Summary
Vi beskriver en metode til at underkaste tilhænger celler til laminar flow shear stress i en steril kontinuerlig strøm kredsløb. Cellerne "vedhæftning, kan morfologi undersøges gennem den gennemsigtige kammeret, prøver fra kredsløbet for metabolit analyse og celler høstes efter forskydning eksponering for fremtidige eksperimenter eller kultur.
Abstract
Det overordnede mål med denne metode er at beskrive en teknik til at underkaste tilhænger celler til laminar flow betingelser og evaluere deres reaktion på godt kvantificerbare væske forskydningsspændinger 1.
Vores flow kammer design og flow kredsløb (fig. 1) indeholder en gennemsigtig visning region, der tillader kontrol af celle vedhæftning og billeddannelse af cellemorfologi umiddelbart før flow (Fig. 11A, B), ved forskellige tidspunkter i løbet af flow (Fig. 11C) , og efter flow (Fig. 11D). Disse eksperimenter er illustreret med menneskelige navlestrengsblod afledt endothelial stamceller (EPC'er) og svin EPC'er 2,3.
Denne metode kan også anvendes i andre Tilhænger celletyper, f.eks glatte muskelceller (SMCs) eller fibroblaster.
Kammeret og alle dele af kredsløbet er let steriliseres med damp autoklavering. I modsætning til andrekamre, kan f.eks microfluidic kamre, et stort antal celler (> 1 mio afhængig af cellestørrelse), skal tilbagebetales, efter at strømmen eksperimentet under sterile forhold for cellekultur eller andre eksperimenter, fx DNA eller RNA ekstraktion, eller immunhistokemi (Fig. 11E), eller scanning elektronmikroskopi 5. Den forskydningsspænding kan justeres ved at variere flowhastighed af den perfusat væsken viskositet, eller kanalen højde og bredde. Sidstnævnte kan reducere væske volumen eller celle behov samtidig sikre, at en-dimensionelle flow opretholdes. Det er ikke nødvendigt at måle Afdeling højde mellem eksperimenter, da kammeret højden ikke afhænger af brugen af pakninger, hvilket øger den lethed af flere eksperimenter. Desuden kredsløbsdesign let muliggør indsamling af perfusatet prøver til analyse og / eller kvantificering af metabolitter udskilles af celler i væsker shear stress påvirkning, f.eks nitrogenoxid (Fig. 12) 6
Protocol
1. Endotelial stamcelle isolation
- Forud for enhver form for indsamling af perifert humant blod, indsende din forskning protokol til din Institutional Review Board (IRB), og efter dens godkendelse, de frivillige donorer indhente "informeret samtykke (perifert blod indsamling og EPC isolation var blevet godkendt af Duke University IRB-og er i fuld overensstemmelse med den amerikanske lovgivningsmæssige krav til beskyttelse af menneskers forskning deltagere).
- Når man arbejder med animalsk EPC'er, har din forsøgsprotokollen er godkendt af din Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Alle vores svin eksperimenter var blevet godkendt af Duke University IACUC og blev gennemført i overensstemmelse med de højeste standarder for human pleje.
- Til isolering af endoteliale stamceller, indsamle 50 ml perifert blod via standard flebotomi teknik fra en indvilliget frivillige donor til blodprøvetagning poser fyldt med de antikoagulerende citrate fosfat dextrose og fortyndes løsningen 1:1 med Hanks bufferet saltopløsning (uden CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) og lag på lige dele Histopaque at skabe veldefinerede lag.
- Centrifuge (30 min, 740 g, lav pause indstilling) og indsamle de mononukleære celler (MNC) (buffy coat) lag. Resuspender og vask multinationale selskaber x 3 med Dulbecco er Fosfatbufferet saltvand (DPBS) med 10% føtalt bovint serum (FBS) x 10 min, 515 g, før plettering i to 12-såvel plader i fuld EPC vækstmedium (MCDB-131 medium med 5 ml af 200 mM L-glutamin, 10% FBS og EGM-2 SingleQuots) ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Langsomt ændrer medium hver 24 timer for de første 7 dage, derefter hver anden dag. EPC kolonier kan identificeres efter en gennemsnitlig tid på 14 dage baseret på deres brosten morfologi. Når EPC'er i kultur dækker ¼ af den 12-såvel areal, udvide celler og bekræft EPC identitet med flowcytometri ved at teste for tilstedeværelsen af overflade markørerCD31 og fravær af CD14, CD45 som tidligere beskrevet 6. Andre analyser, der kan udføres omfatte celle morfologi og mærkning med Dii-Ac-LDL.
- For forsøgene beskrevet heri, udvide isoleret EPC'er, indtil de er næsten sammenflydende i 3 T-75 cellekultur kolber i EPC medium i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
2. Forskydningsspænding beregning
- Vi anbefaler, at disse beregninger er foretaget, før han fremstiller kammeret og kanal til at have en grundig forståelse af de betingelser, der kan opnås. Beregn flowet på perfusatet i dit kredsløb baseret på den ønskede forskydningsspændinger, der skal anvendes til cellerne i henhold til ligning 1 1,
hvor Q er den ønskede flow, τ er målet shøre stress handler tangentielt på cellerne, w er bredden af flowet kammeret, h er højden af flow kammer, og μ er viskositeten af perfusatet (flow medium).
- En typisk værdi af viskositet (μ) for mediet er 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Bemærk, at viskositeten også kan øges ved hjælp af høj molekylvægt dextran, hvis dette ønskes 7. En typisk værdi af target shear stress (τ), der anvendes er 15 dynes / cm 2, (typisk arteriel shear stress) eller 100 dynes / cm 2, hvis supra-fysiologiske shear stress er ønsket. Vores kammer typisk har en bredde (w) på 1,9 cm og højden (h) i intervallet 166 til 267 μm.
3. Flow kammer fremstilling
- Skær top og bund plader af the kammer fra aluminiumslegering 6061 rektangulære lager med top dimension af 7 x 2 x 0,5 "og bunden dimensioner af 7 x 2 x 0,25".
- Recess den øverste plade i den midterste del til 0,125 "dyb, hvilket efterlader 0,950" pr ende til 1,375 "bred x 0,3125" dyb væske reservoir.
- Bor 1 / 16 "bred x 0,625" længe slots fra undersiden for at kunne trænge til reservoiret på tilgang og afgang ender.
- Ved afslutningen af hver top plade, bore et centralt beliggende 10/32 "spor per tomme (TPI) hul for polypropylen 1 / 8" slange Barb at trænge ind i væskebeholder. Om tilstrømningen ende, skal du oprette en side stik med 10/32 "TPI gennem hul for polypropylen 1 / 8" slange modhager.
- Taper toppen undersiden fra væsken tilstrømningen til glasset vinduet på 0,518 grader i tilstrækkelig blanding af væske.
- Skær et objektglas vindue ind i bundpladen på linje med det øverste vindue. Brug akvarium cement, lim et objektglas ind i kammeret. Lad hærde i mindst 24 timer.Sørg for, at vinduet er forsænket, så et 75 x 25 x 1 mm mikroskop objektglas vil sidde flush i kammeret.
- Opret en niche for en O-ring rundt om undersiden af top-og bundplader sådan, at de er lange mellemrum af 0,02 ". Sæt gummi O-ringe.
- Bor 10 Matchende 8 / 32 "TPI huller i top og bund kamre til brug med 8 / 32" sænkehovedskruerne.
4. Flow kredsløb samling
- Saml hele flowet kredsløbet først, derefter videre med sterilisering.
- Vedhæft en 36 "segment af hårde rør til den ene ende af pulsdæmper (via 1 / 8" tilslutning). Til den anden ende, en 18 "segment af bløde slanger vedhæfte.
- Placer en 1 / 8 "mandlige luer-adapteren i slutningen af 18" bløde rør sektionen, der er nævnt i trin 4.2. Tilslut den mandlige luer til en 1 / 8 "kvindelige luer adapter. Fastgør den kvindelige luer til et nyt 18" segmentet blød slange.
- Bor tre huller i et 250 ml glas bægerglas cap for at passe slanger. Jegnsert en 1,5 "segment af blød slange (som luftskrue) i et hul og den frie ender af hårde og bløde slange gennem det andet 2 huller i hætten i 250 ml glasflaske (som reservoir) (fig. 2). Sørg for, at den hårde slangen når bunden af beholderen (som udstrømning slange fra reservoiret).
- Sterilisere ovenstående dele af damp autoklave ved 121 ° C i 60 min. Derudover autoklave et komplet flow kammer, 3 x 2 "segmenter af bløde rør, 1 han og 1 hun 1 / 8" luer adapter, 4 x ½ "og 6 x 5 / 16" 8-32 sænkehovedskruerne, 1 pincet , en 75 x 25 x 1 mm glasplade (eller andre ønskede celleoverfladen materiale), og 2 kirurgiske håndklæder.
- Placer sterile håndklæder i laminar flow hætte. Placer flow kredsløb, flow kammer, 4 x 4-vejs stophaner, 1 x 1-vejs stophane, og alle de steriliserede dele fra trin 4,5 over til denne sterile område.
- Brug nu sterile handsker til at tilslutte to 4-vejs stophaner. Placer hætter på den åbne prøve porte. Tag det mandlige og kvindelige luer-adaptere knytte de to bløde slange segmenter af flow kredsløb og indsæt den tilsluttede stophaner (Fig. 3).
- Sæt den bløde slange indsat i reservoiret til en 30 ml sprøjte og fjern sprøjten stemplet. Fyld flasken med 125 ml af EPC medium (Fig. 4).
- Placer en steril sprøjte filter i udlufter (Fig. 4).
- Flyt flow kredsløb ind i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Klemme den hårde slangen i valsen pumpehoved indiceret til brug med denne type slange (fig. 5). Sørg for, at slangen ikke overlapper med valsen pumpe montering spor. Mark, hvor slangen kommer ud af pumpehovedet på hver side med en markeringspen.
- Sørg for, at alle stophaner er lukket i retning af prøven havne og åbne langs strømmen kredsløb. Start pumpen. Kontroller retning af flow. Den perfusatets skal bevæge sig frOM glasset reservoiret gennem den hårde slangen i den pulsdæmper.
5. EPC fluorescerende mærkning
- Mens strømmen kredsløb varmes til 37 ° C, forberede cellerne til såning på diaset. Bemærk, at fluorescerende mærkning er påkrævet, hvis cellerne skal visualiseres på uigennemsigtige materialer, f.eks titanium (Ti).
- Opret en 1 mm stamopløsning af Cell Tracker Orange (CTO) ved at fortynde 50 mikrogram CTO pulver med 90 μl af dimethylsulfoxid (DMSO). Sørg for at beskytte denne blanding fra lyseksponering (slukker lyset, mens de arbejder under flyde hætte).
- Opret en 2 μM brugsopløsning af CTO ved at fortynde 36 μl af CTO stamopløsning i 18 ml serum-fri MCDB-131 medium.
- Skyl EPC'er i 3 nær sammenflydende T-75 cellekultur kolber med 10 ml DPBS (uden Ca og Mg).
- Tilsæt 6 ml af de 2 μM CTO arbejder løsning til hver kolbe. Inkuber i 15 min ved 37 ° C. Skyl hver kolbe x 2 med 10 ml DPBS (uden Ca og Mg).
- Vask ved centrifugering x 5 min ved 600g og resuspender i 5 ml EPC medium.
6. Cell såning af dias forud for flow kammer samling
- En slide lavet af glas, titanium eller andet materiale kan bruges, og slide overfladen kan ændres ved at dreje belægning med polymer eller tilføje et lag af metal. Placér i en steril rektangulært fire-kammer cellekultur fartøj (eller brug vævskultur slide kolbe, hvis polystyren overflade ønskes). Tæl celler og frø 1,5 x 10 6 celler på dias i 5 ml EPC mellemstore x 6 timer, hvis en sammenflydende cellelag ønskes ved indledningen af flow (Fig. 11A).
- For at teste celle spredes og vedhæftning under væske shear stress, giver 3 x 10 6 celler til at overholde for kun 15 min før påbegyndelsen af flow (quick-seeding) (
7. Flow kammer samling
- Ved hjælp af sterile handsker, en 2 "bløde rør segment til en 1 / 8" tilslutning kvindelige luer adapter. Tilslutte en anden 2 "bløde rør segment til en 1 / 8" mandlige luer adapter.
- Sæt 2 "bløde rør med kvindelige luer-adapter til tilstrømningen havnen. Monter de 2" bløde rør med mandlige luer til udstrømning havnen. Sæt 4-vejs stophaner til begge disse luer-adaptere. Tilslut de resterende 2 "bløde rør brik til side port-stik, der kommer ud af boblen fælden og vedlægge en 1-vejs stophane (Fig. 6).
- Brug sterile pincetter, cellen-seedede slide fjerne fra cellekultur fartøj (eller hvis du bruger et dias kolbe, fjerne kolben på dias) og læg den i fordybningen i bunden plade af strømmen kammeret. Sørg for, at slide er placeret hos celle-seedede side opad.
- Afpipetteres 10 ml varm EPC medium på diaset. Lad medium til dækning af dias og flow kammer, but ikke spildes på mellemlang over O-ringen på bundpladen.
- Placer den øverste plade af flowet kammeret på bundpladen, som bringer skruehuller. Pas på ikke at indføre luftbobler ind i kammeret under dette trin ved at holde de to plader parallelt.
- Skru plader sammen (en automatisk batteri-drevet skruetrækker fremskynder denne proces).
- Fjern luftbobler fra tilstrømningen boble fælde ved at åbne 1-vejs stophane fastgjort til tilstrømningen-side boble fælde port og forsigtigt skylle tilstrømningen slange med EPC medium ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Derefter lukker denne stophane og kronen på værket (fig. 7).
- Nu fjerne luftbobler fra kammeret kanal ved at åbne udstrømningen port 4-vejs-stophane og ved forsigtigt at skylle EPC medie flowet kammeret, igen ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Hvis store bobler tilbage, hæve udstrømning slutningen af kammeret til en 45 ° vinkel (fig. 8).
- Cap alle 4-vejs stophane forbindelser og lukdem væk. Flyt flow kammeret ind i kuvøse med det samlede flow kredsløb (fig. 9).
- Pause strømmen cirkulationspumpe. Luk slukke for strømmen kredsløb stophaner i retning af flow for at forebygge lækage og til at holde indersiden af kammeret sterile. Transport flowet kammeret fra strømmen emhætten til strømmen kredsløb. Tilslut strømmen kammeret til flow kredsløb. Åbn stophaner i retning af flow. Genoptage pumpe. Sørg for, at perfusatet flyder i den rigtige retning. Justér flowet til den ønskede shear stress.
- Under strømmen eksperimentet, kan strømmen kammeret fjernes fra kredsløbet til billede cellerne via lys eller fluorescerende mikroskopi. For at gøre dette, skal du afbryde strømmen kammeret fra flow kredsløb på stophanen-hane forbindelser. For at opretholde steriliteten af kammeret, lukke for strømmen kredsløbet stophaner og flow kammer stophaner i retning af flow og cap alle stophaner forud for fjernelse af flow kredsløbfra rugemaskinen (Fig. 9).
8. Perfusatets prøvetagning
- For nem indsamling af perfusat prøver til analyse, (f.eks nitrogenoxid syntese), første pause pumpen.
- Luk stophanen er placeret tættest på pulsdæmper. Fjern den beskyttende hætte og indsætte en lille sprøjte, fx 3 ml sprøjte, ind i prøven porten. Hold hætte og sikre, at det ikke bliver forurenet ved at placere den på hovedet.
- Luk stophanen i retning af flowet kammeret, holde prøven havnen og kredsløb i retning af pulsdæmper åben.
- Tegn den ønskede mængde af prøven, fx 150 μl, fra kredsløbet. Lukke stophanen mod prøven havnen, før du fjerner sprøjten. Opbevar perfusatet prøve i en mærket hætteglas og fryses ved - 80 ° C (nitrogenoxid bestemmelse på et senere tidspunkt).
- Rekapitulere prøven port og sikre, at alle stophaner er åbne, før de påbegynder flow.
9. Repræsentative resultater
Brug vores hurtige-seed-metoden, kan menneskelig afledt af blod endoteliale stamceller seedes på titanium slides i 15 minutter, og overholde under fysiologiske (arteriel) shear kræfter på 15 dynes / cm 2.
Som vist i figur 10, EPC'er spredt under indflydelse af flow fra 210 ± 11,4 μm 2, umiddelbart efter såning, til 657 ± 39,1 μm 2 efter 3 timer, og til 1152 ± 55,3 μm 2 efter 24 timer væske forskydningsspænding af 15 dynes / cm 2 (forskel mellem grupperne er statistisk signifikant med p <0,0001, 1-vejs ANOVA). Parallelt med stigningen i celle-området, som kan afbildes gennem den gennemsigtige kammer med enten lys eller fluorescerende mikroskop, rundhed beregnet efter ligning 2 6
/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>
faldt fra 878 x 10 -3 ± 5,9 x 10 -3, umiddelbart efter såning, til 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 efter 3 timer og til 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 efter 48 timer af den samme væske forskydningsspænding eksponering (forskellen mellem grupperne er igen statistisk signifikant med p <0,0001, 1-vejs ANOVA).
Figur 11D illustrerer, at EPC'er tilpasse og orientere sig i retning af flow efter 48 timers væske shear stress på 15 dynes / cm 2 i forhold til deres tilfældige orientering efter en statisk såning periode på 6 timer, vist i figur 11A.
Vores metode giver også mulighed for at få udleveret prøver på perfusatet på forudbestemte tidspunkter til analyse og / eller kvantificering af udskilles celle metabolitter. Som et repræsentativt eksempel, vi skildrer produktion af nitrit (NO 2 -) i løbet af en 48 timers flow eksperimentere med svin EPC'er i Figur 12. Vi er direkte målt denne primære oxidation produkt af nitrogenoxid (NO) som et surrogat markør for NO i medium prøver fra den flow kredsløb på de forskellige tidspunkter at være 12,0 nmol efter 6 timer, 13,1 nmol på 12 timer, 16,3 nmol ved 24 timer, og 24,6 nmol efter 48 timer i 1 x 10 6 celler på 15 dynes / cm 2 6.
Figur 1. Skematisk Viser et overblik over strømmen kredsløbet montage og flow eksperiment. (A) Flow kredsløb samling uden flow kammer. Inkluderet her er de reservoir, pulsdæmper, hård slange, blødt rør, 4-vejs stophaner og tilsluttet luer-adaptere, samt luftfilter. (B) Tilslutning af strømmen kammeret via den hårde slangen segmentet til pumpe hovedet. (C) sertion af EPC-seedede glide ind i bundplade af flow kammer (D). Komplet samling af flowet kredsløb med strømmen kammeret.
Figur 2. Komplet monteret flow kredsløb for sterilisering.
Figur 3. Samlet flow kredsløb efter sterilisation med stophaner inkluderet.
Figur 4. Fyldning glasset reservoir med 125 ml af EPC medium.
Figur 5. Flow kredsløb fastspændt i pumpe hovedet forud for flow kammer indsættelse.
jpg "/>
Figur 6. Top kammer plade samling.
Figur 7. Flushing boblen fælden med EPC middel til at fjerne bobler fra indstrømning side af salen.
Figur 8. Flushing kammeret med EPC middel til at fjerne bobler fra slide-og udstrømning side af salen.
Figur 9. Komplet monteret flow kredsløb med indskudte flow kammer i løbet af en flow-eksperiment.
Figur 10. EPC-området (i μm 2) stiger over tid løbet af strømmen eksperiment.
files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
Figur 11. (A) lysmikroskop billede af HUCB EPC'er seedede på en fibronektin belagt glasplade x 6 timer før flow ved 100 x forstørrelse. (B) HUCB EPC'er mærket med CTO og hurtig-seedede på en TI slide x 15 min før at flyde, visualiseret med fluorescerende mikroskopi ved 100 x forstørrelse. (C) Samme Ti slide med HUCB EPC'er som under (B), efter 3 timers strøm ved 100 dynes / cm 2 og filmede gennem den gennemsigtige kammer ved 100 x forstørrelse. Bemærk spredning af celler, men stadig er tilfældig orientering efter 3 timers flow. (D) den samme Ti dias, nu efter 48 timers flow eksponering ved 100 x forstørrelse. EPC'er er mærket med CTO og cellekerner er farvet med Hoechst farvestof (blå) efter flow. Bemærk den tilpasning af celler i retning af flow. (E) Porcine EPC'er til sammenligning på Ti efter 48 timers flow og 15 dynes / cm 
Figur 12. Graf viser ingen produktion af svin EPC'er i løbet af 48 timer flow. En primær oxidationsprodukt af NO, nitrit (NO 2 -), blev målt som et surrogat markør for NO fra mellemstore prøver indsamlet på forskellige tidspunkter i løbet af flow. 
Figur 13. Flowet kammeret er lavet i aluminium 6061 rektangulære lager, med den øverste del (A) at være 0,5 "x 2" x 7 "og den nederste del (B) 0,25" x 2 "x 7" i dimension. Den øverste erhøvlet på undersiden O-ring kontaktflade til 0,45 "for at sikre fladhed til forsegling. Den øverste del er forsænket i sin midterste del til 0,125", som efterlader 0,95 "pr afslutning for et 0,3125" x 1,375 "flydende reservoir. Den topsektionen er reservoir er gevind 3/8-24 TPI og 0,25 "dyb til at modtage gevind rustfrit stål stik. Slots måle 1 / 16 "x 0,625" blev fræset ind i undersiden, at trænge ind til reservoiret. Tilstrømningen side stik har en 10/32 "gennem hul til en polypropylen 1 / 8" slange Barb at knytte til en stophane. Hver enhed ende har en centralt placeret gevind 10/32 TPI med 0,25 "dyb portion til en polypropylen 1 / 8" slange Barb i 0,45 "x 2" ende. Enderne bruge et 0,07 "hul fra bunden af tråde igennem at trænge ind i reservoiret. Undersiden af den øverste del har en tilspidset område 0,6875" bred, 0,518 grader fra centrum af en LH slot for en afstand af 1,460 ". Dette taper blandinger til et fladt område 0,6875 "bred x 0,0118" dyb og 0,590 "fra slutningen af Glass (eller en anden overflade, f.eks titanium slide) fordybning. Denne flade skal flugte med glas (eller en anden overflade, f.eks titanium slide), når slæden er installeret. Konus og flade er poleret. Overfladen af dias er 0,0118 "tilbagetrukket fra undersiden overflade. 0,0118" fordybning fortsætter med at reservoiret slot på RH ende. En O-ring er forsænket helt rundt slots og slide forlader 0,020 "af oprindelige overflade mellem O-ring groove og skub. Den øverste og nederste enheder er boret i ti huller. Den øverste del er clearance huller til 8 / 32 TPI undersænket fladt skruer. Den nederste sektion har huller placeret matcher de øverste huller og gevind 8 / 32 TPI. Den nederste enhed har en klar glasplade vindue forsænket flugter med dens overflade placeret over celleoverfladen objektglas (eller titanium slide). Enheden har en O-ring rille som omfatter slots i øverste enhed med bredde til at forlade 0,04 "af oprindelige overflade mellem bunden slide og den indvendige O-ring groove. O-rings er røde silikone AS568A, Dash nummer 044 for den øverste sektion og 046 for den nederste sektion.
Discussion
Vores flow kredsløb og flow kammer giver os mulighed for at underkaste Tilhænger celler, fx EPC'er, til definerede væske forskydningsspændinger. Da kammeret top og bund er gennemsigtige, celleadhæsionsmolekyle og morfologi kan evalueres enten i real-tid, gennem kammeret selv, eller efter et flow eksperiment og demontering af flowet kammeret. På dette tidspunkt, kan cellerne høstes under sterile forhold og enten re-belagte, eller bruges til at hente deres DNA eller RNA, mv, til yderligere analyse.
For at opnå laminar flow, skal udformningen af kammeret være sådan, at flere betingelser er opfyldt.
Først skal strømmen være laminar, som kan verificeres ved at beregne sit Reynolds tal (Re), som er forholdet mellem inertikræfter til tyktflydende kræfter. (Hvis tyktflydende kræfter dominerer, Re er lille og strømmen er laminar eller 'fuldt udviklet' - normalt for Re <2300.Hvis inertikræfter dominerer, strømmen bliver mere og mere tilfældige, indtil det er turbulent, som det er tilfældet for Re> 4000.) Vi kan beregne Re henhold til ligning 3 8,
Hvor ρ er den væske tæthed, Q er flowet, μ er viskositeten, w og h er bredden og højden af kammeret, henholdsvis, og D h er det hydrauliske diameter, defineret i henhold til ligning 4 8,
Det Reynolds Antallet af vores tre flow kamre, med højder der spænder fra 166 til 267 μm, interval fra 13,9 til 34,6 på flowhastigheder calculated at opnå en shear stress på 15 dynes / cm 2. Ved strømningshastigheder beregnes for en forskydningsspænding på 100 dynes / cm 2, varierede Reynolds antallet af afdelinger, fra 90,4 til 234. Alle disse Reynolds tal er meget lavere end 2300 og opfylder kriteriet for laminar flow.
For det andet, at for den hastighed feltet og shear stress være uafhængig af afstanden langs strømmen kanal (dvs. fuldt udviklet), afstanden fra væsken indløb til at glide skal være længere end indgangen længde, L e. Dette kan opfyldes ved at beregne indgangen længde, ifølge ligning 5 9.
For de værdier, der er anført ovenfor, spænder indgangen længde 0,01 til 0,25 cm.
For det tredje, for at sikre, at hastigheden og shear stress i den laterale retning, ikke afvigerbetydeligt fra værdien for endimensionale kanal flow (Δ pH / 2L), skal forholdet h / w være langt mindre end 1. For den gennemsnitlige væggen forskydningsspænding under to-dimensionelle flow betingelser for at være 95% af muren forskydningsspænding under én-dimensionelle flow, skal h / w være lig med 0,10, og for muren forskydningsspænding under to-dimensionelle flow betingelser, som skal 97,5% af muren forskydningsspænding under én-dimensionelle flow, skal h / w være lig med 0,05. Med dimensioner af vores designet flow kammer 1,7 cm i bredden og 166 til 267 ìm i højden, er disse kriterier opfyldt.
Trykket varierer kun i retning af flow, hvis der ikke er nogen lateral pres gradienter ved indgangen. Dette kan vurderes ved hjælp af farvestoffer eller partikler i strømmen stien. Yderligere, for lind strøm eksperimenter, er en pulsdæmper indsat i strømmen kredsløb. Den pulsdæmper tager ud det meste af Pulsatility forårsaget af rullen pumpen i kredsløb, og giver os mulighed for at tilnærme antagelsen om lind strøm. Af note, skal pulsen udnyttes dæmper være foreneligt med pumpe og slanger, der anvendes i kredsløb, så den effektivt kan fjerne svingningerne i output flow for de specifikke frekvenser i valsen pumpen. I vores demonstration den Masterflex L / S pulsdæmper opnår laminar flow, når det bruges om decharge linje med enhver Masterflex L / S-serie pumpe (0 til 600 omdrejninger) og I / P 26 slanger. For pulsatile flow, kan en programmerbar pumpe bruges til at generere forskellige kurveformer.
For pulsatile flow, kan en programmerbar pumpe bruges til at generere forskellige kurveformer.
Desuden er kredsløbet konstrueret således, at prøver af perfusat kan nemt blive indsamlet på forskellige tidspunkter uden risiko for forurening af celler eller flow medium. I vores eksempel, at koncentrationen af NO 2 - blev målt ved kemiluminescence meden Ionics / Sievers Nitric Oxide Analyzer (NOA 280 af Sievers Instruments, Boulder, CO), som tidligere beskrevet 10. Det reduktionsmiddel anvendes til nitrit analyse blev kaliumiodid i eddikesyre (14,5 M eddikesyre og 0,05 M KI), der har reduktionspotentiale at konvertere nitrit til NO, men er utilstrækkelig til at mindske eventuelle højere nitrogenoxider, såsom nitrat og dermed er relativt specifik for nitrit. Det samlede beløb producerede nitrit blev beregnet som produktet af producerede koncentration og den samlede mængde af banen, mens du justerer for volumen tabt, mens udtagning af prøver 6.
Følgende trin er afgørende for en vellykket gennemførelse af flow eksperimenter:
- Det er ønskeligt at undgå dannelse af bobler i løbet af flow set-up, da bobler har potentiale til at rive celler fra deres overflade. Dette kan undgås ved at tage sig, når du placerer den øverste del af flowet kammeret på den nederste del, som er bedstopnås ved at holde begge parallelt med hinanden og sænke den øverste på bunden i én bevægelse uden justeringer. Ved at gøre dette, små luftbobler, der kan være til stede og / eller flydende i strømmen kanalen vil blive omdirigeret til den boble fælder på hver sin ende af aluminiumshus.
- Det er vigtigt at sikre, at udstrømningen slangen i reservoiret når ned til reservoiret i bunden. Ellers kan luften blive suget ind i rør, der fører fra reservoiret til kammeret, hvis perfusatet niveauet falder en anelse under slangen ende.
- Forskeren skal være fortrolig med den retning, pumpens flow, så pumpen ikke ved et uheld kører i den modsatte retning ved påbegyndelsen af flow, som ville resultere i luften suges ind i kredsløbet og kammer.
- For at undgå dannelse af skum (på grund af denaturerede proteiner i serum), anbefaler vi at sænke rør, der fører fra kammeret til reservoiret til cirka en tomme over perfusate niveau inde i reservoiret. Men at holde det over strømmen medium niveau giver dig mulighed for at kontrollere flowet i reservoiret under eksperimentet.
- Når skrue kammeret dele sammen, er det vigtigt at fast greb i huset med den ene hånd, mens du fører den elektriske skruetrækker med den anden hånd. Bemærk, at bevægelsen af den elektriske skruetrækker vil blive oversat til drejningsmoment, som har potentiale til at "slynge kammeret rundt", når skruen er strammet.
- For at undgå enhver trykbølger fra formning i kredsløbet og løfte celler fra deres overflade, sikre, at alle stophaner er åbne, før de påbegynder flow.
- Specielt for på længere sigt flow undersøgelser (> 48 timer) anbefaler vi at bruge hårdere og mere modstandsdygtig slanger, der skal indsættes i pumpen hovedet for at undgå brud på slangen.
- Det er muligt, at slangen 'vandrer' inde i pumpen hovedet på grund af dårligt justerede pumpehoved tænder. Derfor foreslår vi meget opmærksomme på, hvordan karretING er sikret i pumpehovedet og mærkning hver ende af slangen med en markeringspen sådan, at du nemt kan varsel, hvis slangen er 'trukket i' eller fortrængt under eksperimentet.
- Altid nøje kontrollere hver enkelt stik af kredsløbet, og kammeret før du starter perfusion for at forhindre lækage af perfusat under et eksperiment på grund af en fejlagtig tilslutning. Dette er især vigtigt for tilgang og afgang tilslutninger af puls ophæng!
- Husk at begrænse lys eksponering, hvis du bruger fluorescerende etiketter.
En mulig begrænsning af vores flow kammeret er, at højden er fastsat af højden af kanalen fræset ind i aluminium. Men dette har den fordel ikke at skulle kontrollere og justere højden af kanalen før hver eksperimentere og derfor simplificerer forskydningsspænding beregningerne ved blot at justere pumpens flow til den ønskede værdi. Afhængig af din forskning mål, kan det være ønskeligt atøge forskydningsspænding uden at øge pumpehastighed. I dette tilfælde anbefaler vi, at perfusatet er viskositet, fx tilføje Dextran til mediet 11.
En mulig begrænsning af flow kredsløb er den store mængde medie, der anvendes, hvilket kan være problematisk, når de forsøger at kvantificere meget små koncentrationer af celle metabolitter. Selv om det ikke er vist her, er det muligt for markant at reducere kredsløbet lydstyrken ved hjælp af en mindre beholder og pulsdæmper og falde rør længde og diameter.
Derudover er der flere andre kommercielt tilgængelige systemer, der kan bruges til at anvende væske shear stress til celler i kultur. Mikrofluid-baserede systemer, f.eks BioFlux systemet fra Fluxion, tillader simultan analyser af celler i forskellige mikrofluid flow kanaler fyldt med opløsning i såvel plader som input og output reservoirer for disse kanaler 12,13,14. Men disse og andre mikrofluidisk systemer er ikke kompatible med standard objektglas og ikke giver mulighed for inddrivelse af et tilstrækkeligt stort antal celler til videre eksperimenter, såsom RT-PCR eller Western Blot. Desuden er de mindre brugervenlige, koster et minimum på $ 40.000 og kan nå en total på mere end $ 100.000, afhængigt af ekstraudstyr.
To macrofluidic systemer tilgængelige fra Flexcell International Corporation, Flexcell Streameren og FlexFlow systemer, med succes er blevet brugt til at studere endotelceller 15,16,17, menneskelige annulus celler 18 og fibroblaster 19 under væske strømning. Et tredje system, som er tilgængelig via GlycoTech, er blevet anvendt til at studere tumor celleadhæsionsmolekyle 20 og leukocyt vedhæftning 21 til endotel monolag.
Streameren system giver flere sider at køre under samme forskydningsspænding betingelser på én gang, men mangler et vindue og - i modsætning til voresdesign - ikke giver mulighed for real-time visualisering af celler under flow.
Det FlexFlow Systemet har en rude, men kræver en opretstående mikroskop, som måske ikke være standard mikroskopet anvendes i de fleste laboratorier. Endvidere FlexFlow system kræver en celle-belagt dækning slip at være omvendt, når den placeres i det flow kammer. Dette udelukker visualisering af fluorescerende celler på en uigennemsigtig flade, såsom titanium-belagte glas, som vi viser i vores undersøgelse. Endelig har specialiseret dække smutter skal købes specielt til FlexFlow system, som er i multi-tusind-dollar prisklasse, svarende til Flexcell Streamer systemet.
GlycoTech tilbyder cirkulære og rektangulære parallel-plade flow kamre, der er betydeligt billigere, men fremstillet af støbt acryl, der ikke bekvemt kan dæmme autoklaveres som vores kammer. Det skal bemærkes, at andre flow kamre, der er blevet beskrevet være autoklaverbarsynes upraktisk, fordi de kræver specielle mikroskopiske linser 22,23. Det GlycoTech Systemet udnytter silicium gummipakninger der skydes ind mellem top-og bundplader, som vil ændre sig i tykkelse med gentagen brug, og derfor ændre kammer højde over tid (producentens anbefaler køb af nye efter hver tiende bruger). Vores aluminium kammer med indbygget O-ringe giver mulighed for fuldstændig modstand af top og bund plader og sikrer konstant kammer højde mellem eksperimenter. Endelig vakuumpumper er nødvendige for at opnå en vandtæt tætning i mange flow-kammer design, herunder GlycoTech kamre, som ikke er nødvendige i vores design.
Betragtninger ikke vist her, kan strømmen kammeret holdes under et mikroskop under hele flowet eksperiment for real-time scanning af celleadhæsionsmolekyle og / eller adfærd. Hvis dette ønskes, anbefaler vi at bruge varmelamper eller en opvarmet pad under kammeret for at opretholde den perfusatet temperatur på 37 ° C. FurDerfra kan valsen pumpe blive erstattet med en sprøjtepumpe, hvis der ikke "recirkulering" af enten celler eller metabolitter eller efterforskningsmæssig narkotika eller agenter ønskes 24.
Det er også muligt at flyde anderledes mærkede celler i løbet af vedhængende celler, fx fluorescerende blodplader over et lag af sammenflydende EPC'er (ved hjælp af trombocyt assay beskrevet af Achneck et al. 6,25) for at evaluere celle-til-celle interaktion under væske forskydningsspænding. Vores flow kammer kombinerer værdifulde funktioner i andre tilgængelige flow kamre, såsom en perfusatets prøveudtagning havn og et vindue og har den vigtige fordel af kompatibilitet med enten en omvendt eller opret mikroskop. Det er fuldt autoklaverbar og giver mulighed for gentagne forsøg på konstant kammer højde og uden brug af vakuum pumper for at opnå en tæt forsegling.
Disclosures
Produktion og fri adgang til denne video-artikel er sponsoreret af Cole-Parmer Instrument Co
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Joe Owen i Biomedicinsk Instrument og Machine Shop for hans utrættelige indsats i bearbejdning og samling af flow kammeret dele og Matt Maudsley fra Leica Microsystems for at bistå i teknikker til billede celler gennem flow kamre. Vi står i gæld til Kevin Collins fra Duke Perfusion Services og Dr. Steve Wallace i Department of Biomedical Engineering for nyttige forslag på flow kredsløbsdesign. Vi vil også gerne takke National Science Foundation Graduate Research Fellowship program til støtte for Alexandra Jantzen og NIH for deres støtte gennem Grant "Autolog EPC foring for at forbedre biokompatibilitet af kredsløbssygdomme hjælpe enheder" RC1HL099863-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Cole-Parmer | 07940-12 | |
| 1-Way Stopcoks | Cole-Parmer | 30600-00 | |
| 30 ml Syringe | BD Biosciences | 309650 | |
| 4 -Way Stopcocks | Cole-Parmer | 30600-04 | |
| Aluminum Alloy | N/A | 6061 | |
| Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 267061 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| DMSO | Research Organics | 2162D | |
| DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| EGM-2 Singlequots | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Female Luer Adaptor | Cole-Parmer | SI-45500-04 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |
| Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole-Parmer | 34594-24 | |
| Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-16 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| H–chst Stain Solution | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| Hyclone FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.01 | |
| L-glutamine | Lonza Inc. | 17-605E | |
| Male Luer Adaptor | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV | |
| Barbed Polypropylene Fittings | Cole-Parmer | 06365-90 | |
| O-Rings | N/A | AS568A | |
| Pulse-Dampener | Cole-Parmer | 07596-20 | |
| Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole-Parmer | 7524-40 | |
| Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole-Parmer | 07518-60 | |
| Slide | Cole-Parmer | 48500-00 | |
| Soft Tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 02915-12 | |
| Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 | |
| Trypsin EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza Inc. | CC-5002 | |
References
- Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
- Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
- Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).
- Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
- Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
- Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
- Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
- Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
- Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
- Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
- Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
- Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
- Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
- Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
