؤسساتي الخاص (IRB) ، وبعد موافقتها ، الحصول على المتبرعين "الموافقة المسبقة (جمع الدم الطرفية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس حماية البيئة بمعزل عن الاتحاد الدولي للرجبي وجامعة ديوك في الامتثال الكامل لمتطلبات الولايات المتحدة التنظيمية ذات الصلة لحماية المشاركين في البحوث الإنسان).
2. عند العمل مع الحيوانات المستمدة EPCs ، والبروتوكول الخاص البحثية التي وافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسي الخاص واستخدام لجنة (IACUC). تمت الموافقة على جميع التجارب الخنزيري لدينا من قبل IACUC جامعة ديوك وأجريت وفقا لأعلى معايير الرعاية الإنسانية.
3. لعزل الخلايا الاصلية البطانية ، وجمع 50 مل من الدم المحيطي عبر تقنية الفصد القياسية من إحدى الجهات المانحة وافقت المتطوعين في أكياس جمع الدم مليئة citrat تخثره فوسفات سكر العنب وتمييع الحل 01:01 بمحلول الملح مخزنة في هانك (بدون CaCl ₂ ، MgCl ₂ ، MgSO ₄₎ ، وطبقة على كميات متساوية من Histopaque لخلق طبقات واضحة المعالم.
4. الطرد المركزي (30 دقيقة ، 740 غرام ، وانخفاض الإعداد استراحة) وجمع الخلايا وحيدة النواة (MNC) (الغلالة الشهباء) طبقة. التخزين المؤقت Resuspend وغسل الشركات المتعددة الجنسيات × 3 مع الفوسفات Dulbecco والمالحة (DPBS) مع المصل 10 ٪ بقري جنيني (FBS) × 10 دقيقة ، 515 غرام ، قبل الطلاء في لوحات ال 12 على اثنين في كامل متوسطة النمو EPC (MCDB - 131 متوسطة مع 5 مل من 200 ملي L - الجلوتامين ، و 10 ٪ وغير العادية FBS - 2 SingleQuots) عند 37 درجة مئوية ، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ _2.
5. تتغير ببطء المتوسط ​​كل 24 ساعة لمدة 7 أيام أولا ، ثم كل يوم. يمكن التعرف على المستعمرات EPC بعد وقت متوسط ​​14 يوما بناء على التشكل الحصوه بهم. مرة واحدة في ربع EPCs ثقافة تغطية مساحة 12 - جيدا ، وتوسيع الخلايا وتأكيد الهوية EPC مع التدفق الخلوي عن طريق اختبار لوجود علامات السطحيةCD31 CD45 وغياب ، كما هو موضح سابقا CD14 ^6. المقايسات الأخرى التي يمكن أداؤها تشمل مورفولوجية الخلية ووضع العلامات مع الجاذبة - AC - LDL.
6. للتجارب الموصوفة هنا ، وتوسيع EPCs معزولة حتى أنهم متموجة تقريبا في 3 T - 75 قوارير ثقافة خلية في المتوسط ​​EPC في ترطيب حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2.

2. القص حساب الإجهاد

1. نوصي بأن يتم تنفيذ هذه الحسابات قبل التصنيع الغرفة والقناة لديهم فهم شامل للظروف التي يمكن تحقيقها. حساب معدل تدفق سائل الإرواء في دارتك على أساس القص المطلوب تؤكد ليتم تطبيقها على الخلايا وفقا للمعادلة ¹ 1 ،

حيث Q هي معدل التدفق المطلوب ، τ هو هدف ليالينسمع الإجهاد يتصرف بشكل طفيف على الخلايا ، ث هو العرض للغرفة التدفق ، ح هو ارتفاع للغرفة التدفق ، وμ هي اللزوجة من سائل الإرواء (وسط تدفق).

2. قيمة نموذجية من اللزوجة (μ) عن الوسيلة المستخدمة هي 0.9 CP (0.009 سم ^-1 ز ق ^-1). علما أنه يمكن أيضا أن تثار اللزوجة العالية باستخدام الجزيئية ديكستران الوزن ، وإذا رغبت في ذلك ^7. استخدام القيمة النموذجية للإجهاد القص الهدف (τ) هو 15 dynes / سم ² ، (نموذجي إجهاد القص الشرياني) أو 100 dynes / سم ² ، إذا كان المطلوب فوق الفسيولوجية إجهاد القص. قاعتنا وعادة ما يكون العرض (ث) من 1.9 سم وارتفاع (ح) في حدود 166-267 ميكرون.

3. تدفق غرفة الصناعات التحويلية

1. قطع لوحات العلوي والسفلي من اله غرفة من مخزون الألومنيوم 6061 سبائك مستطيلة مع البعد العلوي من 7 "أبعاد والجزء السفلي من 7 X 0.25 × 2" × 0.5 × 2.
2. عطلة لوحة في الجزء العلوي إلى 0،125 مركز "عميق ، تاركا 0.950" في النهاية ل1.375 "واسعة س 0.3125" خزان السائل عميقة.
3. حفر 1 / 16 "واسعة س 0.625" فتحات طويلة من الجانب السفلي من أجل اختراق المكمن على تدفق وينتهي تدفق.
4. في نهاية كل لوحة العلوي ، حفر في موقع مركزي 10/32 "المسارات لكل بوصة (TPI) حفرة لمادة البولي بروبيلين 1 / 8" خرطوم لاذع اختراق خزان السائل. في نهاية تدفق ، إنشاء سد جنب مع 10/32 "TPI من خلال ثقب لمادة البولي بروبيلين 1 / 8" خرطوم الشائكة.
5. تفتق السفلي أعلى من تدفق السوائل في زجاج النوافذ في عرض 0.518 درجة كافية لخلط السوائل.
6. قطع زجاج نافذة الشريحة في أسفل اللوحة وفقا لأعلى نافذة عرض. استخدام الاسمنت الزينة ، والغراء شريحة زجاجية في الغرفة. السماح لعلاج لمدة لا تقل عن 24 ساعة.ضمان راحة نافذة عرض بحيث 75 × 25 × 1 مم المجهر شريحة زجاجية وسوف يجلس في غرفة دافق.
7. إنشاء استراحة ليا الدائري حول الجانب السفلي من أعلى وأسفل لوحات مثل التي كانت متباعدة وبصرف النظر بنسبة 0.02 ". إدراج المطاط O - حلقات.
8. حفر 10 مطابقة 8 / 32 "ثقوب في TPI الغرف العلوية والسفلية للاستخدام مع 8 / 32" مسامير الرأس المسطحة.

4. تدفق دائرة التجميع

1. تجميع الدوائر تدفق بأكمله أولا ، ثم المضي قدما في التعقيم والخمسين.
2. يرفق 36 "جزء من أنابيب الصلب إلى واحدة من نهاية يستمتع نبض (عبر 1 / 8" اتصال). على الطرف الآخر ، وإرفاق 18 "قطعة من أنبوب لينة.
3. ضع 1 / 8 "محول luer الذكور في نهاية 18" القسم أنابيب لينة ، المذكورة في الخطوة 4.2. توصيل luer الذكور الى 1 / 8 "محول luer الإناث. إرفاق luer الإناث إلى 18 الجديدة" الجزء أنابيب لينة.
4. حفر ثلاثة ثقوب في سقف 250 مل دورق زجاجي لكي تناسب الأنابيب. أناnsert 1.5 "جزء من الأنابيب اللينة (مثل الهواء تنفيس) في فتحة واحدة وينتهي خالية من أنابيب الصلب واللين من خلال ثقوب 2 أخرى في قبعة في زجاجة 250 مل زجاج (كما الخزان) (الشكل 2). التأكد من أن أنابيب الصلب يصل إلى قاع الخزان (كما أنابيب التدفق من الخزان).
5. تعقيم الأجزاء أعلاه التعقيم بالبخار على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 60 دقيقة. الأوتوكلاف بالإضافة إلى غرفة واحدة تدفق كاملة ، 3 × 2 "قطاعات أنابيب لينة ، من الذكور الإناث 1 و 1 1 / 8" محول luer ، 4 × ½ "× 5 و 6 / 16" 8-32 مسامير رئيس شقة ، 1 زوج من الملاقط ، واحدة 75 × 25 × 1 شريحة زجاجية ملم (أو غيرها من المواد المطلوبة سطح الخلية) ، و 2 المناشف الجراحية.
6. المناشف المعقمة في مكان غطاء تدفق الصفحي. ضع دائرة التدفق ، تدفق الغرفة ، 4 × 4 في اتجاه والصمامات ، 1 × 1 في اتجاه ومحبس ، وجميع الأجزاء المعقمة من الخطوة 4.5 على هذا الحقل العقيمة.
7. الآن استخدام قفازات معقمة لتوصيل جهازي 4 في اتجاه الصمامات. قبعات مكان على عينة منافذ مفتوحة. فصل محولات الذكور والإناث luer إرفاق جزأين أنابيب لينة من الدائرة التدفق وإدراج توصيل الصمامات (الشكل 3).
8. إرفاق أنابيب لينة إدراجها في المكمن لمحقنة 30 مل وإزالة مكبس المحقنة. ملء زجاجة مع 125 مل من المتوسط ​​EPC (الشكل 4).
9. مكان مرشح محقنة معقمة في تنفيس الهواء (الشكل 4).
10. نقل الدوائر تتدفق حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2.
11. المشبك أنابيب الصلب في الأسطوانة وأشار رئيس مضخة للاستخدام مع هذا النوع من الأنابيب (الشكل 5). التأكد من أن الأنابيب لا تتداخل مع المسارات مضخة الأسطوانة المتزايدة. بمناسبة الأنابيب حيث خروجها على رأس المضخة على جانبي بالقلم العلامات.
12. ضمان أن يتم إغلاق كافة الصمامات باتجاه المنافذ العينة ومفتوحة على امتداد الدوائر التدفق. بدء تشغيل المضخة. التحقق من اتجاه التدفق. ينبغي للسائل الإرواء نقل الابام الخزان الزجاجي من خلال أنابيب الصلب في يستمتع النبض.

5. EPC الفلورسنت الوسم

1. في حين أن ارتفاع درجة حرارة الحلبة تتدفق إلى 37 درجة مئوية ، وإعداد الخلايا لبذر على الشريحة. علما بأن المطلوب وضع العلامات الفلورية إذا الخلايا أن تكون تصور على مواد غامضة ومبهمة ، مثل التيتانيوم (تي).
2. إنشاء مخزون 1 مم حل للخلية المقتفي أورانج (CTO) عن طريق تمييع 50 ميكروغرام CTO مسحوق مع 90 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). لا شك أن هذا الخليط من الدرع التعرض للضوء (ضوء إيقاف بينما كان يعمل تحت غطاء تدفق).
3. ايجاد حل 2 ميكرومتر عمل منظمة السياحة القبرصية من خلال تمييع 36 ميكرولتر من محلول المخزون CTO إلى 18 مل من المتوسط ​​MCDB - 131 مصل خالية.
4. شطف EPCs في 3 بالقرب متموجة T - 75 قوارير الثقافة زنزانة مع 10 مل DPBS (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم).
5. إضافة 6 مل من محلول 2 ميكرومتر العمل CTO إلى كل القارورة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف كل قارورة × 2 مل مع DPBS 10 (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم).
6. يغسل دقيقة بواسطة الطرد المركزي في 5 × 600G وresuspend في 5 مل من المتوسط ​​EPC.

6. بذر خلية من الشريحة قبل تدفق قاعة الجمعية

1. ويمكن استخدام شريحة مصنوعة من الزجاج ، والتيتانيوم ، أو غيرها من المواد ، ويمكن أن يتم تعديل سطح الشريحة التي تدور مع طلاء البوليمر أو إضافة طبقة من المعدن. مكان الانزلاق الى العقيمة مستطيلة أربع غرفة خلية سفينة الثقافة (أو استخدام الشريحة الثقافة قارورة الأنسجة إذا كان المطلوب سطح البوليسترين). عدد الخلايا والبذور 1.5 × 10 ⁶ خلايا على الشريحة في 5 مل من المتوسط ​​EPC ساعة 6 × إذا هو المطلوب طبقة الخلية متكدسة في بدء تدفق (الشكل رقم 11A).
2. من أجل اختبار الخلايا تنتشر والتصاق السائل تحت ضغط القص ، والسماح 3 × 10 ⁶ خلايا الالتزام لمدة 15 دقيقة قبل بدء تدفق (سريع البذر) (

7. تدفق قاعة الجمعية

1. استخدام القفازات المعقمة ، قم بتوصيل أحد 2 "الجزء أنابيب لينة إلى 1 / 8" محول luer الإناث. اتصال آخر 2 "الجزء أنابيب لينة إلى 1 / 8" محول luer الذكور.
2. نعلق 2 "أنابيب لينة مع محول luer الإناث إلى منفذ التدفق. ارفق 2" أنابيب لينة مع luer الذكور إلى منفذ التدفق. نعلق 4 في اتجاه الصمامات إلى كل من هذه المحولات luer. الاتصال المتبقية 2 "قطعة أنابيب لينة إلى جانب موصل منفذ نزوله في فخ فقاعة وإرفاق محبس 1 - الطريقة (الشكل 6).
3. باستخدام ملاقط معقمة ، إزالة الشريحة الخلية المصنفة من الخلية سفينة الثقافة (أو في حالة استخدام القارورة الشريحة ، إزالة القارورة على الشريحة) ووضعه في عطلة على لوحة أسفل غرفة التدفق. تأكد من أن يتم وضع الشريحة مع الجانب الخلية المصنف مواجهة.
4. الماصة 10 مل من المتوسط ​​الدافئة EPC على الشريحة. تسمح وسيلة لتغطية شريحة وغرفة التدفق ، بالتحرير لا سفك متوسط ​​فوق يا الدائري في أسفل اللوحة.
5. مكان لوحة العلوي من الغرفة تدفق على لوحة أسفل ، محاذاة ثقوب المسمار. الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في الغرفة خلال هذه الخطوة عن طريق الحفاظ على لوحات خطين متوازيين.
6. لوحات المسمار معا (تلقائي بسرعة مفك يعمل بواسطة بطارية تصل هذه العملية).
7. إزالة فقاعات الهواء من فخ فقاعة تدفق بواسطة فتح محبس 1 - الطريقة التي تعلق على منفذ فخ فقاعة تدفق الجانبية وتدفق برفق مع أنابيب تدفق المتوسطة EPC باستخدام محقنة 10 مل. ثم أغلق تشغيل هذا محبس والأنكى من ذلك هو (الشكل 7).
8. الآن إزالة فقاعات الهواء من قناة الغرفة من خلال فتح منفذ في اتجاه تدفق 4 محبس والتنظيف بلطف EPC المتوسطة من خلال غرفة التدفق ، ومرة ​​أخرى باستخدام محقنة 10 مل. إذا فقاعات كبيرة لا تزال قائمة ، رفع في نهاية تدفق الغرفة إلى زاوية 45 درجة (الشكل 8).
9. قبعة كافة الاتصالات محبس 4 في اتجاه وثيقأجبرتها على الفرار. نقل غرفة تتدفق الحاضنة مع الدوائر تدفق تجميعها (الشكل 9).
10. إيقاف ضخ الدائرة التدفق. إغلاق الصمامات في الدوائر تتدفق في اتجاه التدفق لمنع التسرب وإبقاء داخل غرفة معقمة. نقل غرفة تدفق من غطاء تدفق إلى الدائرة التدفق. ربط الغرفة تدفق إلى الدائرة التدفق. فتح الصمامات في اتجاه التدفق. استئناف ضخ التدفق. ضمان تدفق سائل الإرواء في الاتجاه الصحيح. ضبط معدل تدفق للإجهاد القص المطلوب.
11. خلال التجربة تدفق ، يمكن إزالة غرفة التدفق من الدوائر لصورة الخلايا عن طريق الفحص المجهري أو ضوء الفلورسنت. من أجل القيام بذلك ، قطع تدفق دائرة من الدوائر في تدفق الاتصالات ، محبس محبس. للحفاظ على عقم الغرفة ، تغلق الصمامات دارة التدفق والصمامات غرفة التدفق في اتجاه التدفق والصمامات قبل كل غطاء لإزالة الدائرة تدفقمن الحاضنة (الشكل 9).

8. سائل الإرواء جمع العينات

1. سهل لجمع عينات للتحليل سائل الإرواء (مثل تخليق أكسيد النتريك) ، وقفة أولا المضخة.
2. إغلاق محبس يقع الأقرب إلى نبض يستمتع. إزالة الغطاء والحماية لادخال حقنة صغيرة الحجم ، مثل المحاقن مل 3 ، في منفذ العينة. ابقاء سقف وضمان أنها لن تصبح ملوثة بوضعه رأسا على عقب.
3. إغلاق محبس في اتجاه غرفة التدفق ، والحفاظ على العينات ومنفذ الدارة في اتجاه فتح يستمتع النبض.
4. تعادل المبلغ المطلوب من العينة ، على سبيل المثال 150 ميكروليتر من الحلبة. إغلاق محبس للعينة نحو الميناء قبل إزالة المحقنة. تخزين عينة سائل الإرواء في قارورة وصفت وتجميد في -- 80 درجة مئوية (من أجل تقرير أكسيد النيتريك في نقطة وقت لاحق).
5. خلاصة منفذ العينة والتأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة قبل الشروع التدفق.

9. ممثل النتائج

لدينا باستخدام طريقة سريعة البذور ، يمكن المصنفة الإنسان الدم الناجم عن الخلايا البطانية السلف على شرائح التيتانيوم لمدة 15 دقيقة والالتزام في إطار قوات (الشرايين) الفسيولوجية القص من 15 dynes / سم ^2.

كما هو مبين في الشكل 10 ، EPCs انتشرت تحت تأثير تدفق من 210 ± 11.4 ميكرون ² ، مباشرة بعد الغرس وإلى 657 ± 39.1 ميكرون ² بعد 3 ساعات ، وإلى 1152 ± 55.3 ميكرون ² بعد 24 ساعة من إجهاد القص السائل من 15 dynes / سم ² (الفرق بين الجماعات ذات دلالة إحصائية مع ع <0.0001 ، 1 - طريقة ANOVA). بالتوازي مع الزيادة في منطقة الخلية ، والتي يمكن تصويرها من خلال غرفة شفافة مع المجهر إما خفيفة أو الفلورية ، والاستدارة المحسوبة وفقا للمعادلة 2 ⁶

/ files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>

انخفض من 878 × 10 ^-3 ± 5.9 × 10 ^-3 ، مباشرة بعد الغرس وإلى 671 X 10 X 19.2 ± ^-3 10 ^-3 بعد 3 ساعات ، وإلى 526 X 10 X 19.2 ± ^-3 10 ^-3 بعد 48 ساعة التعرض للإجهاد القص نفس السائل (الفرق بين المجموعتين إحصائيا مرة أخرى مع ع <0.0001 ، 1 - طريقة ANOVA).

الشكل يوضح أن 11D EPCs ضبط وتوجيه في اتجاه التدفق بعد 48 ساعة من السوائل في إجهاد القص dynes 15 / ² سم بالمقارنة مع ميولهم عشوائي بعد فترة البذر ثابت من 6 ساعات ، كما هو موضح في الشكل 11A.

لدينا وسيلة تسمح أيضا للحصول على عينات من سائل الإرواء في نقاط محددة سلفا للوقت و / أو التحليل الكمي للالأيضات تفرز الخلية. كمثال ممثل أننا تصوير المنتجنشوئها من النتريت (NO ₂ --) خلال التجربة لمدة 48 ساعة مع تدفق EPCs الخنازير في الشكل 12. نحن تقاس مباشرة هذا المنتج الرئيسي للأكسدة أكسيد النيتريك (NO) كمؤشر بديل لNO في العينات التي تم جمعها من المتوسط ​​الدائرة التدفق في نقاط زمنية مختلفة لتكون 12.0 nmol في 6 ساعات ، 13.1 nmol في 12 ساعة ، و 16.3 في 24 nmol ساعة ، و 24.6 nmol بعد 48 ساعة للخلايا 1 × ⁶ 10 15 dynes / سم ^{2 6.}

الشكل 1. تخطيطي يظهر لمحة عامة عن تدفق التجمع الدوائر وتجربة التدفق. (أ) تجميع الدوائر دون تدفق غرفة التدفق. تضمين هنا هي الخزان ، يستمتع النبض ، وأنابيب الصلب وأنابيب لينة ، الصمامات 4 في اتجاه ومحولات luer متصلة ، فضلا عن تصفية الهواء. (ب) ربط غرفة تدفق عبر الأنابيب الجزء الصعب تدفق رأس المضخة. (ج) في sertion الشريحة EPC المصنفة في الجزء السفلي من لوحة دائرة التدفق (D). استكمال تجميع الدوائر تدفق مع الغرفة التدفق.

الشكل 2. دارة تدفق تجميعها بشكل كامل للتعقيم.

الشكل 3. تجميعها بعد تدفق الدائرة شملت التعقيم مع الصمامات.

الشكل 4. تعبئة خزان زجاجي مع 125 مل من المتوسط ​​EPC.

فرضت الشكل 5. تدفق الدائرة في تدفق رأس المضخة قبل الإدراج غرفة التدفق.

JPG "/>
الشكل 6. التجمع الأعلى لوحة الغرفة.

الرقم 7. فلاشينغ في فخ فقاعة مع EPC المتوسطة لإزالة الفقاعات من الجانب تدفق للغرفة.

الرقم 8. فلاشينغ الغرفة مع EPC المتوسطة لإزالة الفقاعات من الجانب الشريحة وتدفق للغرفة.

الرقم 9. تجميعها بشكل كامل مع الدوائر تدفق تدفق إدراج الغرفة خلال تجربة التدفق.

الرقم 10. EPC المنطقة (في ميكرومتر ²⁾ زيادة على مدار الساعة من التجربة التدفق.

files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
الرقم 11 : (أ) صورة الخفيفة مجهر EPCs HUCB المصنفة على شريحة الزجاج المطلي فبرونيكتين × 6 ساعات قبل أن تتدفق في التكبير × 100. (ب) HUCB EPCs المسمى مع منظمة السياحة القبرصية وسريعة المصنفة على شريحة تي × 15 دقيقة قبل أن تتدفق ، مع تصور المجهري نيون في التكبير × 100. (C) والشريحة نفسها مع تي EPCs HUCB وتحت (B) ، وبعد 3 ساعات من تدفق dynes عند 100 / سم ^{2 ،} والتقط من خلال غرفة شفافة في التكبير × 100. لاحظ اتجاه انتشار الخلايا ولكن لا تزال عشوائية بعد 3 ساعات من التدفق. (د) نفس الشريحة تي ، والآن بعد 48 ساعة من التعرض للتدفق في التكبير × 100. وصفت EPCs ملطخة مع منظمة السياحة القبرصية ونوى الخلايا مع صبغة هويشت (الأزرق) بعد التدفق. علما محاذاة الخلايا في اتجاه التدفق. (E) EPCs خنزيري للمقارنة على تي بعد 48 ساعة من تدفق dynes و 15 / سم

الرقم 12. رسم بياني يصور NO إنتاج EPCs الخنازير خلال 48 ساعة من التدفق. وقد تم قياس ، كمؤشر بديل لNO من عينات تم جمعها في نقطة متوسطة زمنية مختلفة خلال تدفق -- منتج الرئيسي للأكسدة NO والنتريت (NO _2).

الرقم (13) وقدمت غرفة تدفق من مخزون الألومنيوم 6061 سبائك مستطيلة ، مع القسم العلوي (أ) يجري 0.5 "× 2" س 7 "والقسم السفلي (B) 0.25" س 2 "× 7" في البعد. إن القمةمسوى على سطحه السفلي الاتصال يا الدائري إلى 0.45 "من أجل تأمين لختم التسطيح. هو راحة والجزء العلوي في جزء مركز ل0.125" ، الذي يترك 0.95 "في نهاية ل0.3125" خزان س "1،375 السائل ، و هي الخيوط الخزان القسم العلوي من 3/8-24 TPI و 0.25 "عميق لتلقي مترابطة المقابس الصلب المقاوم للصدأ. تم تشكيله فتحات قياس 1 / 16 "X 0.625" في الجزء السفلي التي تخترق إلى الخزان. قابس الجانب تدفق لديه 10/32 "من خلال ثقب لمادة البولي بروبيلين 1 / 8" خرطوم لاذع إرفاق محبس. نهاية كل وحدة لها موقعا مركزيا مترابطة 10/32 بنسبة 0.25 TPI "الجزء العميق لمادة البولي بروبيلين 1 / 8" خرطوم شوكة في نهاية 0.45 "س 2". نهايات استخدام 0.07 "ثقب من أسفل المواضيع من خلال لاختراق المكمن. السفلي من المقطع العلوي مدبب ومنطقة 0.6875" واسعة ، 0،518 درجة من وسط فتحة LH لمسافة 1.460 "، وهذا تفتق يمزج لمساحة الشقة 0.6875 "س اسعة 0.0118" عميقة و0.590 "من نهاية غلاسق (أو غيرها من السطح ، وشريحة التيتانيوم على سبيل المثال) عطلة. يجب أن تكون هذه الشقة تدفق مع الزجاج (أو أي سطح آخر ، على سبيل المثال شريحة التيتانيوم) مرة واحدة يتم تثبيت الشريحة. ومصقول وتفتق والمسطحة. سطح الشريحة 0.0118 "راحة من السطح السفلي ، و0.0118" عطلة تستمر الى فتحة الخزان في نهاية RH. وراحة ليا الدائري حول فتحات تماما وترك الشريحة 0.020 "من سطح الأصلي بين الأخدود يا الدائري والشرائح. يتم حفر الجزء العلوي والسفلي وحدات لمدة عشرة ثقوب ، والقسم العلوي مثقوبا لإزالة 8 / 32 شقة countersunk TPI مسامير الرأس ، والقسم السفلي وضعت مطابقة الثقوب الثقوب العلوية ومترابطة هي 8 / 32 TPI. أسفل وحدة وشريحة زجاجية واضحة تدفق النافذة راحة مع سطحه يقع على سطح الخلية الشريحة الزجاجية (أو الشريحة التيتانيوم) ، وحدة لديه الأخدود يا الدائري الذي يشمل فتحات في وحدة العرض إلى أعلى مع ترك 0.04 "لسطح الشريحة الأصلي بين القاع والداخلية تلم يا الدائري. وO - رينع حمراء سيليكون AS568A ، داش رقم 044 لأعلى الباب ، و046 للقسم السفلي.

Discussion

حلبة لدينا تدفق وتدفق الغرفة تسمح لنا موضوع الخلايا الملتصقة ، EPCs على سبيل المثال ، إلى تعريف اجهادات القص السوائل. منذ أعلى وأسفل حجرة ويمكن تقييم شفافة والتصاق الخلايا وإما التشكل في الوقت الحقيقي ، من خلال الغرفة نفسها ، أو بعد تجربة التدفق والتفكيك للغرفة التدفق. عند هذه النقطة ، يمكن حصاد الخلايا تحت ظروف معقمة ، وإما إعادة مطلي ، أو تستخدم لجمع عينات من الحمض النووي الريبي أو ، الخ ، لمزيد من التحليل.

من أجل تحقيق التدفق الصفحي ، يجب أن يكون تصميم الغرفة بحيث يكون استيفاء عدة شروط.

أولا ، يجب أن يكون التدفق الصفحي ، والتي يمكن التحقق منها عن طريق حساب في عدد رينولدز (ري) ، والتي هي نسبة القوى العاملة بالقصور الذاتي لقوى اللزوجة. (إذا تسود قوى اللزوجة ، وإعادة صغيرة والتدفق الصفحي أو "مكتمل النمو" -- عادة ل2300 <رع.اذا وجدت قوات بالقصور الذاتي تسود ، وتدفق يصبح أكثر وأكثر عشوائية حتى يتم المضطرب ، كما هو الحال بالنسبة ل 4000> رع.) ويمكننا حساب الدولة وفقا للمعادلة 3 ⁸ ،

حيث ρ هي كثافة السائل ، Q هي معدل التدفق ، μ هي اللزوجة ، ث ، ح والعرض والارتفاع للغرفة ، على التوالي ، ودال _ح هو القطر الهيدروليكي ، محددة وفقا لمعادلة 4 ⁸ ،

عدد رينولدز الغرف لدينا تدفق الثلاثة ، مع ارتفاعات تتراوح بين 166-267 ميكرون ، ومجموعة 13،9-34،6 في معدلات تدفق جalculated للحصول على إجهاد القص من 15 dynes / سم ^2. في معدلات التدفق المحسوب لإجهاد القص من 100 dynes / سم ² ، وتراوح عدد رينولدز الغرف 90،4-234. كل هذه الأرقام رينولدز هي أقل بكثير من 2300 وتلبية لمعيار تدفق الصفحي.

الثانية ، للحقل السرعة وإجهاد القص لتكون مستقلة عن المسافة على طول قناة تدفق (أي تطويره بالكامل) ، والمسافة من مدخل السائل إلى الشريحة يجب أن تكون أطول من طول المدخل ، L _ه. ويمكن استيفاء هذا عن طريق حساب طول المدخل ، وفقا لمعادلة 5 ^9.

للحصول على القيم المذكورة أعلاه ، وطول المدخل نطاقات 0،01-0،25 سم.

الثالثة ، من أجل ضمان سرعة وإجهاد القص في الاتجاه الجانبي لا تختلفبشكل كبير من القيمة لتدفق قناة واحدة الأبعاد (Δ فتاه / 2L) ، يجب أن نسبة ح / ث تكون أقل بكثير من 1. لإجهاد متوسط ​​جدار القص في ظل ظروف تدفق ثنائي الأبعاد لتكون 95 ٪ من الجدار تحت إجهاد القص أحادية البعد التدفق ، ويجب ح / ث مساوية إلى 0.10 ، وبالنسبة للإجهاد القص الجدار تحت ظروف تدفق ثنائي الأبعاد إلى أن 97.5 ٪ من إجهاد القص الجدار تحت أحد الأبعاد التدفق ، يجب ح / ث مساوية 0.05. مع أبعاد الغرفة المصممة لدينا تدفق 1.7 سم في العرض و 166-267 ميكرون في الطول ، ويتم استيفاء هذه المعايير.

فإن الضغط تختلف فقط في اتجاه تدفق إذا لم تكن هناك تدرجات الضغط الجانبي عند المدخل. ويمكن تقييم ذلك باستخدام الأصباغ أو جزيئات في مسار التدفق. مزيد من التجارب لتدفق مستمر ، يتم إدراج يستمتع نبضة في الدائرة التدفق. ويستمتع نبض تحيط بها أكثر من النبضتسبب atility بواسطة المضخة الدوارة في الدائرة ، ويتيح لنا الاقتراب من افتراض وجود تدفق مستمر. من المذكرة ، يجب أن يستمتع نبض المستخدمة تكون متوافقة مع المضخة والأنابيب المستخدمة في الدوائر ، بحيث يمكن القضاء على نحو فعال في تدفق نبضات الإخراج للترددات محددة من المضخة الدوارة. في مظاهرة لدينا L / S Masterflex نبض يستمتع يحقق التدفق الصفحي عند استخدامها على خط التصريف مع أي سلسلة Masterflex مضخة L / S (0-600 اللفات في الدقيقة) وأنا / P أنابيب 26. لتدفق نابض ، يمكن استخدام مضخة للبرمجة لتوليد الموجات المختلفة.

لتدفق نابض ، يمكن استخدام مضخة للبرمجة لتوليد الموجات المختلفة.

ويمكن بسهولة علاوة على ذلك ، تم تصميم هذه الدائرة أن عينات من سائل الإرواء سيتم جمعها في نقطة زمنية مختلفة دون المخاطرة تلوث الخلايا أو متوسطة التدفق. في مثالنا ، وتركيز NO ₂ -- كان يقاس مع لمعان كيميائيan شركة Ionics / سيفرز محلل أوكسيد النتريك (NOA 280 ، آلات سيفرز ، بولدر ، كولورادو) كما هو موضح سابقا ^10. كان اختزال المستخدمة لتحليل النتريت يوديد البوتاسيوم في حامض الخليك (حامض الخليك 14.5 م و 0.05 م KI) ، والذي لديه القدرة على تحويل النتريت خفض إلى NO لكنها غير كافية للحد من أي ارتفاع أكاسيد النيتروجين مثل النترات وبالتالي نسبيا محددة للنتريت. تم احتساب النتريت إجمالي الكمية التي أنتجها بوصفها نتاجا لتركيز المنتجة وإجمالي حجم الدائرة لحين تعديل حجم بينما خسر أخذ عينات ^6.

الخطوات التالية هي الحاسمة للتنفيذ الناجح من التجارب التدفق :

1. فمن المستحسن تجنب تشكيل فقاعة خلال تدفق إنشاء ، منذ فقاعات لديها القدرة على تمزيق الخلايا من سطحها. ويمكن تجنب ذلك عن طريق أخذ الحذر عند وضع الجزء العلوي من الغرفة التدفق على الجزء السفلي ، والذي هو أفضلالذي أنجزه كل من حفظ موازية لبعضها البعض وخفض أعلى على الجزء السفلي في اقتراح واحد من دون تعديلات. في القيام بذلك ، وفقاعات الهواء الصغيرة التي قد تكون موجودة و / أو طافية في قناة التدفق ، سيتم تحويلها في حبائل فقاعة على حد سواء من السكن الألومنيوم.
2. فمن المهم لضمان تدفق أنابيب في الخزان تصل الى قاع الخزان. خلاف ذلك ، قد يكون امتص الهواء في الأنبوب الذي يؤدي إلى الغرفة من الخزان إذا كان مستوى سائل الإرواء يقع أقل قليلا في نهاية الأنبوب.
3. يجب على الباحث أن يكون على دراية اتجاه تدفق المضخة بحيث لا يتم تشغيل المضخة عن طريق الخطأ في الاتجاه المعاكس عند بدء التدفق ، والتي من شأنها أن تؤدي إلى الوقوع في دائرة الهواء والغرفة.
4. لتجنب تشكيل رغوة (بسبب التشويه والتحريف الوارد في بروتينات مصل) ، فإننا ننصح خفض الأنبوب الذي يؤدي إلى الغرفة من الخزان إلى حوالي بوصة واحدة فوق perfusaالشركة المصرية للاتصالات على مستوى داخل الخزان. ومع ذلك ، تنزيهه عن تدفق المستوى المتوسط ​​يسمح لك للتحقق من تدفق إلى الخزان أثناء التجربة.
5. عندما الشد أجزاء الغرفة معا ، فمن المهم أن نتشبث السكن بيد واحدة بينما تعمل على مفك كهربائي مع يدك الأخرى. علما أن تترجم على اقتراح من مفك كهربائي في عزم الدوران الذي لديه القدرة على 'قذف الغرفة حول" بمجرد تشديد المسمار.
6. لتجنب أي ضغط من موجات يتشكل في الدائرة ورفع قبالة خلايا سطحها ، وضمان أن جميع الصمامات مفتوحة قبل بدء التدفق.
7. وخاصة بالنسبة للدراسات التدفق على المدى الطويل (> 48 ساعة) ونحن نوصي باستخدام أنابيب أصعب وأكثر مرونة ليتم إدراجه في رأس المضخة لمنع كسر الأنابيب.
8. فمن الممكن أن أنابيب "يهاجر" داخل الرأس بسبب ضخ لسوء تعديلها الأسنان رئيس المضخة. لذلك نقترح إيلاء اهتمام وثيق لكيفية الحوضجي هو المضمون في الرأس ووضع العلامات لكل مضخة نهاية الأنبوب بالقلم بمناسبة بحيث يمكنك بسهولة إذا لاحظ هو 'سحبت في" الأنبوب أو فكها أثناء التجربة.
9. دائما الاختيار بعناية كل موصل واحد من الدائرة والغرفة قبل بدء نضح من أجل منع تسرب سائل الإرواء خلال تجربة بسبب اتصال خاطئ. هذا هو المهم وخاصة بالنسبة للموصلات تدفق وتدفق dampeners نبض!
10. تذكر للحد من التعرض للضوء إذا كنت تستخدم تسميات الفلورسنت.

وإمكانية تحديد غرفة تدفق لدينا هو أن يتم إصلاح ارتفاع من طول القناة تشكيله في الألومنيوم. ومع ذلك ، وهذا له ميزة عدم الحاجة لإثبات وضبط ارتفاع القناة قبل كل تجربة وبالتالي يبسط الحسابات إجهاد القص من خلال تعديل مجرد تدفق المضخة إلى القيمة المطلوبة. اعتمادا على أهداف البحث الخاصة بك ، قد يكون من المرغوب فيهزيادة إجهاد القص دون زيادة سرعة المضخة. في هذه الحالة نوصي زيادة اللزوجة وسائل الإرواء ، وعلى سبيل المثال إضافة إلى ¹¹ ديكستران المتوسط.

وإمكانية تحديد الدائرة هو تدفق كمية كبيرة من الوسيلة المستخدمة ، والتي يمكن أن يكون مشكلة عند محاولة تحديد تركيزات صغيرة جدا من الأيضات الخلية. وإن لم يكن هو موضح هنا ، فمن الممكن لإجراء تخفيض كبير في حجم الدائرة باستخدام أصغر الخزان ويستمتع النبض وانخفاض طول الأنبوب وقطر.

بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من النظم الأخرى المتاحة تجاريا التي يمكن استخدامها لتطبيق إجهاد القص السائل إلى خلايا في الثقافة. ميكروفلويديك النظم القائمة ، مثل نظام BioFlux من الجريان ، وتمكين تحليلات متزامنة من الخلايا في مختلف قنوات تدفق ميكروفلويديك محملة الحل في لوحات جيدا بوصفها مدخلات الانتاج والخزانات لهذه القنوات ^12،13،14. ومع ذلك ، هذه وغيرها من الدقيقةfluidic نظم غير متوافقة مع شرائح المجهر القياسية وعدم السماح لاسترداد عدد كبير من الخلايا بما فيه الكفاية لمزيد من التجارب ، مثل RT - PCR أو البقعة الغربية. كذلك ، فهي أقل استعمالا ، والتكلفة لا تقل عن 40000 $ وربما تصل إلى ما مجموعه أكثر من $ 100،000 ، اعتمادا على المعدات الملحقة.

وقد نظامان macrofluidic المتاحة من المؤسسة الدولية Flexcell ، واللحظية Flexcell ونظم FlexFlow ، استخدمت بنجاح في دراسة الخلايا البطانية ^15،16،17 ، خلايا الحلقة ¹⁸ و ¹⁹ الليفية تحت ظروف تدفق السوائل. وقد استخدم نظام ثالث ، المتوفرة عبر GlycoTech ، لدراسة التصاق الخلايا السرطانية والالتصاق ²⁰ الكريات البيض من ²¹ إلى monolayers البطانية.

نظام اللحظية يسمح بتشغيل العديد من الشرائح في ظل ظروف إجهاد القص نفسه في آن واحد ، لكنه يفتقر الى نافذة عرض و-- خلافا لديناتصميم -- لا يسمح في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا تحت التدفق.

نظام FlexFlow لها نافذة عرض ، ولكن يتطلب المجهر تستقيم ، والتي قد لا تكون المجهر القياسية المستخدمة في معظم المختبرات. كذلك ، فإن النظام يتطلب FlexFlow زلة غطاء الخلية المغلفة لتكون معكوسة عند وضعه في غرفة التدفق. هذا التصور يمنع من الخلايا الفلورسنت على سطح معتم ، مثل التيتانيوم والزجاج المطلي ، والتي تثبت أننا في دراستنا. أخيرا ، ينزلق تغطية الحاجة المتخصصة التي سيتم شراؤها خصيصا لنظام FlexFlow ، الذي هو في نطاق سعري متعدد ألف دولار ، على غرار نظام Flexcell اللحظية.

GlycoTech عروض دائرية ومستطيلة غرف تدفق موازية لوحة ، والتي هي أقل تكلفة بكثير ، ولكن المصنوعة من الاكريليك الزهر التي لا يمكن تعقيمها بسهولة الجذعية مثل غرفة لدينا. من الملاحظة ، وغرف تدفق الأخرى التي تم وصفها لتكون autoclavableيبدو غير عملي لأنها تتطلب العدسات المجهرية الخاصة ^22،23. ويستخدم نظام GlycoTech جوانات المطاط والسيليكون لوحات يتوسطون بين العلوي والسفلي ، والتي سوف تغير في سمك مع الاستخدام المتكرر ، وبالتالي تغيير ارتفاع الغرفة مع مرور الوقت (الشركة المصنعة توصي بشراء جديدة يستخدم بعد كل عشرة). غرفة الألومنيوم مع المدمج في طوقية يسمح للمعارضة كاملة من لوحات العلوية والسفلية ويضمن الارتفاع المستمر بين غرفة التجارب. أخيرا ، ومضخات الفراغ التي تكون ضرورية لتحقيق ختم مانعة للتسرب في العديد من التصاميم غرفة التدفق ، بما في ذلك غرف GlycoTech ، والتي ليست ضرورية في التصميم لدينا.

في حين لم تظهر هنا ، يمكن الاحتفاظ غرفة التدفق تحت المجهر خلال التجربة تدفق بأكمله في الوقت الحقيقي التصوير من التصاق الخلية و / أو السلوك. إذا كان هذا هو المطلوب ، ونحن نوصي باستخدام مصابيح الحرارة أو وسادة ساخنة تحت غرفة للحفاظ على درجة حرارة سائل الإرواء في 37 درجة مئوية. فروهناك ، يمكن الاستعاضة عن المضخة الدوارة مع مضخة الحقن ، إذا كان المطلوب لا 'تدوير' إما من الخلايا أو الأيضات الفحص أو المخدرات أو وكلاء ^24.

فمن الممكن أيضا أن تدفق الخلايا المسماة الخلايا بشكل مختلف خلال ملتصقة ، مثل الصفائح الدموية الفلورسنت أكثر من طبقة من EPCs متموجة (باستخدام مقايسة الصفائح الدموية التي وصفها Achneck آخرون ^6،25) لتقييم خلية الى خلية التفاعل تحت إجهاد القص السوائل. قاعتنا تدفق يجمع بين ميزات أخرى ثمينة من تدفق الغرف المتاحة ، مثل منفذ سائل الإرواء أخذ العينات ونافذة عرض ويحتوي على ميزة هامة من التوافق مع المجهر an إما مقلوب أو في وضع مستقيم. فمن autoclavable بالكامل ويسمح للتجارب متكررة في ارتفاع مستمر وغرفة من دون الحاجة للمضخات الفراغ لتحقيق ختم مانعة للتسرب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Cole-Parmer	07940-12
1-Way Stopcoks	Cole-Parmer	30600-00
30 ml Syringe	BD Biosciences	309650
4 -Way Stopcocks	Cole-Parmer	30600-04
Aluminum Alloy	N/A	6061
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	267061
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
DMSO	Research Organics	2162D
DPBS (-/-)	Invitrogen	14190-144
EGM-2 Singlequots	Lonza Inc.	CC-4176
Female Luer Adaptor	Cole-Parmer	SI-45500-04
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-2MG
Glass Bottle (250ml) with Cap	Cole-Parmer	34594-24
Hard Tubing	Cole-Parmer	06508-16
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Histopaque	Sigma-Aldrich	H8889-500ML
H–chst Stain Solution	Sigma-Aldrich	H6024
Hyclone FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30071.01
L-glutamine	Lonza Inc.	17-605E
Male Luer Adaptor	Cole-Parmer	EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium	Cellgro	15-100-CV
Barbed Polypropylene Fittings	Cole-Parmer	06365-90
O-Rings	N/A	AS568A
Pulse-Dampener	Cole-Parmer	07596-20
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive)	Cole-Parmer	7524-40
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head)	Cole-Parmer	07518-60
Slide	Cole-Parmer	48500-00
Soft Tubing	Cole-Parmer	96400-16
Syringe filter	Cole-Parmer	02915-12
Sytox Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S-11368
Trypsin EDTA	Lonza Inc.	CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza Inc.	CC-5002