Summary
En metod för att generera organotypic skivor från E12.5 murina embryonala mitthjärnan beskrivs. Den organotypic skiva kulturer kan användas för att observera beteende dopaminerga neuron eller andra ventrala nervceller mitthjärnan.
Abstract
Musen är en utmärkt modell organism att studera däggdjur hjärnans utveckling på grund av överflödet av molekylära och genetiska data. Men den utvecklar musen hjärnan inte är lämpliga för enkel hantering och avbildning in vivo eftersom musen embryot är otillgängligt och ogenomskinlig. Organotypic skiva kulturer av embryonala hjärnor är därför allmänt används för att studera murina hjärnans utveckling in vitro. Ex vivo manipulation eller användning av transgena möss tillåter modifiering av genuttryck så att delpopulationer av neuronala eller gliaceller kan vara märkta med fluorescerande proteiner. Beteende märkta celler kan sedan iakttas med time-lapse avbildning. Time-lapse avbildning har varit särskilt framgångsrik för att studera cellers beteenden som ligger bakom utvecklingen av hjärnbarken vid sena embryonala stadier 1-2. Embryonala organotypic skiva kultur system i hjärnan utanför framhjärnan är mindre väl etablehed. Därför är den rikedom av tidsförlopp imaging data som beskriver neuronal cell migration begränsad till framhjärnan 3,4. Det är fortfarande inte känt, om de principer som upptäcktes för ryggens hjärnan stämmer för ventrala områden i hjärnan. I den ventrala hjärnan finns nervceller organiserade i neuronala kluster snarare än lager och att de ofta måste genomgå komplicerade flyttande banor för att nå sin slutliga ståndpunkt. Den ventrala mitthjärnan är inte bara en bra modell för ventrala hjärnans utveckling, men innehåller också neuronpopulationer som dopaminerga nervceller som är relevanta i sjukdomsprocesser. Medan funktion och degeneration av dopaminerga neuron har undersökts i detalj i den vuxna och åldrande hjärnan är lite känt om beteendet hos dessa nervceller under sin differentiering och migration fas 5. Vi beskriver här generationen skiva kulturer från embryonala dag (E) 12,5 mus ventrala mitthjärnan. Dessa skiva kultgärder är potentiellt lämpliga för övervakning av dopaminerga neuron utveckling under flera dagar in vitro. Vi belyser de kritiska stegen i hjärnan skivor i dessa tidiga stadier av embryonala utvecklingen och diskutera förutsättningarna för att upprätthålla normal utveckling av dopaminerga neuron in vitro. Vi har också presentera resultat från avbildning tid förfaller experiment. I dessa försök var ventrala mitthjärnan prekursorer (inklusive dopaminerga prekursorer) och deras ättlingar märks i en mosaik sätt med hjälp av en Cre / loxP baserat inducerbara systemet öde kartläggning 6.
Protocol
Delar av detta protokoll ändras från Daza et al. 2007 7.
1. Förberedelser
- Kan förberedas en dag i förväg
- Bered 1x Krebs buffert (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mm NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mm glukos, 25 mm NaHCO 3, justera pH till 7,4. Filter sterilisera (0,22 ìm porstorlek) och förvara vid 4 ° C.
- Förbered odlingsmedium (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml DMEM höga glukos, 850 mikroliter av 30% glukos, 5 mL häst serum (25%). Tillsätt 200 mikroliter 100X Penicllin / streptomycin. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbered innan dissekering
- Bered 100 ml 4% låg smältpunkt Agar (LMP agaros) i 1X Krebs buffert: mikrovågsugn lösningen tills agarosen är helt upplöst och sedan placera agaros i en 45 ° C vattenbad.
- Fyll vibrationertome buffert bricka med iskall 1X Krebs buffert och starta kylelement (hålla vid 4 ° C). Fixa ett rakblad i bladet bärare och ställa upp de vibratome området med en skalpell, en fin pensel och en mini perforerad sked att plocka upp skivor. Förbered sterila petriskålar (35 x 10 mm) med 1x Krebs buffert för att samla in skivor. Håll på is.
- Set-up dissektionen område med sterila petriskålar (100 x 15 mm) för dissekering och mindre sterila petriskålar (35 x 10 mm) för att bädda, en liten sax, två fina pincett (Dumont 5), en mini perforerad sked, ett glas pasteurpipett Fire Polished med en rund sluten topp och 1 L 1X Krebs buffert på is. Torka alla dissektion verktyg med 70% etanol.
- Lägg odlingsmedium till brunnarna med en sex-brunnar (1,5 ml / brunn) och placera den i ett 37 ° C inkubator.
- Förbered en sex-brunnar med 1,5 ml / brunn steril 1X Krebs buffert och 15 mikroliter Penicilin / streptomycin (100X) / brunn. Under sterila förhållanden, placera Millicell Cell Culture sätts in i brunnar. Placera sex brunnar intill vibratome så att hjärnan skivor kan överföras på filtret membran omedelbart efter snittning.
2. Dissekering och inbäddning av embryonala hjärnor
- Bedöva en gravid kvinnlig mus med isofluran och offer musen genom halsdislokation (embryon bör vara på scenen E12.5). Dissekera ur livmodern på musen genom att dra upp livmodern med pincett. Använd andra pincett för att separera mesometrium bort från livmodern. Placera livmodern i iskallt 1X Krebs buffert. Använd en bra pincett för att separera muskulösa livmoderväggen, Reichert membran och viscerala gulesäcken från embryot. Ta bort embryon från livmodern. Placera dissekerade embryon i ett separat petriskål med steril 1X Krebs buffert.
- Dissekera hjärnan under ett stereomikroskop. Att dissekera hjärnan, först skära av huvudet av embryot. Fix huvudetmed piercing fina pincetten genom huvudet (ögonhöjd). Använd en annan pincett för att försiktigt ta bort hud och skalle. Använd pincett för att försiktigt lyfta hjärnan ut och överför den till en petriskål med steril 1X Krebs buffert. Det är mycket viktigt att integriteten av hela hjärnan bibehålls under dissektion, eftersom skador på hjärnvävnaden kommer att skapa problem (t.ex. vävnad fragmentering) under sektionering på vibratome.
- Tvätta hjärnor gång i 4% med låg smältpunkt (LMP) agaros. Bädda in 2-3 hjärnor i en tid i färska 4% LMP agaros. Placera inbäddning rätter på is så jämn som möjligt. Använd en pasteurpipett med en brand-polerat rundad spets för att lyfta hjärnor tills botten av agarosen är solidifierat. Hjärnan ska bosätta sig i en platt läge horisontellt till botten av agarosen blocket.
- När agarosen har helt stelnat (efter ca 3 min), trimma agarosen omger hjärna och limma agarosen blocket mot provexemplaret scenenav vibratome. När man limmar blocken, se till att den ventrala sidan av hjärnan är parallell med plattformen, eftersom hjärnan ska klippas i en horisontell sektion plan.
3. Vibratome sektionering
- Använd ett rakblad för sektionering. För att få intakta skivor är det mycket viktigt för att hålla temperaturen vid 4 ° C under snittning.
- § 300 um tjocka horisontella skivor med en frekvens på 50 Hz, blad amplitud av 1,1 mm och en hastighet av 25 mm / sek.
- Använd fin pensel för att driva segmentet i en mini perforerad sked för att samla in hjärnan skivor och överföra dem till en skål med sterilt iskall 1X Krebs buffert. Välj den skiva som innehåller ventrala mitthjärnan vävnad (se figur 1). I en E12.5 mus hjärnan finns det bara ett 300 um horisontell skiva som innehåller ventrala mitthjärnan vävnad inklusive dopaminerga neuron.
4. Slice kultur
Steg 4,2-4,5 bör utföras under sterila förhållanden.
- Överför hjärnan skivor på en Millicell cellkultur membran in i en sex-brunnar med 1x Krebs buffert (se punkt 1.2.5). För att överföra segmentet använda mini perforerad sked (Fin Science Tools) och en fin pensel. Upp till 3 skivor kan placeras på ett membran.
- Överför membran med slice till sex brunnar med odlingsmedium (se punkt 1.2.5). Toppen av membranet bör inte omfattas av medium. Hjärnan skiva får medelstora underifrån och luft från ovan.
- Placera sex brunnar i en inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C. Det är mycket viktigt att skivorna är placerade i inkubatorn inom 2 timmar efter det första steget i dissekering. En mer förlängd tid för förberedelser kan leda till dålig överlevnad skivor.
- Skivor kan bibehållas in vitro upp till 3 dagar. Förändring 50% av substratet på den 2: a dagen.
- Låt skivorna återhämta sig i inkubatorn för 4-5 timmar före start time-lapse avbildning.
- För time-lapse avbildning, hålla skivor på membranet in och överföra infoga i ett 35 mm Ibidi μ-skålen (botten av skålen består av material med hög optisk kvalitet).
- Tillsätt 1 ml odlingsmedium plus 1,5 mikroliter askorbinsyra (200 mm) till skålen. Askorbinsyra skyddar skivorna mot fototoxicitet.
- Inkubera skivor i en klimatkammare vid 37 ° C med 5% CO2 under time-lapse avbildning.
6. Representativa resultat
Figur 1 visar att förbereda organotypic skiva kulturer från E12.5 musen hjärnan. Figur 2 visar horisontella organotypic skivor (akut och efter flera dagar i kultur) som erhållits blankett E12.5 musen hjärnan. Som jämförelse, frysta hjärnan sektioner på motsvarande utvecklingsstadiervisas. Mitthjärnan dopaminerga nervceller är visualiseras med immunohistokemi för tyrosin hydroxylas (TH). Mitthjärnan dopaminerga nervceller projekt till mål i framhjärnan. Dessa prognoser börjar form på E12.5 och sträcka sig mot det framhjärnan under de följande dagarna. Vi anser att utvecklingen av framhjärnan prognoser som en bra indikation för den normala utvecklingen av dopaminerga nervceller i kultur. I den horisontella skivor mellanhjärnan dopaminerga neuron förlänga prognoser mot sina rätta framhjärnan målområde. Efter 3 DIV (dagar in vitro) eller när framhjärnan målområden är skadade, avvikande prognoser sträcka sig mot den dorsala mitthjärnan. Exempel på koronalt skivor av E12.5 mitthjärnan visas i figur 3. Dopaminerga neuron visualiseras med immunfärgning för TH utöka avvikande prognoser till dorsala mitthjärnan. Figur 4 visar en analys av förökar, död och apoptotiska celler i organotypic slice kulturer. BrdU immunostaining att visualisera celler som förökar visar att celler förökar sig i kultur förhållanden efter en DIV. Spridning minskar efter 4 DIV. Efter 3 DIV, många celler i ventrala mitthjärnan genomgå nekros (propidiumjodid färgning) och apotosis (immunfärgning för klyvs caspase-3). Figur 5 visar vandrande stigar YFP-märkta nervceller övervakas i ett tidsförlopp imaging experiment i en akut skiva .
Figur 1. Schematisk illustrerar beredning av organotypic skiva kulturer. 300 um horisontella hjärnan skivor förbereds av sektionering en E12.5 hjärnan med en vibratome. (A) Schematisk sagittala syn på en E12.5 mus hjärna. Nivåerna av sektioner indikeras. Området innehåller dopaminerga neuron skildras i rosa, är projektioner visas i blått. (B) Schema för de tre skivor som kan erhållas från rygg till ventrala och that innehåller både framhjärnan (FB) och mitthjärnan (MB). Observera att endast en skiva innehåller dopaminerga neuron (slice b). Lämplig skiva kan identifieras baserat på placeringen av ventriklar och kontinuitet i mellanhjärnan och framhjärnan vävnad (pilar, jämför avsnitt B med avsnitt A och C). Området innehåller dopaminerga neuron anges i rosa, är det område som innehåller dopaminerga prekursorer skildras i grön, blå pilarna visar utveckla prognoser. (C) skiva som innehåller dopaminerga neuron är odlade på membranet insatser. Förkortningar: VMB, ventrala mitthjärnan, DMB, dorsala mitthjärnan, Hyp, hypotalamus, Hb, hindbrain.
Figur 2. Prognoser för mitthjärnan dopaminerga nervceller i organotypic skiva kulturer är beroende av integritet framhjärnan. Immunohistokemi för tyrosin hydroxylas (TH) för att märka dopaminerga neuron. (A) Akut slice (0 DIV)som visar den normala platsen för dopaminerga nervceller i ventrala mitthjärnan. Den vita pilspets visar det område som visas i högre förstoring i infällda. Prognoser till framhjärnan har ännu inte utvecklats. Efter 1 DIV, prognoser till framhjärnan börjar ta form. Prognoserna sträcker sig in i framhjärnan vid 2-3 DIV. Vit pilspetsar ange var i cellen organ som visas i högre förstoring i inläggningar (vit ram). Gula pilar markera normala projektioner i intakta skivor visas i högre förstoring i inläggningar (gul ram). Aberrant prognoser utvecklas i skivor med skadade framhjärnan. Röda pilarna visar avvikande prognoser till rygg mitthjärnan som visas i högre förstoring i inläggningar (röd ram). Skador indikeras med röd asterisk. Efter 3 DIV, de flesta skivor (n = 5 / 7) hade avvikande prognoser mot dorsala mitthjärnan. (B) TH immunfärgning på horisontella frysta hjärnan sektioner i olika utvecklingsstadier att visa utvecklingenav dopaminerga projektioner in vivo. Vit pilspetsar ange var i cellen organ som visas i högre förstoring i inläggningar (vit ram). Gula pilar markerar placeringen av projektioner visas i högre förstoring i inläggningar (gul ram). Nivån på frysta snitt valdes för att bättre matcha nivån på organotypic slice kulturer. Observera att en enda frysta snitt (12 mikrometer) inte representerar hela organotypic slice (300 mikrometer). Därför var prognoserna visas på E13.5 och E14.5 observeras på avsnitt 120 ìm mer ventrala än det avsnitt som innehåller cellens organ (gula stjärnor).
Figur 3. Mitthjärnan koronalt slice kulturer färgas för tyrosin hydroxylas (TH) som markör för dopaminerga neuron. (AC) Slices efter 1, 2 eller 3 DIV. Dopaminerga nervceller utvecklas avvikande prognoser mot rygg mellanhjärnan (rED pilar). Pilspetsar visar placeringen av dopaminerga celler organ.
Figur 4. Celltillväxt och cellviabiliteten i mitthjärnan organotypic slice kulturer. (A) celler som förökar sig har märkts genom tillsats av BrdU (50 ng / ml, Sigma) till kultur medium för 18 h. Slices därefter immunostained för BrdU. Efter 1 DIV, är BrdU märkta celler som ligger i ventrikulära zonerna (röda pilar). Efter 4 DIV, celler som förökar är mer utspridda och en distinkt ventrikulär zon inte längre upprätthållas. (B) Nekrotiska celler har märkts genom tillsats av propidiumjodid (1μg/μL, Sigma) till kultur medium för 2 timmar och visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Efter 1 DIV, är den ventrala mitthjärnan (VMB) inte nekrotisk, men många propidiumjodid märkta celler kan ses i rygg mitthjärnan och framhjärnan. Efter 3 DIV cellens livskraft minskar i ventrala midbrai. Skala bar: 500 ìm (C) Immunostaing för klyvs caspase-3 för att visualisera apoptotiska celler. Vid 1 eller 2 DIV, bara några dopaminerga neuron (TH) är apoptotiska. Efter 3 DIV, dopaminerga nervceller börjar att genomgå apoptos. Paneler i mitten och till höger är större förstoring den inramade området i den vänstra panelerna. Den större förstoring Bilderna är maximal intensitet projektioner av z-staplar med 14-16 ramar. Bilder tagna var 0,5 ìm med en Zeiss Apotome uppsättning.
Figur 5. Flyttled av YFP-märkta nervceller i en akut slice. (A) Horisontell slice används för time lapse avbildning av YFP-märkta nervceller. Segmentet var inkuberas i 5 timmar innan avbildning. Cellerna var märkt med en inducerbara Cre / loxP systemet 6. Shh CreER möss 8 och Rosa loxP-STOP-loxP-EYFP möss reporter 9 viär van. Rekombination av ROSA reportern allelen (och EYFP uttryck) induceras i celler som uttrycker CreER (Shh-uttryckande celler), men endast vid administration av Tamoxifen (Sigma). I detta exempel var Tamoxifen (3 mg/40 g kroppsvikt) ges till gravida möss vid E8.5. Denna experimentella uppsättning resultat främst i märkningen av förstadier till dopaminerga nervceller och deras ättlingar i ventrala mitthjärnan 10,11. Skala bar: 500 ìm. (B) Spåra flyttled av YFP-märkta nervceller i en akut slice. Time-lapse bilder av YFP märkt öde kartlagt neuroner förvärvades var 30 min till en total tid av 5 timmar 30 min på en Zeiss Axio-Observer mikroskop (mål EG PlnN 10x / 0,3). Skivor inkuberades i en klimatkammare (inkubator XLS1 Pecon) vid 37 ° C och levereras med 5% CO 2 under avbildning. Utgångsläget av cellerna är markerade med röda pilar, migration positioner är markerade med röd asterisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den organotypic slice kulturen metod som presenteras här är ett system för kortsiktiga in vitro-analys av utvecklingen av dopaminerga neuron och deras flyttande och projektion rutter i den embryonala ventrala mitthjärnan. Vi fann att det finns ett antal kritiska steg i det protokoll som bör noggrant uppmärksammas för att få skivor som gör att den normala utvecklingen av ventrala mitthjärnan dopaminerga neuron. Det mest kritiska steget är dissekering av den embryonala hjärnan, som måste vara både snabb och exakt. I motsats till den generation av vuxna hjärnan skivor, är det viktigt att avsnittet hjärnan på en vibratome utrustad med ett kylsystem och att använda en låg frekvens i kombination med en hög hastighet för att få intakta skivor E12.5 hjärnor. Slutligen konstaterade vi att skivor måste sektioneras i horisontalplanet så att utöver den ventrala mitthjärnan framhjärnan målområden av dopaminerga prognoser ingår i segmentet.Vi märkte också att framhjärnan måste vara intakt i dessa skivor för att normal dopaminerga prognoser att utvecklas. I coronal skivor, framhjärnan målområden av dopaminerga nervceller är frånvarande och de nervceller bildar avvikande prognoser till dorsala mitthjärnan.
Vi visar att skivor fram med våra protokoll kan bibehållas in vitro i upp till 3 dagar och att dopaminerga neuron behålla sin normala position och prognoser framhjärnan. Dessutom är proliferativ kapacitet prekursorer ventrikulära zonen bibehålls under hela segmentet. Men efter mer än 3 dagar i kultur, minskar livskraft skivor dramatiskt. Följaktligen kan slice kulturer från E12.5 hjärnor användas för att bedöma tidiga stegen i dopaminerga neuronala migration och differentiering, men de kan inte användas för långsiktig experiment. För att bedöma senare delen av mellanhjärnan utveckling, produktion av skivor från något older embryon skulle kunna vara ett alternativ.
Vi visar vidare att organotypic skiva kulturer kan användas för time-lapse avbildning av ventrala mitthjärnan prekursorer och deras ättlingar, som har märkts in vivo med hjälp av en genetisk metod öde kartläggning. Eftersom märkningen metod som presenteras här endast markerar cellen organ, har vi använt skivor för att spåra neuronala migration. Däremot kan olika reporter linjer som även etiketten axonal prognoser vara bra att kontrollera axonutväxt av ventrala mitthjärnan nervceller in vitro 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Martine Emond och Isabel Brachmann för deras hjälp vid fastställandet av organotypic systemet bit kultur och Wolfgang Hübner och Liviu Gabriel Bodea för kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka Frank Costantini för R26 reportern möss och Cliff Tabin för Shh CreER möss. Denna studie har finansierats av ett Research Award från ministeriet för vetenskap och forskning i Nordrhein-Westfalen (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | EMD Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm | Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 - 30 | |
| Antibodies used for immunostainings: | |||
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Biosciences | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
