Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Parallell-platta Flow avdelningen och kontinuerligt Circuit att utvärdera Endothelial stamceller i laminärt flöde Shear stress

doi: 10.3791/3349 Published: January 17, 2012

Summary

Vi beskriver en metod att föremål anhängare celler att laminärt flöde skjuvspänning i en steril kontinuerligt flöde krets. Cellernas vidhäftning kan morfologi studeras genom de genomskinliga kammaren, prover från kretsen för metabolit analys och celler skördas efter skjuvning exponering för framtida experiment eller kultur.

Abstract

Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en teknik för att föremål anhängare celler villkor laminärt flöde och utvärdera deras svar på såväl kvantifierbara vätska skjuvspänningar 1.

Vår flöde kammare design och flöde krets (Fig. 1) innehåller ett transparent visning region som möjliggör testning av cell adhesion och avbildning av cellmorfologin omedelbart före flöde (Fig. 11A, B), vid olika tidpunkter under flöde (Fig. 11C) och efter flöde (Fig. 11D). Dessa experiment illustreras med humant navelsträngsblod som härrör från endotelceller progenitorceller (EPC) och svin EPC 2,3.

Denna metod är också tillämplig på andra anhängare celltyper, t.ex. glatta muskelceller (SMC) eller fibroblaster.

Kammaren och alla delar av kretsen är lätt steriliseras med ånga autoklavering. I motsats till andrakammare, kan t.ex. mikroflödessystem kammare, ett stort antal celler (> 1 miljon beroende på cellstorlek) skall krävas in efter flödet experiment under sterila förhållanden för cellodling eller andra experiment, till exempel DNA eller RNA-extraktion, eller immunohistokemi (Fig. 11e), eller svepelektronmikroskop 5. Den skjuvspänningen kan justeras genom att variera flödet i perfusionsvätskan, vätskan viskositet, eller kanalen höjd och bredd. Det senare kan minska vätskevolym eller behöver cellen samtidigt som endimensionella flöden bibehålls. Det är inte nödvändigt att mäta kammare höjd mellan experiment, eftersom kammaren höjden inte beror på användningen av packningar, vilket kraftigt ökar lätthet av flera experiment. Dessutom möjliggör kretsdesign lätt insamling av perfusatet prover för analys och / eller kvantifiering av metaboliter utsöndras av celler i vätskan skjuvspänning exponering, t.ex. kväveoxid (Fig. 12) 6

Protocol

1. Endothelial stamceller isolering

  1. Före varje samling av perifera blod, skicka din forskning protokoll till din Institutional Review Board (IRB), och efter dess godkännande, får tillgång till frivilliga givare "informerat samtycke (perifert blod insamling och EPC isolering hade godkänts av Duke University IRB och är i full överensstämmelse med USA: s krav relaterade till skyddet för människors forskning deltagare).
  2. När du arbetar med animaliskt ursprung EPC har din forskning protokoll som godkänts av din Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Alla våra svin experiment hade godkänts av Duke University IACUC och genomfördes i enlighet med de högsta normerna för humana vård.
  3. För isolering av endotelceller progenitorceller, samla in 50 ml av perifert blod via standard flebotomi teknik från en samtyckt frivilliga givare i blodpåsar kollektion fylld med antikoagulantia citrate fosfat dextros och späd lösningen 1:1 med Hanks buffrad saltlösning (utan CaCl 2, 2 MgCl, MgSO 4) och lager på lika volymer av Histopaque att skapa väldefinierade lager.
  4. Centrifugera (30 min, 740 g, låg break inställning) och samla mononukleära celler (MNC) (buffy coat) skikt. Resuspendera och tvätta multinationella företag x 3 med Dulbecco s Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) med 10% fetalt bovint serum (FBS) x 10 min, 515 g, innan plätering i två 12-bra plattor i full EPC tillväxt medium (MCDB-131 medium med 5 ml 200 mM L-glutamin, 10% FBS och EGM-2 SingleQuots) vid 37 ° C, 5% CO 2.
  5. Sakta förändras medelstora var 24 timmar för de första 7 dagarna, sedan varannan dag. EPC kolonier kan identifieras efter en genomsnittlig tid på 14 dagar baserat på deras kullersten morfologi. När EPC i kultur täcker ¼ av 12-bra yta, expandera celler och bekräfta EPC identitet med flödescytometri genom att testa för förekomst av ytan markörerCD31 och frånvaro av CD14, CD45 som tidigare beskrivits 6. Andra tester som kan utföras inkludera cellmorfologin och märkning med DII-Ac-LDL.
  6. För de experiment som beskrivs häri, expandera isolerade EPC tills de är nästan sammanflytande i 3 T-75 kolvar cellodling i EPC medium i en fuktig inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.

2. Skjuvspänning beräkning

  1. Vi rekommenderar att dessa beräkningar utföras innan tillverkningen kammaren och kanal för att få en grundlig förståelse av de villkor som kan uppnås. Beräkna flödet av perfusatet i din krets baserad på önskad skjuvspänningar som skall tillämpas på de celler enligt ekvation 1 1,

Ekvation 1

där Q är det önskade flödet är τ målet shör stressen agerar tangentiellt på cellerna, w bredden av flödet kammaren, h höjden av flödet kammare, och μ är viskositeten i perfusatet (flödet medium).

  1. Ett typiskt värde på viskositet (μ) för medium som används är 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Observera att viskositeten också kan höjas genom att använda hög molekylvikt dextran, om så önskas 7. Ett typiskt värde på målet skjuvspänning (τ) som används är 15 dynes / cm 2 (normal arteriell skjuvspänning) eller 100 dynes / cm 2, om supra-fysiologiska skjuvspänning önskas. Vår kammare har normalt en bredd (B) på 1,9 cm och höjd (h) i intervallet 166 till 267 ìm.

3. Flöde kammare tillverkning

  1. Skär toppen och botten plattor av the kammare från aluminiumlegering 6061 rektangulär lager med topp dimension 7 x 2 x 0,5 "och botten mått 7 x 2 x 0,25".
  2. Recess topplattan i mitten delen till 0,125 "djup och lämnar 0,950" per slutet för 1,375 "bred x 0,3125" djup vätskebehållare.
  3. Borra 1 / 16 "bred x 0,625" långa tider från undersidan för att tränga in till reservoaren på inflödet och slutar utflöde.
  4. Vid slutet av varje topplatta, borra ett centralt beläget 10/32 "spår per tum (TPI) hål för polypropen 1 / 8" slanganslutning att penetrera vätskebehållare. På inflödet slutet, skapa en plugin med 10/32 "TPI genom hålet för polypropen 1 / 8" slanganslutning.
  5. Taper toppen undersidan från vätskan inflödet till glaset fönstret på 0,518 grader för en ordentlig blandning av vätska.
  6. Skär ett fönster glasskiva i bottenplattan i linje med den övre fönstret. Använda akvarium cement, lim en glasskiva i kammaren. Låt härda i minst 24 timmar.Se till att fönstret är infälld så att en 75 x 25 x 1 mm mikroskop glasskiva kommer att sitta infälld i kammaren.
  7. Skapa en fördjupning för en O-ring runt undersidan av toppen och botten plattorna så att de är placerade sönder av 0,02. "Sätt i O-ringar.
  8. Borra 10 matchande 8 / 32 "TPI hål i övre och nedre kammare för användning med 8 / 32" Försänkt skruv.

4. Flöde kretskort

  1. Montera hela flödet kretsen först, och sedan gå vidare med sterilisering.
  2. Fäst en 36 "-segmentet av hårt slang till ena änden av Pulsdämpare (via 1 / 8" anslutning). För den andra änden, fäster en 18 "-segmentet av mjuk slang.
  3. Placera en 1 / 8 "hane Luer-adaptern i slutet av 18" mjuk slang avsnittet nämns i steg 4,2. Anslut Luer till en 1 / 8 "hona Luer-adapter. Fäst den kvinnliga luer till en ny 18" segmentet mjuk slang.
  4. Borra tre hål i en 250 ml glasbägare mössa för att passa slangen. Jagnsert en 1,5 "-segmentet av mjuk slang (som avluftare) i ett hål och den fria ändarna av hårda och mjuka slangar genom de andra två hål i locket i 250 ml glasflaska (som reserv) (Fig. 2). Se till att den hårda slangen når botten av behållaren (som utflöde slang från reservoaren).
  5. Sterilisera ovanstående delar med ånga autoklavering vid 121 ° C i 60 min. Dessutom autoklav ett komplett flöde kammare, 3 x 2 "segment av mjuk slang, 1 hane och 1 tik 1 / 8" luer-adapter, 4 x ½ "och 6 x 5 / 16" 8-32 Försänkt skruv, en pincett , en 75 x 25 x 1 mm glasskiva (eller annan önskad cellytan material), och 2 kirurgiska handdukar.
  6. Placera sterila handdukar i laminärt flöde huva. Placera flödet kretsen, flöde kammare, 4 x 4-vägs kranar, 1 x 1-vägs kranen, och alla de steriliserade delar från steg 4,5 till denna sterila fältet.
  7. Nu använder sterila handskar för att ansluta två 4-vägs kranar. Sätt lock på den öppna prov portarna. Lossa manliga och kvinnliga luer-adapter att fästa två mjuka slangar delar av flödet kretsen och sätt i kontakten kranar (Fig. 3).
  8. Fäst den mjuka slangen in i behållaren till en 30 ml spruta och ta bort sprutan kolven. Fyll flaskan med 125 ml EPC medium (bild 4).
  9. Placera en steril spruta filter i luften ventilen (bild 4).
  10. Flytta flödet kretsen i en fuktig inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
  11. Kläm den hårda slangen in rullen pumphuvudet indicerat för användning med denna typ av slang (bild 5). Se till att slangen inte överlappar med montering rullen pumpen spår. Märk röret där det matas ut ur pumpen på båda sidor med en märkpenna.
  12. Se till att alla kranar är avstängda mot provet hamnar och öppna längs flödet krets. Starta pumpen. Kontrollera att flödesriktningen. Perfusatet bör gå frOm glaset reservoaren genom den hårda slangen i Pulsdämpare.

5. EPC fluorescerande märkning

  1. Medan flödet krets värms till 37 ° C, förbereda celler för sådd på bilden. Observera att fluorescerande märkning krävs om cellerna ska visualiseras på ogenomskinliga material, t.ex. titan (Ti).
  2. Skapa en lösning mM lager för cell-Tracker Orange (CTO) genom att späda 50 mikrogram CTO pulver med 90 ìl dimetylsulfoxid (DMSO). Var noga med att skydda denna blandning från ljus exponering (stänga av ljuset när du arbetar i flödet huva).
  3. Skapa en 2 mikroM brukslösning av CTO genom att späda 36 ìl av CTO-stamlösning till 18 ml serum-fri MCDB-131 medium.
  4. Skölj EPC i tre nära sammanhängande T-75 flaskor cellodling med 10 ml DPBS (utan Ca eller Mg).
  5. Tillsätt 6 ml av 2 mikroM CTO fungerande lösning till varje kolv. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C. Skölj varje kolv x 2 med 10 ml DPBS (utan Ca eller Mg).
  6. Tvätta genom centrifugering x 5 min på 600g och återsuspendera i 5 ml EPC medium.

6. Cell sådd av bilden innan flödet kammare montering

  1. En bild gjord av glas, titan eller annat material kan användas, och skjut ytan kan ändras genom att snurra beläggning med polymer eller lägga ett lager metall. Placera bilden i en steril rektangulär fyra kammare cellodling fartyg (eller använd vävnadsodling bild kolv om polystyren yta önskas). Räkna celler och utsäde 1,5 x 10 6 celler på bilden i 5 ml EPC medelstora x 6 tim om en sammanhängande cellager önskas i början av flödet (bild 11A).
  2. För att testa cell sprids och vidhäftning i vätska skjuvspänning, låt 3 x 10 6 celler att hålla sig för bara 15 min innan påbörjandet av flödet (Quick-seeding) (

7. Flöde kammare montering

  1. Använda sterila handskar, anslut en 2 "mjuka slangar segmentet till en 1 / 8" hona luer-adapter. Anslut en annan 2 "mjuka slangar segmentet till en 1 / 8" hane Luer-adapter.
  2. Fäst 2 "mjuka slangar med kvinnliga luer-adapter till inflödet hamnen. Fäst 2" mjuka slangar med Luer till utloppet porten. Fäst 4-vägs kranar till båda dessa luer adaptrar. Anslut resterande 2 "mjuka slang bit åt sidan Port-kontakten som kommer från bubbelfälla och bifoga en 1-vägs kran (bild 6).
  3. Använda steril pincett, ta bort cell-seedade bild från cellodling fartyget (eller om du använder en bild kolv, ta bort kolven på bilden) och placera den i fördjupningen på bottenplattan av flödet kammaren. Se till att bilden är placerad i cellen-seedade uppåt.
  4. Pipettera 10 ml varmt EPC mellanstora på bilden. Låt mediet för att täcka bilden och flöde kammare, BUT Spill inte mediet under O-ringen på bottenplattan.
  5. Placera den övre plattan av flödet kammare på bottenplattan, rikta in skruvhålen. Var noga med att inte införa luftbubblor i kammaren under detta steg genom att hålla de två plattorna parallella.
  6. Skruva tallrikar tillsammans (en automatisk batteridriven skruvdragare påskyndar denna process).
  7. Avlägsna luftbubblor från inflöde bubbelfälla genom att öppna 1-vägs kranen ansluten till inflödet sida bubbelfälla hamnen och försiktigt spola inflödet rör med EPC-mediet med hjälp av en 10 ml spruta. Stäng sedan av den här kranen och kronan på verket (bild 7).
  8. Nu tar bort luftbubblor från kammaren kanalen genom att öppna utflöde port 4-vägs kranen och genom att försiktigt spola EPC medium genom flödet kammaren igen med en 10 ml spruta. Om stora bubblor kvar, öka utflödet änden av kammaren till en 45 ° vinkel (bild 8).
  9. Cap alla 4-vägs kranen anslutningar och stängav dem. Flytta flödet kammaren in i inkubatorn med den samlade flödet kretsen (bild 9).
  10. Pausa pumpflöde krets. Stänga kranarna flödet krets i flödesriktningen för att förhindra läckage och för att hålla insidan av kammaren steril. Transport flödet kammaren från flödet huven till flödet kretsen. Anslut flödet kammaren till flödet kretsen. Öppna kranarna i riktning mot flödet. Återuppta flödet pumpen. Se till att perfusatet flyter i rätt riktning. Justera flödet till önskat skjuvspänningen.
  11. Under flödet experimentet, kan flödet kammaren tas bort från kretsen till bilden cellerna via ljus eller fluorescerande mikroskopi. För att göra detta, koppla flödet kammaren från flödet kretsen vid kranen-kranen anslutningar. För att behålla steriliteten av kammaren, stänga kranarna flödet kretsen och flöde kranar kammare i flödesriktningen och mössa alla kranar innan du tar bort flödet kretsenfrån inkubatorn (bild 9).

8. Perfusat provtagning

  1. För enkel samling av perfusatet prover för analys (t.ex. kväveoxid syntesen), första pausen pumpen.
  2. Stäng kranen ligger närmast Pulsdämpare. Ta bort den skyddande locket och sätt i en liten spruta, t.ex. 3 ml spruta, i provet porten. Behåll locket och se till att det inte blir förorenat genom att placera den upp och ner.
  3. Stäng kranen i riktning av flödet kammaren, hålla provet porten och krets i riktning mot Pulsdämpare öppen.
  4. Rita önskad mängd prov, t ex 150 l, från kretsen. Stänga kranen mot provet porten innan du tar bort sprutan. Förvara perfusatet provet i en märkt injektionsflaska och fryser vid - 80 ° C (för kväveoxid bestämning vid en senare tidpunkt).
  5. Recap provet hamnen och se till att alla kranar är öppna innan du börjar flöde.

9. Representativa resultat

Med vår snabb-frö-metoden, kan blod som härrör från endotelceller progenitorceller seedas på titan diabilder i 15 minuter och följa under fysiologiska (arteriell) skjuvkrafter på 15 dynes / cm 2.

Som visas i figur 10, EPC sprids under inflytande av flödet från 210 ± 11,4 ìm 2, direkt efter sådd, till 657 ± 39,1 ìm 2 efter 3 timmar, och till 1152 ± 55,3 ìm 2 efter 24 timmars vätska skjuvspänningen av 15 dynes / cm 2 (skillnaden mellan grupperna är statistiskt signifikant med p <0,0001, 1-vägs ANOVA). Parallellt med ökningen i cell området, vilket kan avbildas genom den transparenta kammare med antingen ljus eller fluorescerande mikroskop, rundhet beräknas enligt ekvation 2 6

/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>

minskade från 878 x 10 -3 ± 5,9 x 10 -3, direkt efter sådd, till 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 efter 3 timmar, och till 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 efter 48 timmar av samma vätska skjuvspänningen exponering (skillnaden mellan grupperna är återigen statistiskt signifikant med p <0,0001, 1-vägs ANOVA).

Figur 11D visar att EPC anpassa och orientera i flödesriktningen efter 48 timmar av vätska skjuvspänningen på 15 dynes / cm 2 jämfört med deras slumpvis ordnade efter en statisk seedning period av 6 timmar, visas i figur 11A.

Vår metod gör det också möjligt för att erhålla prover av perfusatet vid i förväg bestämda tidpunkter för analysen och / eller kvantifiering av utsöndrade cell metaboliter. Som ett typexempel vi skildrar produktionning av nitrit (NO 2 -) under en 48 timmars flöde experimentera med svin EPC i Figur 12. Vi mätte direkt denna primära oxidation produkt av kväveoxid (NO) som en surrogatmarkör för NO i medelstora prov som tagits från flödet kretsen vid olika tidpunkter vara 12,0 nmol efter 6 timmar, 13,1 nmol vid 12 timmar, 16,3 nmol vid 24 timmar och 24,6 nmol efter 48 timmar för 1 x 10 6 celler på 15 dynes / cm 2 6.

Figur 1
Figur 1. Schematisk visar en översikt av flödet kretskort och flöde experiment. (A) Flow kretskort utan att flödet kammaren. Här ingår reservoaren, Pulsdämpare, hårda slang, mjuk slang, 4-vägs kranar och anslutna luer-adapter och luftfilter. (B) Anslutande flödet kammaren via den hårda slangen segmentet till pump huvudet. (C) i sertion i EPC-seedade glida in i bottenplattan av flödet kammaren (D). Montera resten av flödet krets med flödet kammaren.

Figur 2
Figur 2. Färdigmonterad flöde krets för sterilisering.

Figur 3
Figur 3. Monterade flöde kretsen efter sterilisering med avstängningskran ingår.

Figur 4
Figur 4. Påfyllning glaset behållaren med 125 ml av EPC medium.

Figur 5
Figur 5. Flow krets fastspänd i pump huvudet före flöde kammare införandet.

jpg "/>
Figur 6. Övre kammaren tallrik montering.

Figur 7
Figur 7. Spola bubbelfälla med EPC-medel för att avlägsna bubblor från inflöde sidan av kammaren.

Figur 8
Figur 8. Flushing kammaren med EPC medel för att avlägsna bubblor från bild och utflöde sidan av kammaren.

Figur 9
Figur 9. Monteras Helt flöde krets med in flöde kammare under ett flöde experiment.

Figur 10
Figur 10. EPC område (i ìm 2) ökar över tiden loppet av flödet experimentet.

files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
Figur 11. (A) ljusmikroskop bilden av HUCB EPC seedade på en fibronektin belagt glasskiva x 6 timmar före flöde vid 100 gångers förstoring. (B) HUCB EPC märkt med CTO och snabb-seedade på en Ti bild x 15 min före flöde visualiseras med fluorescerande mikroskop med 100 gångers förstoring. (C) Samma Ti bild med HUCB EPC som under (B), efter 3 timmar av flödet vid 100 dynes / cm 2 och avbildas genom det öppna kammaren vid 100 gångers förstoring. Notera spridning av celler, men ändå slumpvis ordnade efter 3 timmars flöde. (D) Samma Ti bild, nu efter 48 timmars flödesexponering vid 100 gångers förstoring. EPC är märkta med CTO och cellkärnor färgas med Hoechst färg (blå) efter flöde. Notera anpassningen av celler i flödesriktningen. (E) Svin EPC jämförelser Ti efter 48 timmar av flöde och 15 dynes / cm

Figur 12
Figur 12. Diagram visar ingen produktion av svin EPC under 48 timmar av flödet. En primär oxidation produkt av NO, nitrit (NO 2 -), mättes som en surrogatmarkör för NO från medium prover som samlats in vid olika tidpunkter under flödet.

Figur 13
Figur 13. Flödet kammaren är tillverkad av aluminiumlegering 6061 rektangulära lager, med den övre delen (A) är 0,5 "x 2" x 7 "och den nedre delen (B) 0,25" x 2 "x 7" i dimension. Den översta ärhyvlat på undersidan O-ringen kontaktyta till 0,45 "för att försäkra planhet för tätning. Den övre delen är infälld i mellersta delen till 0,125", vilket lämnar 0,95 "per slutet för en 0,3125" x 1,375 "vätskebehållare. Den övre delen är reservoar är gängad 3/8-24 TPI och 0,25 "djup för att få gängade rostfria proppar. Slots mäter 1 / 16 "x 0,625" var bearbetad på undersidan att tränga in i behållaren. Inflödet sidan kontakt har en 10/32 "genom hålet för en polypropylen 1 / 8" slanganslutning att fästa en kran. Varje enhet änden har ett centralt beläget gängad 10/32 TPI med 0,25 "djupa delen av en polypropylen 1 / 8" slanganslutning i 0,45 "x 2" slut. Ändarna använda en 0,07 "hål från botten av trådarna genom att tränga in i behållaren. Undersidan av den övre delen har en avsmalnande område 0,6875" bred, 0,518 grader från centrum av en LH kortplats för ett avstånd på 1,460 ". Detta kona blandningar till en plan yta 0,6875 "bred x 0,0118" djupa och 0,590 "från slutet av glass (eller annan yta, t.ex. titan bild) urtag. Denna platta måste vara jäms med glas (eller annan yta, t.ex. titan bild) när bilden är installerat. Den koniska och platta är polerad. Ytan på bilden är 0,0118 "infälld från undersidan ytan. 0,0118" fördjupning fortsätter att reservoaren öppningen på RH slutet. En O-ring är infälld helt runt platser och skjut lämnar 0,020 "ursprungliga ytan mellan O-ringen spår och bild. Övre och enheter botten borras tio hål. Har frigående hål för 8 / 32 TPI försänkt platt Den övre delen skruvar. Den nedre delen har hål placeras matchande toppen hål och gängade 8 / 32 TPI. Botten Enheten har en klar glasskiva fönster infällda i jämnhöjd med dess yta ligger över cellytan glasskiva (eller titan bild). Enheten har en O-ring groove som innefattar spår i den övre enheten med bredd att lämna 0,04 "av ursprungliga ytan mellan botten bilden och den inre O-ringen spåret. O-rings är röda silikon AS568A, Dash nummer 044 för den övre delen och 046 för den nedre delen.

Discussion

Vår flöde krets och flöde kammare tillåter oss att ämnet anhängare celler, t.ex. EPC, för att definieras betonar vätska skjuvning. Eftersom kammaren topp och botten är transparenta, cell adhesion och morfologi kan utvärderas antingen i realtid, genom kammaren själv, eller efter ett flöde experiment och demontering av flödet kammaren. Vid den tidpunkten, kan cellerna skördas under sterila förhållanden och antingen åter pläterade, eller användas för att samla in deras DNA eller RNA, etc., för vidare analys.

För att uppnå laminärt flöde måste utformningen av kammarens vara sådant att flera villkor är uppfyllda.

Först måste flödet vara laminärt, som kan kontrolleras genom att beräkna Reynolds tal (Re), vilket är förhållandet mellan tröghetskrafter till viskösa krafter. (Om viskösa krafter dominerar, är Re liten och flödet är laminärt eller "fullt utvecklad" - vanligtvis för Re <2300.Om tröghetskrafter dominerar, blir flödet mer och mer slumpmässiga tills den är turbulent, vilket är fallet för Re> 4000.) Vi kan beräkna Re enligt ekvation 3 8,

Ekvation 3

Där ρ är den vätska densitet, Q flödet, är μ viskositeten, B och H är bredden och höjden av kammaren, respektive, och D h är den hydrauliska diametern, definierad enligt ekvation 4 8,

Ekvation 4

Reynolds tal av våra tre flöde kammare, med höjder mellan 166 till 267 ìm, intervall 13,9 till 34,6 vid flöden Calculated att få en skjuvspänning på 15 dynes / cm 2. Vid flöden beräknas för en skjuvspänning på 100 dynes / cm 2, varierade Reynolds tal av kamrarna 90,4 till 234. Alla dessa Reynoldstal är mycket lägre än 2300 och uppfyller kriteriet för laminärt flöde.

För det andra att för hastighetsfältet och skjuvspänning vara oberoende av avståndet längs flödet kanal (dvs fullt utvecklad), avståndet från vätskan inloppet till bilden måste vara längre än entrén längd, L e. Detta kan tillgodoses genom att beräkna entrén längden, enligt ekvation 5 9.

Ekvation 5

För de värden som anges ovan, varierar ingången längd 0,01 till 0,25 cm.

Tredje, för att säkerställa att hastighet och skjuvspänning i sidled inte varierarväsentligt från värdet för endimensionella kanal flöde Ph / 2L), måste förhållandet H / W vara mycket mindre än 1. För den genomsnittliga väggen skjuvspänningen under två-dimensionell flöde till 95% av väggen skjuvspänningen i endimensionella flöde måste H / B vara lika med 0,10, och för väggen skjuvspänningen under två-dimensionell flöde villkor som ska 97,5% av väggen skjuvspänningen i endimensionella flöde måste H / B vara lika med 0,05. Med dimensionerna av våra utformade flöde kammare 1,7 cm på bredden och 166 till 267 mikrometer i höjd, är dessa kriterier uppfyllda.

Trycket kommer att variera endast i flödesriktningen om det inte finns sidled tryckgradienter vid entrén. Detta kan bedömas med hjälp av färgämnen eller partiklar i flödet väg. Vidare, för jämnt flöde experiment, är en Pulsdämpare in i flödet kretsen. Den Pulsdämpare tar ut större delen av pulsatility orsakas av rullen pumpen i kretsen, och tillåter oss att närma antagandet om jämn ström. Notera bör Pulsdämpare används vara förenligt med pump och slangar som används i kretsen, så att det effektivt kan eliminera svängningar i produktionen flöde för den specifika frekvenser av rullen pumpen. I vår demonstration den Masterflex L / S Pulsdämpare uppnår laminärt flöde när det används om ansvarsfrihet linje med eventuella Masterflex L / S-serien pumpen (0 till 600 RPM) och I / P 26 slangar. För pulserande flöde, kan en programmerbar pump användas för att generera olika vågformer.

För pulserande flöde, kan en programmerbar pump användas för att generera olika vågformer.

Dessutom är kretsen utformat så att prov perfusatet kan enkelt samlas in vid olika tidpunkter utan att riskera förorening av celler eller flöde medium. I vårt exempel koncentrationen av NO 2 - mättes genom kemiluminiscens meden Ionics / Sievers kväveoxid Analyzer (NOA 280, Sievers Instrument, Boulder, CO) som tidigare beskrivits 10. De reduktionsmedel som används för nitrit analys kaliumjodid i ättiksyra (14,5 M ättiksyra och 0,05 M KI), som har potential att minska för att konvertera nitrit till NO, men är otillräcklig för att minska eventuella högre kväveoxider som nitrat och därmed är relativt specifikt för nitrit. Den totala mängden nitrit producerad beräknades som produkten av producerade koncentration och den totala volymen av banan medan du justerar för volym förlorad när provtagning 6.

Följande steg är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av flödet experiment:

  1. Det är önskvärt att undvika att bubblor bildas under flödet set-up, eftersom bubblor har potential att riva av celler från deras yta. Detta kan undvikas genom att ta hand när du placerar den övre delen av flödet kammare på den nedre delen, som är bäståstadkoms genom att hålla både parallellt med varandra och sänka toppen på botten i en rörelse utan justeringar. På så sätt, små luftbubblor som kan finnas och / eller flytande i flödet kanalen kommer att avledas till den bubbla fällor på vardera änden av aluminium.
  2. Det är viktigt att se till att utflödet slangen i behållaren når ner till reservoaren botten. Annars kan luft sugas in i slangen som leder från reservoaren till avdelningen om perfusatet sjunker något under slangen slutet.
  3. Forskaren bör vara väl förtrogen med ledning av pumpflödet så att pumpen inte av misstag köra i motsatt riktning vid påbörjandet av flöde, vilket skulle resultera i att luft sugs in i kretsen och kammarmusik.
  4. För att undvika skumbildning (på grund av denaturerad proteiner i serum), rekommenderar vi att sänka slangen som leder från kammare till reservoaren till omkring en tum ovanför perfusaTE-nivå inne i behållaren. Men att hålla det ovanför flödet medelhög nivå ger dig möjlighet att kontrollera flödet i reservoaren under experimentet.
  5. När skruva kammaren delarna tillsammans är det viktigt att ordentligt förstå huset med ena handen samtidigt som den elektriska skruvdragare med andra handen. Observera att vinka av elektrisk skruvdragare kommer att omsättas i vridmoment som har potential att "slänga kammaren runt" när skruven dras åt.
  6. För att undvika tryckvågor bildas i kretsen och lyfta celler från deras yta, se till att alla kranar är öppna innan du börjar flöda.
  7. Speciellt för längre sikt flöde studier (> 48 timmar) rekommenderar vi att använda hårdare och mer motståndskraftig slang som ska in i pumpen för att förhindra att bryta av rör.
  8. Det är möjligt att slangar "vandrar" inne i pumpen på grund av dåligt justerade tänder pumphuvudet. Därför föreslår vi ägnar stor uppmärksamhet åt hur badkaretning är säkrad i pumphuvudet och märkning vardera änden av slangen med en märkpenna så att du lätt kan märka om slangen är "dras in" eller lossnat under experimentet.
  9. Alltid noggrant kontrollera varje enskild kontakt av kretsen och kammarmusik före start av perfusionen, för att förhindra läckage av perfusatet under ett experiment på grund av en felaktig anslutning. Detta är särskilt viktigt för in-och utflöden kontakterna på pulsen dämpare!
  10. Kom ihåg att begränsa ljusexponering om du använder fluorescerande etiketter.

En eventuell begränsning av vårt flöde kammare är att höjden fastställs av höjden på kanalen frästa i aluminium. Detta har dock fördelen att inte behöva kontrollera och justera höjden på kanalen före varje experiment och därför förenklar skjuvspänningen beräkningar bara att justera flödet till önskat värde. Beroende på din forskning mål, kan det vara önskvärt attöka skjuvspänningen utan att öka varvtalet. I detta fall rekommenderar vi att öka perfusatet viskositet, t.ex. lägga dextran till mediet 11.

En eventuell begränsning av flödet kretsen är den stora mängden medium som används, vilket kan innebära problem när man försöker kvantifiera mycket små koncentrationer av cell metaboliter. Även om det inte visas här, är det möjligt att avsevärt minska kretsen volymen med hjälp av en mindre reservoar och Pulsdämpare och minska slang längd och diameter.

Dessutom finns det flera andra kommersiellt tillgängliga system som kan användas för att tillämpa vätska skjuvspänning till celler i kultur. Mikroflödessystem-baserade system, t.ex. BioFlux systemet från Fluxion, möjliggör samtidig analys av celler i olika mikroflödessystem flödet kanaler laddat med lösningen i brunnar fungerar som input och reservoarer utgång för dessa kanaler 12,13,14. Men dessa och andra mikroorganismerfluidic system är inte kompatibla med standard objektglas och inte möjliggör återvinning av ett tillräckligt stort antal celler för ytterligare experiment, såsom RT-PCR eller Western blot. Dessutom är de mindre användarvänligt, kostar minst $ 40.000 och kan nå en totalt mer än $ 100.000, beroende på tillbehör utrustning.

Två macrofluidic system som finns från Flexcell International Corporation, Flexcell Streamer och system FlexFlow, har framgångsrikt använts för att studera endotelceller 15,16,17, mänskliga annulus celler 18 och fibroblaster 19 i vätska flöde. Ett tredje system, tillgängligt via GlycoTech, har använts för att studera tumörens celladhesion 20 och leukocyt vidhäftning 21 till endothelial monolager.

Streamer systemet tillåter flera diabilder som ska köras under samma skjuvspänningen villkor på en gång, men saknar ett fönster och - till skillnad från våraDesign - inte medger realtid visualisering av celler under flödet.

Det FlexFlow Systemet har ett visningsfönster, men kräver en upprätt mikroskop, vilket kanske inte är det vanliga mikroskop används i de flesta laboratorier. Vidare kräver FlexFlow systemet en cell-belagd täckglas att vändas när den placeras i flödet kammaren. Detta utesluter visualisering av fluorescerande celler på en ogenomskinlig yta, som titan-belagt glas, som vi visar i vår studie. Slutligen, den specialiserade täckglas måste köpas särskilt för FlexFlow systemet, som i flera tusen dollar prisklass, liknande det Flexcell Streamer systemet.

GlycoTech erbjuder cirkulära och rektangulära parallell-platta flöde kammare, som är betydligt billigare, men tillverkas av gjuten akryl som inte lämpligen kan bero autoklaveras som vår kammare. Notera att andra flödet kamrar som har beskrivits vara autoklaverbaraförefaller opraktiskt eftersom de kräver speciella mikroskopiska linser 22,23. Det GlycoTech systemet använder kisel gummipackningar inföll mellan topp och botten plattor, vilket kommer att förändras i tjocklek med upprepad användning och därför förändras kammare höjd över tid (tillverkaren rekommenderar köp av nya efter var tionde använder). Vår aluminium kammare med inbyggd O-ringar tillåter komplett motstånd från topp och botten plattor och säkerställer konstant kammare höjd mellan experiment. Slutligen vakuumpumpar är nödvändiga för att uppnå en tät försegling i många utföranden flödet rum, inklusive GlycoTech kamrar, som inte är nödvändiga i vår design.

De som inte visas här, kan flödet kammaren hållas under ett mikroskop under hela flödet experimentet i realtid avbildning av cell adhesion och / eller beteende. Om detta önskas, rekommenderar vi att du använder värmelampa eller en uppvärmd platta i kammaren att hålla perfusatet temperaturen vid 37 ° C. Furdär kan rullen pumpen ersättas med en sprutpump, om ingen "recirkulation" av antingen celler eller metaboliter eller läkemedelssubstanser eller agenter önskas 24.

Det är också möjligt att flöda annorlunda märkta celler över anhängare celler, t.ex. fluorescerande trombocyter under ett lager av konfluenta EPC (med hjälp av trombocyter analys beskrivs av Achneck et al. 6,25) för att utvärdera cell till cell interaktion i vätska skjuvspänning. Vår flöde kammare kombinerar värdefulla funktioner av andra tillgängliga flöde kammare, såsom en perfusat provtagning port och ett fönster och har den viktiga fördelen av kompatibilitet med antingen en inverterad eller upprätt mikroskop. Det är helt autoklaverbara och tillåter upprepade försök vid konstant kammare höjd och utan behov av vakuumpumpar för att uppnå en tät försegling.

Disclosures

Produktion och fri tillgång till denna video-artikeln är sponsrad av Cole-Parmer Instrument Co

Acknowledgments

Författarna vill tacka Joe Owen inom det biomedicinska instrument och Machine Shop för hans outtröttliga insatser i bearbetning och montering av delar flödet kammaren och Matt Maudsley från Leica Microsystems för att hjälpa i tekniker för att bilden celler genom flöde kammare. Vi står i tacksamhetsskuld till Kevin Collins från Duke Perfusion Services och Dr Steve Wallace vid Institutionen för medicinsk teknik för bra förslag på flödet kretskonstruktion. Vi vill också tacka National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program för att stödja Alexandra Jantzen och NIH för deras stöd genom Grant "Autolog EPC foder för att förbättra biokompatibilitet av cirkulationsrubbningar hjälpa enheter" RC1HL099863-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml Syringe Cole-Parmer 07940-12
1-Way Stopcoks Cole-Parmer 30600-00
30 ml Syringe BD Biosciences 309650
4 -Way Stopcocks Cole-Parmer 30600-04
Aluminum Alloy N/A 6061
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) Thermo Fisher Scientific, Inc. 267061
Cell Tracker Orange Invitrogen C34551
DMSO Research Organics 2162D
DPBS (-/-) Invitrogen 14190-144
EGM-2 Singlequots Lonza Inc. CC-4176
Female Luer Adaptor Cole-Parmer SI-45500-04
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-2MG
Glass Bottle (250ml) with Cap Cole-Parmer 34594-24
Hard Tubing Cole-Parmer 06508-16
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Histopaque Sigma-Aldrich H8889-500ML
H–chst Stain Solution Sigma-Aldrich H6024
Hyclone FBS Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30071.01
L-glutamine Lonza Inc. 17-605E
Male Luer Adaptor Cole-Parmer EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium Cellgro 15-100-CV
Barbed Polypropylene Fittings Cole-Parmer 06365-90
O-Rings N/A AS568A
Pulse-Dampener Cole-Parmer 07596-20
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) Cole-Parmer 7524-40
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) Cole-Parmer 07518-60
Slide Cole-Parmer 48500-00
Soft Tubing Cole-Parmer 96400-16
Syringe filter Cole-Parmer 02915-12
Sytox Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11368
Trypsin EDTA Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution Lonza Inc. CC-5002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).
  2. Broxmeyer, H. E. Cord blood stem and progenitor cells. Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).
  3. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  4. Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress. Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).
  5. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).
  6. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  7. Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium. Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).
  8. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. Pearson Education. (2004).
  9. Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. Transport Phenomena in Biological Systems. Horton, M. J. Pearson Education. (2009).
  10. Allen, J. D. Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance. Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).
  11. Xiao, Y., Truskey, G. A. Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion. Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).
  12. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells. J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).
  13. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  14. Conant, C. G. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).
  15. Metaxa, E. Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).
  16. Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).
  17. Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose. J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).
  18. Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress. J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).
  19. Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients. J. Biomech. 35, 303-309 (2002).
  20. Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time. Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).
  21. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).
  22. Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).
  23. Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  24. Angelos, M. G. Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress. Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).
  25. Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).
Parallell-platta Flow avdelningen och kontinuerligt Circuit att utvärdera Endothelial stamceller i laminärt flöde Shear stress
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F. H., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).More

Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F. H., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter