Summary
Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.
Abstract
Bu yöntemin genel amacı, yapışık hücrelere laminer akış koşullarına tabi ve iyi ölçülebilir sıvı kesme 1 vurguluyor tepki değerlendirmek için bir tekniği tanımlamaktır .
Bizim akış odası tasarımı ve akış devresi (Şekil 1) (Şekil 11C) akış sırasında çeşitli zaman noktalarında (Şekil 11A, B) akış önce hemen hücre morfolojisi hücre yapışması ve görüntüleme testleri sağlayan şeffaf bir görüş bölgeyi içeren ve sonra akışı (Şekil 11D). Bu deneyler, insan göbek kordonu ile gösterilmiştir kan elde edilen endotelyal progenitör hücreleri (EPC) ve domuz EPC 2,3.
Bu yöntem aynı zamanda diğer yapışık hücre tipleri, örneğin düz kas hücreleri (SMC'lere) veya fibroblastlar için geçerli.
Odası ve devrenin tüm parçaları kolayca buhar otoklav ile sterilize edilir. Buna karşılık diğerodaları, örneğin mikroakışkan odaları, hücreleri (hücre büyüklüğüne göre 1 milyon), çok sayıda, hücre kültürü veya diğer deneyler, örneğin, DNA veya RNA ekstraksiyonu, ya da immünhistokimya (Şekil 11E) steril koşullar altında akış deney sonucunda kurtarıldı. ya da tarama elektron mikroskobu 5 . Kayma gerilmesi perfüzat, akışkanın viskozite, veya kanal yükseklik ve genişlik debisi değişen ayarlanabilir. Tek boyutlu akış muhafaza edilmesini sağlarken ikincisi sıvı hacmi ya da hücrenin ihtiyacı azaltabilir. Odanın yüksekliği büyük ölçüde birden fazla deneyler kolaylığını artırır conta kullanımı, bağlı değildir, çünkü deneyler arasındaki oda yüksekliğini ölçmek için gerekli değildir. Ayrıca, devre tasarımı, kolayca analiz ve / veya sıvı kayma gerilmesi pozlama altında hücreleri tarafından salgılanan metabolitlerin ölçümü, örneğin nitrik oksit (Şekil 12) 6 perfüzat örneklerin toplanmasını sağlar
Protocol
1. Endotelyal progenitör hücre izolasyonu
- Periferik insan kanı herhangi bir tahsilat önce araştırma protokolü, Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) göndermek ve onun onayı alındıktan sonra, gönüllü donörlerin almak 'bilgilendirilmiş onam (periferik kan toplama ve EPC izolasyon ve Duke Üniversitesi IRB tarafından onaylanmıştır insan araştırmaya katılanların korunması ile ilgili) ABD düzenleyici gereksinimleri ile tam bir uyum içinde.
- Hayvansal kaynaklı EPC ile çalışırken, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan araştırma protokolü Komitesi (IACUC) kullanın. Tüm porcine deneyler Duke Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır ve insancıl bakımın en yüksek standartlara uygun olarak yapılmıştır.
- Endotelyal progenitör hücrelerin izolasyonu için razı bir gönüllü donör standart flebotomi tekniği ile antikoagülan Sitrat ile dolu kan toplama torbaları içine 50 ml periferik kan toplamake fosfat dekstroz ve Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 1:1 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 hariç) ve Histopaque eşit hacimlerde katman iyi tanımlanmış katmanlar oluşturmak için çözeltinin.
- Santrifüj (30 dk, 740 g, düşük bir kırılma ayarı) ve mononükleer hücre (MNC) (buffy coat) katmanı toplamak. Tam EPC büyüme orta iki 12-iyi tabak içine kaplama öncesinde yeniden süspanse edin ve Dulbecco'nun Fosfat yıkama ÇUŞ'larının x 3 (MCDB-131 orta 5 ile% 10 Fetal Bovine serum (FBS) x 10 dakika, 515 gr (DPBS) Tuzlu Tamponlu 37 ml 200 mM L-glutamin,% 10 FBS ve EGM-2 SingleQuots) ° C,% 5 CO 2.
- Yavaş yavaş daha sonra ilk 7 gün, her gün için her 24 saatte bir, orta değiştirin. EPC koloniler, arnavut kaldırımlı morfolojisi dayalı bir ortalama süre 14 gün sonra tespit edilebilir. 12-iyi bir yüzey alanı kültür kapak ¼ EPC, hücreleri genişletmek ve yüzey belirteçlerinin varlığı için test sitometrisi ile EPC kimliğini onaylamakCD31 ve CD14, CD45 yokluğu daha önce 6 açıklandığı gibi. Diğer testleri yapılabilir hücre morfolojisi ve DII-Ac-LDL ile etiketleme.
- Burada anlatılan deneyler yaklaşık 37 nemlendirilmiş bir inkübatör EPC orta 3 T-75 hücre kültürü şişeleri konfluent kadar izole EPC genişletin ° C,% 5 CO 2.
2. Kesme gerilmesi hesabı
- Biz bu hesaplamaları elde edilebilecek koşullarının bir anlayışa sahip odası ve kanal imalat önce yapılır öneririz. Istenilen kesme devresinde perfüzat akış oranını hesaplayın, denklem 1 1 göre hücrelere uygulanacak vurgulamaktadır
Q istenen akış hızı nerede, τ hedef shücreleri üzerinde stres teğet hareket duymak, akış odasının genişliği w, h, akış odasının yüksekliği ve μ perfüzat (akış orta) viskozite .
- Kullanılan orta tipik bir viskozite değeri (μ) 0.9 cP (0.009 g cm -1 s -1). Viskozite de bu yüzden 7 istenirse, yüksek molekül ağırlıklı dekstran kullanarak gündeme olabileceğini unutmayın. Tipik bir hedef kayma gerilmesi değeri (τ), fizyolojik üstü kayma stres isteniyorsa, 15 dynes / cm 2, (tipik arter kayma gerilmesi) veya 100 dynes / cm 2 kullandı . 267 mikron - Odamızca genellikle 166 aralığında, 1.9 cm ve yüksekliği (h) bir genişliği (w) vardır .
3. Akış odasına üretim
- Kesme inci alt ve üst plakalar7 x 2 x 0.5 "7 x 2 x 0,25 ve alt boyutlar" üst boyutu ile alüminyum alaşım 6061 dikdörtgen e odası.
- Recess sonunda ortalama 0.125 1.375 "genişlik x 0,3125" derin sıvısı deposu için "derin, 0.950 bırakarak" orta kısmında üst plakası.
- Alt 1 / 16 "genişlik x 0.625" uzun yuvaları, giriş ve çıkış uçları rezervuar nüfuz için delin.
- Sonunda her bir üst plaka, sıvı rezervuar nüfuz hortum barbus merkezi bir 10/32 "polipropilen 1 / 8 inç başına parça (TPE) delik" delin. Girişinin sonunda, "polipropilen 1 / 8 delikten TPE" hortum barbus 10/32 ile yan fiş oluşturmak.
- 0,518 derece sıvı karışım yeterli sıvı girişi cam görüntüleme penceresi Konik üst alt.
- Içine bir bardak slayt penceresinin üst görüntüleme penceresi doğrultusunda alt plaka kesin. Odasına akvaryum çimento, yapıştırıcı bir cam slayt kullanma. En az 24 saat süreyle tedavi etmek için izin verin.Izleme penceresi, 75 x 25 x 1 mm mikroskop cam slayt odasında gömme oturup o kadar gömülü olduğu olun.
- "0.02 arayla olduğu gibi alt ve üst plakalar alt etrafında bir O-ring için bir oyuk oluşturun. Lastik O-ring yerleştirin.
- Düz başlı vidalar "8 / 32 ile kullanım için alt ve üst odaları TPE delikler" 10 uyan 8 / 32 delin.
4. Akış devre montaj
- Önce tüm akım devresi birleştirin, daha sonra kendi sterilizasyon ile devam edin.
- "(Bağlantı darbe dampener bir ucundan 1 / 8 ile) sabit boru segmentinde" 36 takın. Diğer ucunu için, yumuşak bir boru 18 "segmentinde takın.
- Adım 4.2 'de belirtilen yumuşak tüp bölümü 1 / 8 "(18) sonunda erkek luer adaptör," yerleştirin. 1 / 8 erkek luer Bağlan "kadın döner adaptör yeni bir 18 dişi luer takın" segment yumuşak bir tüp.
- Tüp sığdırmak için 250 ml cam beher kap içine üç delik delin. Benbir delik ve serbest uçları, 250 ml cam şişe (rezervuar) (Şekil 2) içine kap içinde diğer 2 deliklerden sert ve yumuşak tüp içine yumuşak bir boru 1.5 "segmentinde nsert (hava havalandırma gibi ). sert boru (rezervuar çıkışı boru), rezervuarın alt ulaştığı olun.
- 121 ° C'de 60 dakika buhar otoklav ile yukarıdaki parçaları sterilize. Ayrıca, otoklav bir tam akış odası, 3 x 2 Luer adaptörü, 4 x ½ "segmentleri yumuşak hortum, 1 erkek ve 1 kadın 1 / 8" ve 6 x 5 / 16 "8-32 düz başlı vida, cımbız, 1 çift , bir 75 x 25 x 1 mm cam slayt (ya da istenen başka bir hücre yüzey malzemesi), ve 2 cerrahi havlu.
- Laminer akış kaputun içine steril havlu yerleştirin. Bu steril sahaya akım devresi, akış kamara, 4 x 4-yönlü stopcocks, 1 x 1-yönlü stopcock ve 4.5 adım tüm steril parçalar yerleştirin.
- Şimdi iki 4-yol stopcocks bağlamak için steril eldiven kullanın. Kapakları açık örnek limanları Yeri. Akım devresi iki yumuşak boru bölümleri ekleyerek, erkek ve dişi luer adaptörleri çıkarın ve bağlı stopcocks (Şekil 3) takın.
- 30 ml şırınga rezervuar içine takılan yumuşak boru takın ve şırınga pistonu kaldırmak. EPC orta (Şekil 4) 125 ml şişe doldurun.
- Steril bir şırınga filtre havalandırma (Şekil 4) içine yerleştirin.
- 37 nemlendirilmiş bir inkübatör içine akım devresi Taşı ° C,% 5 CO 2.
- Sabit boru, boru bu tür (Şekil 5) ile kullanmak için belirtilen roller pompa kafası içine sıkıştırın . Boru roller pompa montaj parçaları ile üst üste gelmez emin olun. Hortumun Mark nerede bir işaretleme kalemi ile her iki tarafında pompa kafası çıkar.
- Tüm stopcocks örnek limanlarına doğru yola kapalı olduğundan emin olun ve akım devresi boyunca açık. Pompayı başlayın. Akış yönünü kontrol edin. Perfüzat fr hareket etmelidirom darbe tav içine sabit hatlar aracılığı ile cam rezervuar.
5. EPC floresan etiketleme
- Akım devresi ısıtır 37 ° C, slayt üzerine tohum hücreleri hazırlarken. Hücreleri opak malzemeler, örneğin titanyum (Ti) görüntülenebilmekte, floresan etiketleme gerekli olduğunu unutmayın.
- 90 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ile seyreltilmesi ile 50 mikrogram CTO toz Hücre Tracker Orange (CTO), 1 mM stok solüsyonu oluşturun. Işığa maruz kalma (akış kaputunun altında çalışırken ışık söner) bu karışımı kalkan emin olun.
- 18 ml serum serbest MCDB-131 orta CTO stok solüsyonu 36 ul seyreltilmesiyle CTO 2 mcM çalışma çözüm oluşturun.
- Konfluent T-75, 10 ml DPBS (Ca ve Mg olmadan) hücre kültürü şişeleri yakın 3 EPC durulayın.
- Her balona 2 mcM CTO çalışma çözümü 6 ml ekleyin. 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° C 10 ml DPBS (Ca ve Mg olmadan) Her balona x 2 durulayın.
- 600g ve tekrar süspansiyon santrifüj EPC orta 5 ml x 5 dakika yıkayınız.
6. Odamız meclisinin akış önce slayt Hücre tohumlama
- Cam, titanyum, ya da diğer malzemelerin yapılmış bir slayt ve slayt yüzeyi polimer ile spin kaplama ile değiştirilmiş ya da metal bir tabaka ekleyerek olabilir. Slayt dört odacıklı steril bir dikdörtgen hücre kültürü gemi (ya da polistren yüzey isteniyorsa kullanımı doku kültürü slayt şişesi) içine yerleştirin. EPC orta x 6 saat 5 ml konfluent bir hücre katmanı, akış başlatılması (Şekil 11A) isteniyorsa slayt üzerine, hücreler ve tohum 1.5 x 10 6 hücre Kont.
- Yayılan hücre ve yapışma sıvı kayma stres altında test etmek için, 3 x 10 6 hücre akışı başlamadan önce (hızlı-ekim) sadece 15 dakika için uyması izin (
7. Akış odamız meclisinin
- Steril eldiven kullanarak, kadın döner adaptör "yumuşak boru segmentinde 1 / 8" bir 2 takın. Erkek luer adaptörü başka bir 2 "1 / 8 yumuşak boru segmentinde" bağlayın.
- "Yumuşak boru girişi bağlantı noktasına kadın döner adaptör ile 2 takın" 2 takın erkek luer yumuşak boru çıkış portuna. 4-yol stopcocks bu luer adaptörleri de takın. Kalan 2 "yumuşak bir boru parçası balonu tuzak çıkıyorsa yan port konnektörüne bağlayın ve 1-yönlü stopcock takın (Şekil 6).
- Steril bir pens kullanarak, hücre kültürü gemi (ya da bir slayt şişesi kullanarak, slayt balon kaldırmak), hücre numaralı seribaşı slayt kaldırmak ve akış odasının alt plaka üzerinde girinti içine yerleştirin. Slayt hücre numaralı seribaşı yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
- Slayt üzerine sıcak EPC orta pipetleyin 10 ml. Orta slayt ve akış odası, b karşılamak için izin verinut alt plakası O-ring üzerinde orta dökmeyin.
- Vida deliklerini hizalayarak alt plakası üzerine akış odasının üst plaka yerleştirin. Iki tabak paralel tutarak bu adımı sırasında odasına hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin.
- Birlikte Vida levhalar (bu işlemi otomatik olarak pille çalışan bir tornavida hızları).
- Girişi kabarcık tuzak girişi tarafında baloncuk tuzak bağlantı noktasına bağlı 1-yönlü stopcock açarak içindeki hava kabarcıklarını çıkarın ve yavaşça girişi tüp 10 ml şırınga kullanarak EPC orta ile yıkayın. Sonra bu valfli ve bu kap (Şekil 7) kapatabilir.
- Şimdi, 4-yönlü stopcock çıkış portu açarak ve yavaşça 10 ml şırınga kullanarak tekrar akış haznesinden EPC orta kızarma oda kanal içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. Büyük kabarcıkları kalırsa, 45 derecelik bir açıyla (Şekil 8) odanın çıkış ucunu yükseltmek.
- Cap 4-yönlü stopcock bağlantıları ve yakınonları. Monte akım devresi (Şekil 9) inkübatör içine akışını odasına taşıyın.
- Akış devresi pompası Pause. Kaçağı önlemek ve odanın içine steril tutmak için akış yönünde akış devre stopcocks kapatın. Akım devresi akışını kaput akışını odasına taşınması. Akım devresi akışını odasına bağlayın. Akış yönü stopcocks açın. Akış pompası devam edin. Perfüzat doğru yönde akar emin olun. Istenen kayma gerilmesi akış hızını ayarlayın.
- Akışını deney sırasında, ışık veya floresan mikroskobu ile görüntü akışını odasının devre hücreleri kaldırıldı olabilir. Bunu yapmak için, stopcock-valfli bağlantıları akım devresi akışını odası bağlantısını kesin. Odanın sterilite korumak için, akış yönünde akış devre stopcocks ve akış odası stopcocks kapatabilir ve akım devresi çıkarmadan önce bütün stopcocks kapinkübatör (Şekil 9).
8. Perfüzat örnek toplama
- Kolay toplama, analiz için perfüzat numuneler (örneğin, nitrik oksit sentezini), ilk pompa duraklatmak için.
- Darbe tav yakın bulunan stopcock kapatın. Koruyucu kapağı çıkarın ve küçük boyutlu bir şırınga, örneğin 3 ml şırınga, örnek portuna takın. Kap tutun ve ters yerleştirerek kirlenebilir olmayacak sağlamak.
- Darbe dampener açık yönde örnek liman ve devre tutarak, akış odasının yönünde stopcock kapatın.
- Devre örnek istenilen miktar, örneğin 150 ul çizin. Şırıngayı çıkarmadan önce örnek limana doğru stopcock kapatın. 80 ° C (nitrik oksit belirlenmesi için daha sonraki bir zaman noktasında) - etiketli şişe ve dondurma perfüzat örnek saklayın.
- Recap örnek bağlantı noktası ve tüm stopcocks başlamadan önce açık olduğundan emin olun akar.
9 - Temsilcisi sonuçları
Insan kan endotel progenitör hücrelerin hızlı tohumu yöntemi kullanarak, 15 dakika boyunca titanyum Slaytlarınıza numaralı seribaşı ve 15 dynes / cm 2 fizyolojik (arter) kesme kuvvetleri altında uymak olabilir.
Şekil 10'da gösterildiği gibi, EPC 657 tohumlama hemen sonra, 210 akış etkisi ± 11.4 mikron 2 altında yayılmış, 3 saat sonra ve 1152 ± 39.1 mikron 2 ± 55.3 mikron 2, 15 akışkan kayma gerilmesi, 24 saat sonra dynes / cm 2 (gruplar arasındaki fark p <0.0001, 1-yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak anlamlı). Hücre alanı, ışık veya floresan mikroskobu ile şeffaf oda üzerinden görüntülü olabilir artmasına paralel olarak, yuvarlaklık denklemi 2 6 göre hesaplanır
/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>
878 x 10 -3 ± 5.9 671 x 10 -3, tohumlama hemen sonra, x 10 -3 ± 19.2 x 10, 3 saat sonra -3, ve 526 x 10 -3 ± 19.2 x 10 -3 sonra 48 saat azaldı Aynı sıvı kayma gerilmesi maruz kalma (gruplar arasındaki fark, p <0.0001, 1-yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak anlamlı ).
Şekil 11D EPC 15 dynes / Şekil 11A gösterilen statik tohumlama süresi, 6 saat sonra kendi rastgele yönlendirmeye göre 2 cm sıvı kayma gerilmesi 48 saat sonra akış yönü hizalayın ve şark göstermektedir.
Bizim yöntemi de perfüzat örnekleri analiz ve / veya salgılanan hücre metabolitleri ölçümü için önceden belirlenen zaman noktalarında elde etmek için izin verir. Temsili bir örnek olarak biz üretimi tasvirŞekil 12 domuz EPC ile 48 saat akış deney sırasında nitrit ğünü (NO 2). Biz doğrudan doğruya, 6 saatte 12.0 nmol, 13.1 nmol 12 saat, 24 16.3 nmol akım devresi için farklı zaman noktalarında toplanan orta örneklerinde NO için bir belirteç olarak ölçülen nitrik oksit (NO) bu birincil oksidasyon ürünü saat ve 15 dynes / cm 2 6 1 x 10 6 hücre için 48 saat sonra 24.6 nmol.
Şekil 1 akım devresi montaj ve akış deney gösteren şematik bir bakış. (A) akış kabinsiz Akış devre montajı. Rezervuar, darbe dampener, sert tüp, yumuşak boru, 4-yönlü stopcocks ve bağlı döner adaptörleri, hava filtresi gibi burada dahildir. (B), akış pompa kafası sabit boru segmentinde üzerinden akış odasına bağlanması . (C) akışını odası (D) alt plakasına EPC numaralı seribaşı slayt sertion. Akış odasına akım devresi montaj tamamlayın.
Sterilizasyon için Şekil 2 Tamamen monte akım devresi.
Şekil 3. stopcocks ile sterilizasyon Montajlı akım devresi sonra.
Şekil 4, 125 ml EPC orta cam rezervuar Dolum .
Şekil 5. Akış devre akış odasına ekleme önce akış pompa kafası içine kelepçeli.
jpg "/>
Şekil 6. En oda plakalı.
Şekil 7 odasının girişi tarafında kabarcıklar çıkarmak için EPC orta balonu tuzak Flushing.
Şekil 8, slayt ve odanın çıkış tarafında kabarcıklar çıkarmak için EPC orta odasının Flushing .
Şekil 9, bir akış deney sırasında takılı akış odasına tamamen akım devresi toplandı .
Şekil 10 EPC alanı (2 mikron) akış deney süresi boyunca artar.
files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
Şekil 11 (A) HUCB EPC Işık mikroskop görüntü 100 x büyütme akışı x 6 saat önce fibronektin kaplı cam slayt üzerine numaralı seribaşı. (B) HUCB floresan mikroskobu ile görüntülendi, 100 x büyütme üzerine CTO ve hızlı numaralı seribaşı Ti slayt akışına önce x 15 dakika ile etiketlenmiş EPC. (C) HUCB EPC ile aynı Ti slayt altında olarak (B), 100 dynes / cm 2 akış 3 saat sonra ve 100 x büyütme şeffaf oda yoluyla görüntülenmiş . Akış 3 saat sonra hücrelerin yayılmasını yine rastgele fakat yönlendirme unutmayın. (D) x 100 büyütmede akış maruz kalma 48 saat sonra aynı Ti slayt. EPC, CTO ve hücre çekirdekleri akış sonra Hoechst boyası (mavi) ile boyandı ile etiketlenmiş. Akış yönü hücre hizalama Not. (E) Domuz Ti üzerinde karşılaştırma için EPC akışı 48 saat ve 15 dynes / cm sonra 
Şekil 12 Grafik, 48 saat boyunca akış domuz EPC NO üretimini gösteriyor . NO birincil oksidasyon ürünü, nitrit (NO 2 -), NO akışı sırasında farklı zaman noktalarında toplanan orta numune için bir belirteç olarak ölçüldü. 
Şekil 13 akış odası (A) 0,5 olmak "x 2" x 7 "üst kısmında ve alt kısmında (B) 0.25" boyutlarında x 2 "x 7", alüminyum alaşım 6061 dikdörtgen yapılır. Üst"sızdırmazlık için düzlük sigortalamak amacıyla, üst kısmı 0.125 merkezi kısmında gömme" rendelenmiş 0.45 alt O-ring temas yüzeyi x 1.375 "sıvısı deposu" 0,3125 için başına sonuna "0.95 bırakan. üst bölümde rezervuar 3/8-24 TPE ve dişli paslanmaz çelik uçları almak için 0.25 "derin dişli. "X 0.625" 1 / 16 ölçüm Yuvaları, rezervuar nüfuz alt içine işlendi. Girişinin yan fişi bir stopcock eklemek için hortum barbus 10/32 "1 / 8 için bir polipropilen ile delik" vardır. Her ünite sonunda 0.45 "x 2" uç hortumu barbus "1 / 8 için bir polipropilen derin kısmı" 0,25 ile merkezi bir dişli 10/32 TPE vardır. Bu konik "konuları alt delik rezervuar nüfuz yoluyla üst bölümünün alt konik bir alana 0,6875" biter 0,07, 1,460, bir mesafe "için bir LH yuvası merkezden 0,518 derece, geniş. cam sonunda "0,6875" genişlik x 0,0118 "derin ve 0,590 düz bir alan için karışımları(veya diğer yüzey, örneğin titanyum slayt) girinti. Slayt yüklendikten sonra bu düz cam (veya başka bir yüzeye, örneğin titanyum slayt) ile aynı hizada olmalıdır. Konik ve düz parlatılmış. Slayt yüzey 0,0118 "0,0118" girinti alt yüzeyinden gömme rezervuar yuvasına RH ucunda devam ediyor. O-ring, tamamen orijinal yüzey arasındaki O-ring groove ve slayt "0.020 bırakarak yuvaları ve slayt etrafında gömme üst ve alt birimleri on delik delinir. Üst bölümde 8 / 32 TPE gömme düz boşluk delik bulunur başlı vida. alt kısmında delikler, üst deliklere uyan yerleştirilen ve 8 / 32 TPE diziliyor alt birim hücre yüzeyinde cam slayt (veya titanyum slayt) üzerinde bulunan yüzeyi ile açık bir cam slayt pencere gömme floş birim , orijinal yüzey alt slayt ve iç O-ring oluk arasında "0.04 terk genişliği ile üst birim yuvası kapsar O-ring oluk vardır. O-rings kırmızı silikon AS568A, üst bölüm ve 046 alt bölümü için 044 Dash Numarası.
Discussion
Akım devresi ve akış odası tanımlanan sıvı kayma gerilmeleri yapışık hücreleri, örneğin EPC, bize konu ile izin verir. Odanın alt ve üst şeffaf, hücre yapışması ve morfolojisi, odanın kendisi aracılığıyla ya da gerçek zamanlı olarak değerlendirilir ya da demontaj akış odasının bir akış deney ve sonra olabilir. Bu noktada, hücreler steril koşullar altında hasat edilebilir ve yeniden kaplama ya, ya da daha fazla analiz için DNA veya RNA, vb. Toplamak için kullanılıyor.
Laminar akım elde etmek için, odasının tasarımı, çeşitli koşulların yerine getirildiğinden emin olmalıdır.
İlk olarak, akış, laminer, atalet kuvvetlerini viskoz kuvvetlere oranı Reynolds sayısı (Re), hesaplanmak suretiyle kontrol edilebilir olmalıdır. (Viskoz kuvvetler baskın olursa, Yeniden küçük ve akış laminer ya da 'tam gelişmiş' - genellikle Re <2300 için.Biz, atalet kuvvetlerini egemen çalkantılı kadar, akış daha fazla rastgele olur, Re> 4000 için geçerlidir.) Denklemi 3 8 göre Ynt hesaplamak
Ρ akışkan yoğunluğu, Q debisi, μ viskozite, w ve h sırasıyla odanın genişliği ve yüksekliği, ve D h denklemi 4 8 göre tanımlanan hidrolik çapı
Reynolds sayısı 166 arasında değişen yükseklikleri ile üç akış odaları, - 267 mm aralığı 13,9 - 34,6 c akış hızlarında15 dynes / cm 2 kayma gerilmesi elde etmek alculated. 234 - 100 dynes / cm 2 bir kayma gerilmesi için hesaplanan akış hızlarında, odaları Reynolds sayısı 90.4 arasında değişmektedir. Bütün bu Reynolds sayıları 2300 den çok daha düşük olduğu ve laminer akış için kriterleri karşılamadığı.
İkincisi, hız alanı ve kayma gerilmesi için, (yani tam gelişmiş), akış kanalı girişinde uzunluğu, L e daha uzun olmalıdır slayt akışkan giriş uzaklık boyunca mesafe bağımsız olması . Bu denklem 5 9 göre, girişinde uzunluğu hesaplanırken memnun olabilirler.
Yukarıda sıralanan değerleri için, giriş uzunluğu 0.01 'den 0.25 cm arasında değişmektedir.
Üçüncü olarak, lateral yönde hız ve kayma gerilmesi farklılık olmadığını sağlamak amacıylatek boyutlu kanal akışı için önemli değeri (Δ Ph / 2L), h / w oranı 1 den daha az olmalıdır. H / w, tek boyutlu akış altında duvar kayma gerilmesi% 95 için iki boyutlu akış koşulları altında ortalama duvar kayma gerilmesi için, 0,10 eşit olması gerekir, ve iki boyutlu akış koşulları altında duvar kayma gerilmesi için % 97,5 'tek boyutlu akış altında duvar kayma gerilmesi, h / w 0.05 eşit olması gerekir. Tasarlanmış akış haznesi 1,7 cm genişliğinde ve 166 boyutları ile yüksekliği 267 mm, bu kriterleri yerine.
Girişinde herhangi bir yanal basınç farkları varsa, basınç, akış yönü değişecektir. Bu akış yolu boyalar veya parçacıklar kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, sürekli akış deneyleri için, bir darbe dampener akım devresi eklenir. Darbe dampener darbe alıratility devrede roller pompa ile neden ve bize sürekli akış yaklaşık varsayımı sağlar. Notu, etkin roller pompa belirli frekanslar için çıkış akım titreşimlerle ortadan kaldırmak, böylece kullanılan darbe tav devresinde kullanılan pompa ve boru ile uyumlu olmalıdır. I / P 26 tüp herhangi bir Masterflex L / S serisi pompası (600 RPM'ler 0) ile deşarj hattı üzerinde kullanılan gösteriye Masterflex L / S darbe dampener laminar akım elde. Pulsatil akış için, programlanabilir bir pompa çeşitli dalga şekilleri oluşturmak için kullanılabilir.
Pulsatil akış için, programlanabilir bir pompa çeşitli dalga şekilleri oluşturmak için kullanılabilir.
Ayrıca, devre perfüzat gibi bu örnekleri tasarlanmıştır kolayca hücreleri veya akış ortamı bulaşma riski olmadan farklı zaman noktalarında toplanabilir. Bizim örneğimizde, NO 2 konsantrasyonu ile chemiluminescence ile ölçüldüiyonlar / Sievers Nitrik Oksit Analyzer (NOA 280, Sievers Aletleri, Boulder, CO), daha önce açıklanan 10. Nitrit analizi için kullanılan indirgeyici NO nitrit dönüştürmek için azaltma potansiyeline sahiptir, ancak herhangi bir yüksek nitrat gibi azot oksitler azaltmak için yeterli asetik asit (14.5 M asetik asit ve 0.05 M KI) potasyum iyodür ve böylece nispeten nitrit için özel. Örnekleri 6 alırken kayıp hacmi için düzeltme sırasında üretilen toplam miktarın nitrit konsantrasyon ve devrenin toplam hacmi üretilen ürün olarak hesaplandı.
Aşağıdaki adımları akış deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir:
- Kabarcıkları, yüzey hücreleri yırtma potansiyele sahip çünkü akış set-up sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için arzu edilen bir durumdur. Bu akış odasının üst kısmında en iyi alt kısmı, üstüne yerleştirirken dikkatli alarak önlenebilirher ikisi de birbirine paralel tutulması ve yeniden düzenlemeler olmadan bir hareket üzerine en alt düşürücü tarafından gerçekleştirilir. Bunu yaparken, akış kanalı mevcut ve / veya kayan küçük hava kabarcıkları, alüminyum gövdesi iki ucundaki balonu tuzaklar içine yönlendirilir olacak.
- Rezervuar rezervuar alt çıkış hortumu aşağı ulaştığı sağlamak için önemlidir. Aksi takdirde, hava perfüzat seviyesi hortumun ucuna hafifçe altına düşerse rezervuar odasına açar tüp içine çekilir.
- Araştırmacı, yanlışlıkla devre ve odasına emilir hava akış başlaması, pompa üzerine ters yönde çalışmaz böylece pompa akış yönü ile bilgi sahibi olması gerekir.
- (Denatüre serum içerdiği proteinler nedeniyle) köpük oluşumunu önlemek için, biz perfusa üzerinde yaklaşık bir inç odasından rezervuar yol açan boru düşürücü tavsiye ederizrezervuar içinde te seviyesi. Ancak, akış orta seviyesinin üzerinde tutarak deney sırasında rezervuar içine akışını kontrol etmek için izin verir.
- Odası parçaları bir araya vidalama, elektrikli tornavida çalışırken diğer elinizle sıkıca bir yandan konut kavramak önemlidir. Hareket elektrikli tornavida, vida sıkılır sonra 'etrafında odasına fırlatmak' potansiyeline sahiptir tork çevrilen unutmayın.
- Devre şekillendirme ve kendi yüzeyinden hücrelerin kaldırma herhangi bir basınç dalgaları önlemek için, tüm stopcocks akışı başlamadan önce açık olduğundan emin olun.
- Özellikle, uzun vadeli akış çalışmalar için (> 48 saat) hortumun kırılmasını önlemek için pompa kafası eklenecek daha sert ve daha esnek bir boru kullanmanızı öneririz.
- Tüp kötü ayarlanmış pompa kafası dişleri nedeniyle pompa kafası içinde 'göç' mümkündür. Bu nedenle, nasıl küvet yakından ilgilenerek öneririzing pompa kafası güvenli ve boru, boru 'çekti' veya deney sırasında yerinden ise kolayca fark edebilirsiniz böyle bir işaretleme kalemi ile her iki ucunda işaretleme.
- Hatalı bir bağlantı nedeniyle bir deney sırasında perfüzat kaçağı önlemek için her zaman dikkatli bir şekilde perfüzyon başlamadan önce, devre ve odasının her tek bağlayıcı kontrol edin. Bu darbe dampeners giriş ve çıkış konnektörleri için özellikle önemlidir!
- Floresan etiketleri kullanmayın ışık maruz kalma sınırı unutmayın.
Akış odasının olası bir sınırlama alüminyum içine işlenmiş kanal yükseklik yükseklik sabit olmasıdır. Ancak, bu her bir deney için önce kanal yüksekliği doğrulamak ve ayarlamak için bir avantaja sahiptir ve bu nedenle pompa akış istenen değere ayarlayarak sadece kayma gerilmesi hesaplamaları kolaylaştırır. Araştırma hedeflerine bağlı olarak istenebilirartan pompa hızını olmadan kayma gerilmesi artar. Bu durumda biz perfüzat viskozite arttırıcı öneririz, örneğin orta 11 dekstran ekleyerek.
Akım devresi, çok küçük konsantrasyonlarda hücre metabolitleri ölçmek için çalışırken sorunlu olabilir kullanılan orta büyük hacimli, olası bir sınırlama. Burada gösterilen olmasa da, büyük ölçüde, küçük bir rezervuar ve nabız tav kullanarak devre hacmi azaltmak ve boru uzunluğu ve çapı azaltmak mümkündür.
Ayrıca, kültür hücrelere sıvı kayma gerilmesi uygulamak için kullanılabilecek birkaç piyasada mevcut diğer sistemler vardır. Mikroakışkan tabanlı sistemler, hücre eş zamanlı analizler 12,13,14 bu kanallar için giriş ve çıkış rezervuarlar gibi davranan iyi tabak içine çözüm yüklü farklı mikroakışkan akış kanalları etkinleştirmek Fluxion BioFlux sistemi örneğin. Bununla birlikte, bu ve diğer mikroakışkan sistemlerinin standart mikroskop lamı ile uyumlu değildir ve RT-PCR ve Western Blot gibi başka deneyler, hücrelerin yeterli sayıda kurtarma için izin vermez. Ayrıca, daha az kullanıcı dostu 40.000 $ minimum maliyet ve aksesuar ekipmanları bağlı olarak, toplam 100.000 $ 'dan fazla ulaşabilirsiniz.
Tıkla FlexCell International Corporation, Tıkla FlexCell Çıtası ve FlexFlow sistemleri İki macrofluidic sistemleri, başarıyla, endotel hücreleri 15,16,17, sıvı akışını koşullar altında insan annulus hücreleri 18 ve fibroblastlarının 19 çalışma kullanılmaktadır . GlycoTech yoluyla üçüncü bir sistem, tümör hücre adezyon 20 ve endotel mono tabakaları lökosit adezyonu 21 çalışma kullanılmıştır.
Çıtası sistemi birkaç slayt tek seferde aynı kayma stres koşulları altında çalışmasına olanak sağlar, fakat bizim farklı bir görüntüleme penceresi ve yoksuntasarım - akış altında hücrelerin gerçek zamanlı görselleştirme için izin vermiyor.
FlexFlow sistem bir görüntüleme penceresi var, ama dik bir mikroskop, çoğu laboratuvarlarda kullanılan standart bir mikroskop olmayabilir gerektirir. Ayrıca, FlexFlow sistemi akış odasına yerleştirildiği zaman ters bir hücre kaplı bir kapak kayma gerektirir. Bu bizim çalışma göstermektedir titanyum kaplı cam gibi, donuk bir yüzey üzerinde floresan hücreleri, görselleştirme engellemektedir. Son olarak, özel kapak fişleri Tıkla FlexCell Çıtası sistemine benzer çok bin dolar fiyat aralığında FlexFlow sistemi, özellikle satın alınması gerekir.
GlycoTech önemli ölçüde daha az pahalı, ama rahatlıkla Odamızın gibi otoklava kök olamaz akrilik döküm imal dairesel ve dikdörtgen plaka paralel akış odaları sunmaktadır. Not tarif edilmiştir diğer akış odaları otoklav içinmikroskobik özel lensler 22,23 gerektirdiğinden pratik görünür. GlycoTech sistemi tekrar kullanımı ile kalınlık değiştirmek ve bu nedenle zaman (üretici her on kullanımdan sonra yenilerini satın önerir) üzerinde oda yüksekliğini değiştirmek alt ve üst plakalar arasında yer silikon kauçuk contalar, kullanır. Dahili O-ring ile alüminyum odası, alt ve üst plakalar tam muhalefet sağlar ve deneyler arasında sürekli odası yüksekliği sağlar. Son olarak, vakum pompaları, tasarım gerekli değildir GlycoTech odaları da dahil olmak üzere birçok akış oda tasarımları sızdırmaz mühür, başarmak için gerekli.
Oysa burada gösterilmemiştir, akış odası, hücre yapışması ve / veya davranış gerçek zamanlı görüntüleme için tüm akış deney sırasında mikroskop altında tutulmalıdır. Bu istenirse, biz 37 perfüzat ısısını korumak için odanın altında ısı lambaları veya ısıtılmış bir yastık kullanmanızı öneririz ° C Kürkhücreleri veya metabolitleri veya araştırılan ilaçlar veya ajanlar, ya hiç 'devridaim' 24 isteniyorsa, orada roller pompa, bir şırınga pompası ile değiştirilir olabilir.
Konfluent EPC bir katman üzerinde yapışık hücreler, örneğin flüoresan trombositler (trombosit tahlil kullanarak Achneck ve arkadaşları tarafından açıklanan 6,25) üzerinde sıvı kayma stres altında hücre-hücre etkileşimi değerlendirmek için farklı etiketli hücreleri akışı da mümkündür. Bizim akış odası gibi, bir perfüzat örnekleme liman ve bir görüntüleme penceresi gibi diğer akış odaları, değerli özelliklerini birleştiriyor ve ya ters ya da dik bir mikroskop ile uyumluluk önemli bir avantaja sahiptir. Otoklavlanabilir ve sızdırmaz bir sızdırmazlık elde etmek için sabit odası yüksekliği ve vakum pompaları gerek kalmadan tekrarlanan deneyler için izin verir.
Disclosures
Üretim ve bu video makale Ücretsiz Erişim Cole-Parmer Instrument Co tarafından desteklenen
Acknowledgments
Yazarlar, işleme ve akış odaları aracılığıyla görüntü hücrelere teknikleri konusunda yardımcı olmak için Leica Microsystems akışını odası parçaları ve Matt Maudsley montaj onun yorulmak bilmeyen çabaları için Biyomedikal Alet ve Makine Dükkanı Joe Owen teşekkür etmek istiyorum. Biz Duke Perfüzyon Hizmetler Kevin Collins ve akış devre tasarımı yararlı önerileri için Biyomedikal Mühendisliği Bölümü Dr. Steve Wallace borçluyuz. Ayrıca, RC1HL099863-01 "Otolog EPC astar dolaşım, biyouyumluluk yardımcı cihazlar geliştirmek için" Hibe yoluyla verdikleri destek için Alexandra Jantzen ve NIH Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Cole-Parmer | 07940-12 | |
| 1-Way Stopcoks | Cole-Parmer | 30600-00 | |
| 30 ml Syringe | BD Biosciences | 309650 | |
| 4 -Way Stopcocks | Cole-Parmer | 30600-04 | |
| Aluminum Alloy | N/A | 6061 | |
| Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 267061 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| DMSO | Research Organics | 2162D | |
| DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| EGM-2 Singlequots | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Female Luer Adaptor | Cole-Parmer | SI-45500-04 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |
| Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole-Parmer | 34594-24 | |
| Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-16 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| H–chst Stain Solution | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| Hyclone FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.01 | |
| L-glutamine | Lonza Inc. | 17-605E | |
| Male Luer Adaptor | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV | |
| Barbed Polypropylene Fittings | Cole-Parmer | 06365-90 | |
| O-Rings | N/A | AS568A | |
| Pulse-Dampener | Cole-Parmer | 07596-20 | |
| Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole-Parmer | 7524-40 | |
| Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole-Parmer | 07518-60 | |
| Slide | Cole-Parmer | 48500-00 | |
| Soft Tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 02915-12 | |
| Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 | |
| Trypsin EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza Inc. | CC-5002 | |
References
- Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
- Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
- Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).
- Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
- Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
- Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
- Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
- Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
- Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
- Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
- Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
- Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
- Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
- Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
