Summary
We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.
Abstract
Het algemene doel van deze methode is te beschrijven een techniek om hechtende cellen onder laminaire flow omstandigheden en evalueren van hun reactie op de goed kwantificeerbare vloeistof schuifspanningen 1.
Onze flow kamer-ontwerp en de stroom circuit (afb. 1) bevat een transparante weergavegebied dat het testen van celadhesie en beeldvorming van celmorfologie maakt vlak voor stroom (Fig. 11A, B), op verschillende momenten tijdens de flow (fig. 11C) , en na de flow (Fig. 11D). Deze experimenten worden geïllustreerd met menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheliale progenitor cellen (EPC's) en varkens EPC 2,3.
Deze methode is ook toepasbaar op andere hechtende celtypes, zoals gladde spiercellen (SMC) of fibroblasten.
De kamer en alle delen van het circuit zijn gemakkelijk gesteriliseerd met stoom autoclaaf. In tegenstelling tot anderekamers, kan bijvoorbeeld microfluïdische kamers, grote aantallen cellen (> 1 miljoen, afhankelijk van celgrootte) worden hersteld nadat de stroom experiment onder steriele omstandigheden voor celkweek of andere experimenten, bijvoorbeeld DNA of RNA-extractie, of immunohistochemie (Afb. 11E), of scanning elektronenmicroscopie 5. De schuifspanning kan worden aangepast door het variëren van het debiet van het perfusaat, de viscositeit, of het kanaal hoogte en breedte. Dit laatste kan verminderen vloeistof volume of mobiele behoeften, terwijl ervoor te zorgen dat een-dimensionale stroming wordt gehandhaafd. Het is niet nodig om kamer hoogte tussen experimenten te meten, omdat de kamer hoogte is niet afhankelijk van het gebruik van pakkingen, die sterk vergroot het gemak van meerdere experimenten. Bovendien is de schakeling ontwerp maakt gemakkelijk het verzamelen van perfusaat monsters voor analyse en / of kwantificering van metabolieten uitgescheiden door cellen onder vloeistof schuifspanning blootstelling, zoals stikstofmonoxide (Fig. 12) 6
Protocol
1. Endotheliale voorlopercellen geïsoleerd
- Voorafgaand aan elke verzameling van perifeer menselijk bloed, geef je onderzoeksprotocol om uw Institutional Review Board (IRB), en na de goedkeuring ervan, het verkrijgen van de vrijwillige donoren 'informed consent (perifeer bloed verzamelen en EPC-isolatie was goedgekeurd door de Duke University en de IRB is volledig in overeenstemming met de Amerikaanse wettelijke eisen met betrekking tot de bescherming van de deelnemers aan het onderzoek).
- Bij het werken met dieren afkomstige EPC's, uw onderzoeksprotocol goedgekeurd door uw Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Al onze varkens experimenten was goedgekeurd door de Duke University IACUC en werden uitgevoerd in overeenstemming met de hoogste normen van menselijke zorg.
- Voor de isolatie van endotheliale progenitorcellen, het verzamelen van 50 ml van perifeer bloed via een standaard aderlaten techniek van een vrijwilliger ingestemd donor in het bloed collectie zakjes gevuld met het anti-stollingsmiddel citrate fosfaat dextrose en verdun de oplossing 1:1 met gebufferde zoutoplossing Hank's (zonder CaCl2, MgCl2, MgSO 4) en laag op gelijke volumes van Histopaque om goed gedefinieerde lagen te creëren.
- Centrifuge (30 min, 740 g, lage break instelling) en het verzamelen van de mononucleaire cellen (MNC) (buffy coat) laag. Resuspendeer en was de MNC's x 3 met fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 10% foetaal runderserum (FBS) x 10 min, 515 g, voor het uitplaten in twee 12-wells platen in volle EPC groeimedium (MCDB-131 medium met 5 ml van 200 mM L-glutamine, 10% FBS en EGM-2 SingleQuots) bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Langzaam veranderen medium elke 24 uur gedurende de eerste 7 dagen, daarna om de andere dag. EPC kolonies kunnen worden geïdentificeerd na een gemiddelde tijd van 14 dagen op basis van hun geplaveide morfologie. Eenmaal EPC's in cultuur te dekken ¼ van de 12-well oppervlakte, uit te breiden cellen en bevestig EPC identiteit met flowcytometrie door het testen op de aanwezigheid van oppervlakte markersCD31 en afwezigheid van CD14, CD45 zoals eerder beschreven 6. Andere testen die uitgevoerd kunnen worden zijn onder celmorfologie en labeling met Dii-Ac-LDL.
- Voor de experimenten die hierin worden beschreven, uit te breiden geïsoleerde EPC's totdat ze bijna confluent in 3 T-75 celkweek flessen in EPC medium in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
2. Shear stress-berekening
- Wij raden dat deze berekeningen zijn uitgevoerd voordat de productie van de kamer en kanaal om een grondig begrip van de voorwaarden die kunnen worden verwezenlijkt. Bereken het debiet van het perfusaat in uw circuit op basis van de gewenste schuifspanningen te worden toegepast op de cellen volgens vergelijking 1 1,
waar Q is de gewenste debiet, τ is het doel shoren belasting handelen tangentieel op de cellen, w is de breedte van de stroom kamer, h is de hoogte van de stroom kamer, en μ is de viscositeit van het perfusaat (flow medium).
- Een typische waarde van de viscositeit (μ) voor gebruikte medium is 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Merk op dat de viscositeit kan ook worden verhoogd door gebruik te maken hoog moleculair gewicht dextran, indien gewenst 7. Een typische waarde van de doelstelling shear stress (τ) wordt gebruikt is 15 dynes / cm 2, (typisch arteriële shear stress) of 100 dynes / cm 2, als supra-fysiologische shear stress gewenst is. Onze kamer heeft meestal een breedte (w) van 1,9 cm en hoogte (h) in het bereik van 166 tot 267 micrometer.
3. Flow kamer productie
- Snijd de boven-en onderplaten van THe kamer van aluminium legering 6061 rechthoekig voorraad met top afmeting van 7 x 2 x 0,5 "-en onderkant afmetingen van 7 x 2 x 0,25".
- Uitsparing van de bovenste plaat in het midden gedeelte tot 0,125 "diep, waardoor 0.950" per einde voor 1.375 "breed x 0,3125" diep vloeistof reservoir.
- Boor 1 / 16 "breed x 0.625" lange sleuven van de onderkant, om door te dringen tot het reservoir op de instroom en uitstroom eindigt.
- Aan het einde van elke bovenplaat, boor een centraal gelegen 10/32 "tracks per inch (TPI) gat voor polypropyleen 1 / 8" slang weerhaak om de vloeistof reservoir binnen te dringen. Op de instroom einde, maakt u een kant stekker met 10/32 "TPI door het gat voor polypropyleen 1 / 8" slang weerhaak.
- Afbouwen van de top onderkant van de vloeistof aanvoer naar de glazen kijkvenster op 0.518 graden juiste menging van vocht.
- Snijd een glasplaatje raam in de onderste plaat in lijn met de top kijkvenster. Met behulp van aquarium cement, lijm een glasplaatje in de kamer. Laten uitharden ten minste 24 uur.Zorg ervoor dat het kijkvenster zo is verzonken, dat een 75 x 25 x 1 mm microscoop glasplaatje zal zitten verzonken in de kamer.
- Maak een uitsparing voor een O-ring rond de onderkant van het bovenste en onderste platen zodanig dat ze elkaar geplaatst zijn door de 0.02 ". Plaats de rubberen O-ringen.
- Boor 10 bijpassende 8 / 32 "TPI gaten in boven-en onderkant kamers voor gebruik met 8 / 32" platte kop schroeven.
4. Stroom circuit assembly
- Monteer eerst de gehele stroom circuit, ga dan verder met de sterilisatie.
- Bevestig een 36 "-segment van de harde slang aan het ene uiteinde van de pulsdemper (via 1 / 8" aansluiting). Naar de andere kant, sluit een 18 "-segment van zachte buis.
- Plaats een 1 / 8 "male luer-adapter aan het eind van de 18" zachte slangen gedeelte, vermeld in stap 4.2. Sluit de mannelijke luer tot een 1 / 8 "female luer-adapter. Bevestig de vrouwelijke luer om een nieuwe 18"-segment zachte buis.
- Boor drie gaten in een 250 ml bekerglas kap om de buizen te passen. Iknsert een 1,5 "-segment van zachte buis (als ontluchting) in een gat en de vrije uiteinden van de harde en zachte slang door de andere twee gaten in de kap in de 250 ml glazen fles (als reservoir) (fig. 2). Zorg ervoor dat de harde buis de bodem van het reservoir bereikt (zoals uitstroom slang van het reservoir).
- Steriliseer de bovengenoemde onderdelen door stoom autoclaaf bij 121 ° C gedurende 60 minuten. Daarnaast autoclaaf een volledige flow kamer, 3 x 2 "segmenten van zachte buizen, een reu en 1 teef 1 / 8" luer-adapter, 4 x ½ "en 6 x 5 / 16" 8-32 platte kop schroeven, een pincet , een 75 x 25 x 1 mm glaasje (of een andere gewenste celoppervlak materiaal), en twee chirurgische handdoeken.
- Plaats steriele handdoeken in laminaire flow kap. Plaats de stroom circuit, doorstroming kamer, 4 x 4-weg kranen, 1 x 1-weg kraan, en alle gesteriliseerde onderdelen van stap 4.5 op deze steriele veld.
- Gebruik nu steriele handschoenen aan twee 4-weg kranen aan te sluiten. Plaats doppen op de open monster poorten. Maak de mannelijke en vrouwelijke luer adapters bevestigen van de twee zachte slangen segmenten van de stroom circuit en plaats de aangesloten kranen (afb. 3).
- Bevestig de zachte slang ingebracht in het reservoir om een 30 ml spuit en verwijder de spuit zuiger. Vul de fles met 125 ml van de EPC-medium (afb. 4).
- Plaats een steriele spuit filter in de ontluchter (afb. 4).
- Verplaats de stroom circuit in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Klem de harde slang in de roller pompkop geïndiceerd voor gebruik met dit type buis (Fig. 5). Zorg ervoor dat de slang niet overlapt met de roller pomp montage tracks. Markeer de buis, waar deze uit de kop van de pomp aan beide zijden met een markering pen.
- Zorg ervoor dat alle kranen zijn afgesloten de richting van het monster en open poorten langs de stroom circuit. Start de pomp. Controleer de richting van de stroming. Het perfusaat moet bewegen frOM de glazen reservoir door de harde slang in de pulsdemper.
5. EPC fluorescentielabelling
- Terwijl de stroom circuit opwarmt tot 37 ° C, de voorbereiding van de cellen voor het zaaien naar de dia. Merk op dat TL-etikettering is vereist als de cellen te worden gevisualiseerd op de ondoorzichtige materialen, zoals titanium (Ti).
- Maak een 1 mM voorraad oplossing van Cell Tracker Orange (CTO) door verdunning van 50 ug CTO poeder met 90 ul van dimethylsulfoxide (DMSO). Zorg ervoor dat dit mengsel te beschermen tegen blootstelling aan licht (licht uit te schakelen tijdens het werken onder stroom afzuigkap).
- Maak een 2 uM werkende oplossing van de CTO door het verdunnen van 36 ul van CTO voorraad oplossing in 18 ml serum-vrij MCDB-131 medium.
- Spoel EPC's in de buurt van 3 samenvloeiende T-75 celkweek flessen met 10 ml DPBS (zonder Ca of Mg).
- Voeg 6 ml van de 2 uM CTO werkende oplossing aan elke kolf. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Spoel elke kolf x 2 met 10 ml DPBS (zonder Ca of Mg).
- Was door centrifugeren x 5 min bij 600g en resuspendeer in 5 ml van de EPC-medium.
6. Cel zaaien van dia voorafgaand aan de montage kamer stromen
- Een dia gemaakt van glas, titanium, of ander materiaal kan worden gebruikt, en de glijbaan oppervlak kan worden gewijzigd door spin coating met een polymeer of het toevoegen van een laagje metaal. Plaats de dia in een steriele rechthoekige vier-kamer-celkweek schip (of gebruik weefselkweek slide fles als polystyreen ondergrond is gewenst). Tellen cellen en zaad 1,5 x 10 6 cellen op de dia in 5 ml van de EPC medium x 6 uur als een confluente cellaag gewenst is bij het starten van stroom (Fig. 11A).
- Om de cel spreiding en adhesie test onder vloeistof shear stress, laat 3 x 10 6 cellen om zich te houden voor slechts 15 minuten voor aanvang van de stroom (quick-zaaien) (
7. Flow kamer montage
- Met behulp van steriele handschoenen, sluit een 2 "slang zachte segment aan een 1 / 8" female luer adapter. Sluit een ander twee "zachte slang segment tot een 1 / 8" male luer-adapter.
- Bevestig de twee "zachte buis met vrouwelijke luer-adapter aan de instroom-poort. Bevestig de twee" zachte slangen met mannelijke luer om de uitstroom-poort. Bevestig de 4-weg afsluiters voor beide luer adapters. Sluit de resterende twee "zachte slangen stuk aan de zijkant port connector komende uit de opvanginrichting en bevestig een 1-weg kraan (Fig. 6).
- Met behulp van steriele pincet, verwijdert u de cel geplaatste dia uit de celkweek schip (of als u een dia kolf, de kolf te verwijderen dia) en plaats deze in de uitsparing aan de bodemplaat van de stroming kamer. Zorg ervoor dat de dia is geplaatst met de cel geplaatste zijde naar boven.
- Pipetteer 10 ml van de warme EPC medium naar de dia. Laat het medium om de dia en de stroom kamer, b te dekkenut niet morsen het medium over de O-ring op de bodemplaat.
- Plaats de bovenplaat van de stroming kamer op de bodemplaat, het uitlijnen van de schroefgaten. Zorg ervoor dat u luchtbellen te introduceren in de kamer tijdens deze stap door het houden van de twee platen parallel.
- Schroef platen samen (een automatische batterij-aangedreven schroevendraaier versnelt dit proces).
- Verwijder de luchtbellen uit instroom opvanginrichting, door het openen van de 1-weg kraan aan de instroom-side opvanginrichting, de haven en voorzichtig de instroom buis spoelen met EPC medium met behulp van een 10 ml spuit. Vervolgens af te sluiten deze kraan en dop (afb. 7).
- Verwijder nu de luchtbellen uit de kamer kanaal door het openen van de uitstroom poort 4-weg kraan en door zachtjes spoelen EPC medium door de stroming kamer, opnieuw met een 10 ml spuit. Als er grote luchtbellen blijven, verhoging van de uitstroom einde van de kamer naar een hoek van 45 ° (Fig. 8).
- Cap alle van de vier-weg kraan aansluitingen en sluitze af. Verplaats de stroom kamer in de incubator met de verzamelde stroom circuit (afb. 9).
- Pauze de stroom-pomp. Sluit de stroom circuit kranen in de richting van de stroom om lekkage te voorkomen en om de binnenkant van de kamer steriel. Transport van de stroom kamer uit de stroom kap om de stroom circuit. Sluit de stroom kamer om de stroom circuit. Open de kranen in de richting van de stroming. Hervat de stroom pomp. Zorg ervoor dat het perfusaat stroomt in de juiste richting. Stel het debiet naar de gewenste shear stress.
- Tijdens de stroom experiment, kan de stroom kamer worden verwijderd van het circuit naar het imago van de cellen via licht of fluorescentie microscopie. Om dit te doen, haalt u de stroom kamer uit de stroom circuit op het kraan-kraan aansluitingen. Voor een duurzaam behoud steriliteit van de kamer, het afsluiten van de stroom circuit kranen en stroming kamer afsluiters in de richting van de stroming en voorafgaande cap alle afsluiters het verwijderen van de stroom circuitvan de incubator (Fig. 9).
8. Perfusaat monstername
- Voor het eenvoudig verzamelen van perfusaat monsters voor analyse, (bijvoorbeeld stikstofoxide synthese), eerste pauze de pomp.
- Sluit de kraan bevindt zich het dichtst bij de pulsdemper. Verwijder de beschermkap en plaats een kleine spuit, bv 3 ml spuit, in het monster-poort. Houd de dop en ervoor zorgen dat het niet zal raken besmet door het plaatsen van ondersteboven.
- Sluit de kraan in de richting van de stroming kamer, het houden van het monster haven en het circuit in de richting van de pulsdemper te openen.
- Teken de gewenste hoeveelheid van het monster, bijvoorbeeld 150 ul, van het circuit. Sluit de kraan richting de sample-poort voor het verwijderen van de spuit. Bewaar de perfusaat monster in een gelabelde flacon en bevriezen bij - 80 ° C (voor stikstofoxide bepalen op een later tijdstip).
- Recap het monster-poort en ervoor zorgen dat alle kranen open zijn voordat u begint flow.
9. Representatieve resultaten
Met behulp van onze quick-zaad-methode, kan menselijk bloed afgeleide voorlopercellen van endotheel worden gezaaid op titanium dia's gedurende 15 minuten en houden zich onder fysiologische (arteriële) schuifkrachten van 15 dyne / cm 2.
Zoals weergegeven in figuur 10, EPC's verspreid onder de invloed van de stroming van 210 ± 11,4 micrometer 2, direct na het uitzaaien, tot 657 ± 39,1 micrometer 2 na 3 uur, en tot 1152 ± 55,3 micrometer 2 na 24 uur van vocht shear stress van 15 dynes / cm 2 (verschil tussen de groepen is statistisch significant met p <0,0001, 1-weg ANOVA). Parallel aan de stijging van de cel, die kan worden afgebeeld door de transparante kamer met ofwel licht of fluorescentie microscoop, de rondheid berekend volgens vergelijking 2 6
/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>
gedaald van 878 x 10 -3 ± 5,9 x 10 -3, onmiddellijk na het zaaien, om 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 na 3 uur, en tot 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 na 48 uur van dezelfde vloeistof schuifspanning blootstelling (verschil tussen de groepen is opnieuw statistisch significant met p <0,0001, 1-weg ANOVA).
Figuur 11D illustreert dat EPC's af te stemmen en oriënteren in de richting van de stroom na 48 uur van vloeistof shear stress op 15 dynes / cm 2 in vergelijking met hun willekeurige oriëntatie en na een statische zaaien periode van 6 uur, afgebeeld in figuur 11A.
Onze methode maakt het ook voor het verkrijgen van monsters van het perfusaat op vooraf bepaalde tijdstippen voor de analyse en / of kwantificering van de cel uitgescheiden metabolieten. Als een representatief voorbeeld tonen we de productieTIE van nitriet (NO 2 -) tijdens een 48 uur stroom te experimenteren met varkens EPC's in Figuur 12. We rechtstreeks gemeten deze primaire oxidatie product van stikstofmonoxide (NO) als een surrogaat marker voor NO in middelgrote monsters uit de stroom circuit op de verschillende tijdstippen tot 12,0 nmol om 6 uur, 13,1 nmol op 12 uur, 16,3 nmol op 24 worden uur en 24,6 nmol na 48 uur voor 1 x 10 6 cellen bij 15 dynes / cm 2 6.
Figuur 1. Schematisch toont een overzicht van de stroom circuit montage en doorstroming experiment. (A) Flow circuit montage zonder de doorstroming kamer. Dit omvat de reservoir, pulsdemper, harde buizen, zachte slangen, 4-weg afsluiters en aangesloten luer adapters, evenals luchtfilter. (B) Het aansluiten van de stroom kamer via de harde buis segment om de stroom pompkop. (C) In sertion van de EPC-geplaatste schuiven in de bodemplaat van de flow kamer (D). Volledig samenstel van de stroom circuit met de stroom kamer.
Figuur 2. Compleet gemonteerd stroom circuit voor sterilisatie.
Figuur 3. Assembled stroom circuit na sterilisatie met kranen inbegrepen.
Figuur 4. Vullen van de glazen reservoir met 125 ml van de EPC-medium.
Figuur 5. Flow circuit geklemd in de stroom pomp voorafgaand aan de stromen kamer inbrengen.
jpg "/>
Figuur 6. Bovenste kamer plate assembly.
Figuur 7. Spoelen van de opvanginrichting met EPC medium om luchtbellen te verwijderen van instroom kant van de kamer.
Figuur 8. Spoelen van de kamer met EPC medium om luchtbellen te verwijderen uit de dia-en uitstroom kant van de kamer.
Figuur 9. Compleet gemonteerd stroom circuit met ingevoegde stroom kamer tijdens een flow experiment.
Figuur 10. EPC gebied (in um 2) stijgt in het tijdsverloop van de stroom experiment.
files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
Figuur 11. (A) licht microscoop beeld van HUCB EPC's gezaaid op een fibronectine gecoate glasplaatje x 6 uur voorafgaand aan debiet bij 100 x vergroting. (B) HUCB EPC's gemerkt met CTO en snel gezaaid op een Ti slide x 15 minuten voorafgaand aan de stroom, gevisualiseerd met fluorescentie microscopie op 100 x vergroting. (C) Dezelfde Ti dia met HUCB EPC's als onder (B), na 3 uur van het debiet bij 100 dynes / cm 2 en afgebeeld door de transparante kamer bij 100 x vergroting. Let op de verspreiding van cellen, maar nog steeds een willekeurige oriëntatie en na 3 uur van stroom. (D) Dezelfde Ti glijbaan, nu na 48 uur van stroom blootstelling op 100 x vergroting. EPC's zijn gelabeld met CTO en celkernen worden gekleurd met Hoechst kleurstof (blauw) na flow. Let op de uitlijning van cellen in de richting van de stroom. (E) Varkens EPC's voor de vergelijking op Ti na 48 uur van stroom en 15 dynes / cm 
Figuur 12. Grafiek toont geen productie van varkens EPC's tijdens de 48 uur van stroom. Een primaire oxidatie product van NO, nitriet (NO 2 -), werd gemeten als een surrogaat marker voor NO van medium monsters op verschillende tijdstippen gedurende de stroming. 
Figuur 13. De stroom kamer is gemaakt van aluminium legering 6061 rechthoekig voorraad, met het bovenste deel (A) als 0,5 "x 2" x 7 "en het onderste gedeelte (B) 0.25" x 2 "x 7" in dimensie. De top isgeschaafd aan de onderzijde O-ring contact oppervlak 0,45 "om vlakheid te verzekeren voor de afdichting. Het bovenste deel is verzonken in het midden gedeelte tot 0,125", die vertrekt 0,95 "per einde voor een 0.3125" x 1.375 "vloeistof reservoir. De bovenste deel van het reservoir is voorzien van schroefdraad 3/8-24 TPI en 0,25 "diep om schroefdraad roestvrij staal pluggen ontvangen. Slots van 1 / 16 "x 0,625" werden bewerkt in de onderzijde die doordringen tot het reservoir. De instroom kant plug heeft een 10/32 "door middel van een gat voor polypropyleen 1 / 8" slang weerhaak te hechten aan een kraan. Elke unit heeft het einde een centraal gelegen schroefdraad 10/32 TPI met 0,25 "diepe gedeelte van een polypropyleen 1 / 8" slang weerhaak in de 0.45 "x 2" te beëindigen. De uiteinden gebruik van een 0,07 "gat van de onderkant van draden door naar het reservoir binnen te dringen. De onderkant van het bovenste gedeelte heeft een taps toelopende ruimte 0,6875" breed, 0.518 graden van het centrum van een LH slot voor een afstand van 1,460 ". Deze conus mengsels om een vlak gebied 0,6875 "breed x 0,0118" diep en 0.590 "van het einde van het glass (of een ander oppervlak, zoals titaan glijbaan) reces. Deze flat moet gelijk met het glas (of een ander oppervlak, zoals titaan glijbaan) zodra de dia wordt geïnstalleerd. De conus en platte zijn gepolijst. Het oppervlak van de dia is 0,0118 "verzonken van de onderkant oppervlak. 0,0118 'uitsparing blijft het reservoir slot op de RH einde. Een O-ring is volledig verzonken rond slots en schuif het verlaten van 0.020 "van de originele oppervlak tussen de O-ring groef en schuif. De boven-en onderkant units zijn geboord voor tien holes. Het bovenste deel is ruimte gaten voor 8 / 32 TPI verzonken flat schroeven. Het onderste deel heeft gaten geplaatst die overeenkomen met de bovenste gaten en zijn schroefdraad 8 / 32 TPI. De onderste unit heeft een helder glasplaatje raam verzonken gelijk met het oppervlak zich boven het celoppervlak glaasje (of titanium glijbaan). De unit heeft een O-ring groef die slots omvat in de top-eenheid met een breedte tot 0,04 te verlaten "van de originele oppervlak tussen de onderste schuif en de binnenste O-ring groef. De O-rings zijn rode siliconen AS568A, Dash Nummer 044 voor het bovenste gedeelte en 046 voor het onderste gedeelte.
Discussion
Onze stroom circuit en flow kamer kunnen we hechtende cellen, zoals EPC's, om bepaalde vloeistof schuifspanningen onderwerp. Omdat de kamer boven-en onderkant zijn transparant, celadhesie en morfologie kan worden geëvalueerd in real-time, door de kamer zelf, of na een stroom experiment en demontage van de stroming kamer. Op dat punt kan cellen worden geoogst onder steriele omstandigheden en een re-plated, of gebruikt om hun DNA of RNA, enz., te verzamelen voor verdere analyse.
Om dit te bereiken laminaire stroming, moet het ontwerp van de kamer zodanig zijn dat een aantal voorwaarden wordt voldaan.
Ten eerste moet de stroom worden laminair, die kunnen worden geverifieerd door het berekenen van het getal van Reynolds (Re), dat is de verhouding van inertie krachten om viskeuze krachten. (Als overheersen visceuze krachten, Re is klein en de stroming is laminair of 'volledig ontwikkeld' - meestal voor Re <2300.Als overheersen traagheidskrachten, de stroming wordt meer en meer willekeurige totdat het is turbulent, zoals het geval is voor Re> 4000.) We kunnen berekenen Re volgens vergelijking 3 8,
Waar ρ is de vloeistof dichtheid, Q is het debiet, μ is de viscositeit, w en h zijn de breedte en hoogte van de kamer, respectievelijk, en D h is de hydraulische diameter, gedefinieerd volgens vergelijking 4 8,
Het getal van Reynolds van onze drie stromen kamers, met een hoogte variërend 166 tot 267 micrometer, bereik 13,9 tot 34,6 bij een flow calculated om een schuifspanning van 15 dyne / cm 2 te verkrijgen. Bij een flow berekend voor een schuifspanning van 100 dyne / cm 2, het getal van Reynolds van de kamers varieerde 90,4 tot 234. Al deze Reynolds getallen zijn veel lager dan 2300 en voldoen aan het criterium voor laminaire stroming.
Ten tweede, voor de snelheid veld en shear stress onafhankelijk van de afstand langs de stroom kanaal (dat wil zeggen volledig ontwikkeld), de afstand van de vloeistof inlaat te glijden moet langer zijn dan de ingang van de lengte, L e. Dit kan worden voldaan door het berekenen van de ingang lengte, volgens vergelijking 5 9.
Voor de hierboven genoemde waarden, de ingang lengte varieert 0,01 tot 0,25 cm.
Ten derde, om ervoor te zorgen dat de snelheid en de schuifspanning in de laterale richting niet variërensterk af van de waarde voor een-dimensionale kanaal flow (Δ Ph / 2L), moet de verhouding h / w zijn veel minder dan 1. Voor de gemiddelde wandschuifspanning onder twee-dimensionale stroming tot 95% van de wandschuifspanning onder een-dimensionale flow, moet h / w gelijk zijn aan 0,10, en voor de wandschuifspanning onder twee-dimensionale stroming voorwaarden die moeten worden 97,5% van de muur shear stress onder een-dimensionale flow, moet h / w gelijk zijn aan 0,05. Met de afmetingen van onze gewenste debiet kamer 1,7 cm in de breedte en 166 tot 267 micrometer in de hoogte, zijn deze criteria voldoen.
De druk zal alleen variëren in de richting van de stroom als er geen zijdelingse drukgradiënten bij de ingang. Dit kan worden beoordeeld met behulp van kleurstoffen of deeltjes in de stroom weg. Verder, voor de gestage stroom experimenten, is een pulsdemper opgenomen in de stroom circuit. De pulsdemper neemt het grootste deel van de pulsatility veroorzaakt door de roller pomp in het circuit, en het stelt ons in staat een benadering van de aanname van steady flow. Van de nota, moet de gebruikte pulsdemper verenigbaar zijn met de pomp en slangen die zich in het circuit, zodat het kan effectief elimineren pulsaties in de output stroom voor de specifieke frequenties van de rol pomp. In onze demonstratie het Masterflex L / S pulsdemper bereikt laminaire stroming bij gebruik op de persleiding met een Masterflex L / S-serie pomp (0 tot 600 RPM) en I / P-26 buizen. Voor de pulsatiele flow, kan een programmeerbare pomp worden gebruikt om verschillende golfvormen te genereren.
Voor de pulsatiele flow, kan een programmeerbare pomp worden gebruikt om verschillende golfvormen te genereren.
Bovendien is de schakeling is zodanig ontworpen dat monsters van perfusievloeistof kan gemakkelijk worden verzameld op verschillende tijdstippen zonder gevaar voor besmetting van de cellen of doorstroming medium. In ons voorbeeld, de concentratie van NO 2 - werd gemeten met chemiluminescentie meteen ionogene / Sievers Nitric Oxide Analyzer (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO) zoals eerder beschreven 10. De reductor wordt gebruikt voor nitriet analyse werd kaliumjodide in azijnzuur (14,5 M azijnzuur en 0,05 M KI), dat het reductiepotentieel tot nitriet om te zetten in NO heeft, maar is onvoldoende om een hogere stikstofoxiden, zoals nitraat te verminderen en is dus relatief specifiek voor nitriet. De in totaal geproduceerde hoeveelheid nitriet werd berekend als het product van de geproduceerde concentratie en het totale volume van het circuit, terwijl correctie voor volume verloren, terwijl het nemen van monsters 6.
De volgende stappen zijn van cruciaal belang voor het succesvol uitvoeren van flow experimenten:
- Het is wenselijk om belvorming te vermijden tijdens de flow set-up, omdat bubbels hebben de potentie om scheuren cellen van hun oppervlak. Dit kan vermeden worden door de zorg bij het plaatsen van het bovenste deel van de stroom kamer op het onderste deel, dat is bestbereikt door het houden van twee parallel aan elkaar en het verlagen van de top naar de bodem in een beweging zonder aanpassingen. Daarbij kleine luchtbelletjes die aanwezig kunnen zijn en / of drijvend in de stroom kanaal, zal worden omgeleid naar de zeepbel vallen aan beide uiteinde van de aluminium behuizing.
- Het is belangrijk ervoor te zorgen dat de uitstroom slangen in het reservoir reikt tot aan de onderkant van het reservoir's. Anders kan de lucht worden gezogen in de slang die loopt van reservoir naar kamer als het perfusaat daalt iets onder de slang te beëindigen.
- De onderzoeker moet vertrouwd zijn met de richting van de pomp stroom, zodat de pomp niet per ongeluk loopt in de tegenovergestelde richting bij aanvang van de stroming, die zou resulteren in de lucht wordt meegezogen in het circuit en de kamer.
- Om te voorkomen dat de vorming van schuim (als gevolg van gedenatureerde eiwitten in serum), adviseren we het verlagen van de slang die van kamer naar reservoir leidt tot ongeveer een centimeter boven de perfusate niveau in het reservoir. Echter, waardoor het boven de doorstroming medium niveau stelt u in staat te stromen in het reservoir te controleren tijdens het experiment.
- Wanneer vastschroeven van de kamer delen, is het belangrijk om de behuizing stevig vastpakken met een hand, terwijl de bediening van de elektrische schroevendraaier met uw andere hand. Merk op dat de beweging van de elektrische schroevendraaier zal worden vertaald in het koppel dat de potentie heeft "de kamer smijten rond 'zodra de schroef is aangedraaid is.
- Om te voorkomen dat de druk vorming van golven in het circuit en tillen cellen van hun oppervlak, ervoor zorgen dat alle kranen open zijn, voordat beginnen stromen.
- Speciaal voor langere termijn flow studies (> 48 uur) adviseren wij het gebruik van de harder en veerkrachtiger leidingen te worden ingevoegd in de kop van de pomp om te voorkomen dat het breken van de slang.
- Het is mogelijk dat tubing 'migreert' in de kop van de pomp als gevolg van slecht aangepaste pompkop tanden. Daarom raden wij nauwlettend aandacht aan hoe de kuipING is bevestigd in de pomp kop en markering elk uiteinde van de buis met een markering pen, zodat u gemakkelijk kunt merken wanneer de slang is 'getrokken' of verdreven tijdens het experiment.
- Altijd zorgvuldig voorafgaande controle elke aansluiting van het circuit en kamer naar het starten van de perfusie, om lekkage van perfusaat te voorkomen tijdens een experiment te wijten aan een gebrekkige aansluiting. Dit is vooral belangrijk voor de instroom en uitstroom aansluitingen van puls dempers!
- Vergeet niet om blootstelling aan licht te beperken als je gebruik maakt fluorescente labels.
Een mogelijke beperking van onze stroom kamer is dat de hoogte wordt bepaald door de hoogte van het kanaal bewerkte in het aluminium. Dit heeft echter het voordeel van het niet hebben om na te gaan en vóór de hoogte van het kanaal elk experiment en dus vereenvoudigt de schuifspanning berekeningen van alleen maar het aanpassen van de pomp stroom naar de gewenste waarde. Afhankelijk van uw onderzoek doelen, kan het wenselijk zijn omverhoging van de shear stress, zonder verhoging van snelheid van de pomp. In dit geval raden wij aan het verhogen van de perfusaat de viscositeit, bijvoorbeeld het toevoegen van dextran aan het medium 11.
Een mogelijke beperking van de stroom circuit is het grote volume aan medium gebruikt, die kan problematisch zijn bij een poging om een zeer kleine concentraties van de cel metabolieten te kwantificeren. Hoewel hier niet getoond, is het mogelijk om het circuit volume aanzienlijk te verminderen door middel van een kleinere reservoir en pulsdemper en slang lengte en diameter afnemen.
Daarnaast zijn er diverse andere commercieel beschikbare systemen die gebruikt kunnen worden om de vloeistof shear stress van toepassing op cellen in cultuur. Microfluïdische-gebaseerde systemen, bijvoorbeeld het BioFlux systeem van Fluxion, zodat gelijktijdige analyse van cellen in verschillende microfluïdische stromingskanalen geladen met oplossing in zowel platen als input en output reservoirs voor deze kanalen 12,13,14. Echter, deze en andere micro-fluïde systemen zijn niet compatibel met standaard microscoop dia's en het niet mogelijk voor het herstel van een voldoende groot aantal cellen voor verdere experimenten, zoals RT-PCR of Western Blot. Verder zijn ze minder gebruiksvriendelijk, kosten een minimum van 40.000 dollar en kan een totaal van meer dan $ 100.000 te bereiken, afhankelijk van bijkomende apparatuur.
Twee macrofluidic systemen die beschikbaar zijn vanaf het Flexcell International Corporation, de Flexcell Streamer en de FlexFlow systemen, zijn met succes gebruikt om endotheelcellen 15,16,17, menselijke annulus cellen 18 en 19 fibroblasten onder vloeistofstroom omstandigheden te bestuderen. Een derde systeem, beschikbaar via GlycoTech, is gebruikt om de tumor celadhesie 20 en leukocyten adhesie 21 tot en met endotheliale monolagen te bestuderen.
De Streamer systeem maakt het mogelijk verschillende dia's worden uitgevoerd onder dezelfde schuifspanning omstandigheden in een keer, maar mist een kijkvenster en - in tegenstelling tot onzedesign - niet mogelijk is voor real-time visualisatie van cellen onder stroom.
Het FlexFlow systeem heeft een kijkvenster, maar vereist een rechtop microscoop, die misschien niet de standaard microscoop gebruikt in de meeste laboratoria. Verder is de FlexFlow systeem vereist een cel-gecoate dekglas te worden omgekeerd wanneer geplaatst in de stroom kamer. Dit sluit visualisatie van fluorescerende cellen op een ondoorzichtig oppervlak, zoals titanium-gecoat glas, die we zien in ons onderzoek. Ten slotte is de gespecialiseerde dekglaasjes moeten specifiek worden gekocht voor het FlexFlow systeem, dat in de multi-duizend-dollar prijsklasse, vergelijkbaar met het Flexcell Streamer systeem.
GlycoTech biedt ronde en rechthoekige parallelle plaat stroom kamers, die zijn aanzienlijk minder duur, maar vervaardigd uit gegoten acryl, die niet kunnen eenvoudig worden stamcellen geautoclaveerd als onze kamer. Van de nota, met andere stromen kamers die zijn beschreven worden autoclaveerbaarlijken niet praktisch, omdat ze speciale microscopische lenzen 22,23. Het GlycoTech systeem maakt gebruik van siliconen rubber pakkingen geplaatst tussen boven-en onderkant platen, die in dikte veranderen met herhaald gebruik en daardoor veranderen kamer hoogte boven de tijd (de fabrikant adviseert de aankoop van nieuwe na elke tien gebruikt). Onze aluminium kamer met ingebouwde O-ringen zorgt voor volledige oppositie van boven-en onderkant platen en zorgt voor een constante kamer hoogte tussen experimenten. Ten slotte vacuümpompen nodig zijn om een lekvrije verbinding in veel stroom kamer ontwerpen, inclusief de GlycoTech kamers, die niet noodzakelijk zijn in ons ontwerp te realiseren.
Overwegende dat het hier niet getoond, kan de stroom kamer worden gehouden onder een microscoop tijdens de hele stroom experiment voor real-time beeldvorming van celadhesie en / of gedrag. Als dit gewenst is, adviseren we met behulp van warmte lampen of een verwarmd kussentje onder de kamer naar de perfusaat temperatuur op 37 ° C. PelsDaar kan de rol pomp vervangen worden door een injectiepomp, als er geen 'recirculatie' van een van beide cellen of metabolieten of experimentele geneesmiddelen of agenten is gewenst 24.
Het is ook mogelijk om anders gelabelde cellen stroom over hechtende cellen, bijv. TL-bloedplaatjes over een laag die confluente EPC's (met behulp van de bloedplaatjes assay beschreven door Achneck et al.. 6,25) tot cel-cel interactie te evalueren onder vloeistof shear stress. Onze flow kamer combineert de waardevolle eigenschappen van andere beschikbare stroom kamers, zoals een perfusaat sampling-poort en een kijkvenster en heeft het belangrijke voordeel van compatibiliteit met ofwel een omgekeerde of rechtop microscoop. Het is volledig autoclaveerbaar en zorgt voor herhaalde experimenten bij een constante kamer hoogte en zonder de noodzaak van vacuümpompen om een lekvrije afdichting te bereiken.
Disclosures
De productie en de vrije toegang van deze video-artikel wordt gesponsord door Cole-Parmer Instrument Co
Acknowledgments
De auteurs willen graag Joe Owen te bedanken in de Biomedische Instrument en Machine Shop voor zijn onvermoeibare inspanningen in bewerking en de montage van de doorstroming kamer delen en Matt Maudsley van Leica Microsystems voor de ondersteuning in technieken om de afbeelding cellen doorstroming kamers. We zijn dank verschuldigd aan Kevin Collins van Duke Perfusie Services en Dr Steve Wallace bij de afdeling Biomedical Engineering voor nuttige suggesties over stroom circuit design. Wij zouden ook graag de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program bedanken voor de ondersteuning van Alexandra Jantzen en de NIH voor hun steun door middel van Grant "Autologe EPC-voering aan biocompatibiliteit van de bloedsomloop te verbeteren apparaten assist" RC1HL099863-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Cole-Parmer | 07940-12 | |
| 1-Way Stopcoks | Cole-Parmer | 30600-00 | |
| 30 ml Syringe | BD Biosciences | 309650 | |
| 4 -Way Stopcocks | Cole-Parmer | 30600-04 | |
| Aluminum Alloy | N/A | 6061 | |
| Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 267061 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| DMSO | Research Organics | 2162D | |
| DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| EGM-2 Singlequots | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Female Luer Adaptor | Cole-Parmer | SI-45500-04 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |
| Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole-Parmer | 34594-24 | |
| Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-16 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| H–chst Stain Solution | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| Hyclone FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.01 | |
| L-glutamine | Lonza Inc. | 17-605E | |
| Male Luer Adaptor | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV | |
| Barbed Polypropylene Fittings | Cole-Parmer | 06365-90 | |
| O-Rings | N/A | AS568A | |
| Pulse-Dampener | Cole-Parmer | 07596-20 | |
| Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole-Parmer | 7524-40 | |
| Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole-Parmer | 07518-60 | |
| Slide | Cole-Parmer | 48500-00 | |
| Soft Tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 02915-12 | |
| Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 | |
| Trypsin EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza Inc. | CC-5002 | |
References
- Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
- Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
- Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).
- Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).
- Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
- Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
- Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
- Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
- Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
- Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
- Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
- Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
- Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
- Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
- Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
