Summary
Burada hücreler reaktif oksijen türlerinin varlığını test etmek ve değerlendirmek için basit yöntemler öneriyoruz.
Abstract
Reaktif oksijen türleri, moleküllerin bir dizi zarar veren DNA ve RNA ve proteinler ve lipitler (lipit peroxydation) okside. Bu reaktif moleküller oksijen içeren ve H 2 O 2 (hidrojen peroksit), NO (nitrik oksit), O 2 - (oksit anyon), peroksinitrit (ONOO -), hydrochlorous asit (HOCl) ve hidroksil radikal (OH -) .
Oksidatif türlerin sadece patolojik durumlarda (kanser, iskemik reperfüzyon /, nörolojik ve kardiyovasküler patolojiler, enfeksiyon hastalıkları, inflamatuar hastalıklar 1, otoimmün hastalıklar 2, vb ...) altında değil, aynı zamanda bu tür hücre metabolizması 3 gibi fizyolojik (non-patolojik) durumlarında üretilir , 4. Nitekim, ROS (çoğalması, hücre aktivasyonu 5, 6, 7 göç vb.) Birçok hücresel sinyal yolları önemli rol oynamaktadır. ROS zararlı olabilir (o olarak adlandırılır, Hücre içi bölmeleri ve hücreler yüksek miktarda üretilen "ve nitrosatif oksidatif stres") genellikle süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve koruyan glutatyon (GSH) gibi antioksidanlar upregulating ROS yanıt tehlikeli serbest radikalleri zararsız moleküller (yani su) dönüştürerek. C ve E vitaminleri de ROS temizleyiciler (antioksidan) olarak tarif edilmiştir.
Serbest radikaller, düşük miktarda 3 yararlıdır . Makrofaj ve nötrofil-aracılı bağışıklık yanıtlarını, virüsler, patojenler ve tümör proliferasyonu 8 inhibe NO üretimi ve salınımı, içerir . NO aynı zamanda diğer ROS ile reaksiyona girer ve böylece, aynı zamanda bir detoks (ROS çöpçü) olarak bir rolü vardır. Uzun süren egzersiz 9, 10 kas adaptasyon için önemli olan kan akışını düzenlemek için damarları üzerinde Sonunda YOK davranır. Çeşitli yayınlar da ROS insülin sens yer aldığını göstermiştiritivity 11, 12.
ROS üretimini değerlendirmek için çok sayıda yöntem mevcuttur. Bu yazıda, birkaç basit, hızlı ve uygun fiyatlı testleri önerebilir; bu testlerin birçok yayın tarafından onaylanmıştır ve memeli hücrelerinde ROS veya onun etkilerini tespit etmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu testlerin bazıları birden fazla ROS tespit ederken, diğerleri sadece tek bir ROS algılar.
Protocol
1. Karboksi-H 2 DCFDA kullanarak ROS Algılama
Karboksi-H 2 DCFDA floresan olmayan, fakat bu reaktif okside ROS varlığı, yeşil floresan olur.
- Hemen önce, steril dimethylsülfoksit (DMSO) veya% 100 etanol karboksi-H 2 DCFDA taze bir stok solüsyon hazırlanır. Boya birden fazla erime / donma döngüleri kaçının.
- Hücrelerin Hepes ile yıkayın tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) ya da salin (PBS) orijinal orta izlerini silmek için fosfat tamponlu.
- Boya hücreleri (ve kontrol boya, cf not bölümünde) yükleyin. Bu testte biz Jurkat, bir insan lösemi hücre hattı kullanılmıştır. Azaltılmış serum (% 2) ile 1 mikrona kadar düzenli kültür ortamı bir final konsantrasyonda karboksi-H 2 DCFDA kullanın.
- Geleneksel bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) kültürlerin, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Kullanılmayan tüm boya çözümleri atın.
- Karboksi çıkarın-H 2 DCFDA orta içeren ve HBSS veya PBS ile iki kez yıkayın. Bu adım ileri, ışık hücreleri korumak.
- Karboksi-H 2 DCFDA yüklü hücreler için tercih edilen ilaç içeren taze orta ekleyin ve istediğiniz gibi inkübe edin. Bu örnek için H 2 O 2 (0.03%) 1 saat süreyle kullanın.
- ROS hücrelerin hemen FL1 kanalı (yeşil floresans) ya da floresan plaka okuyucu tarafından veya floresan mikroskobu kullanılarak flow sitometri ile analiz ederek değerlendirin. Floresan yeşil floresan için uygun uyarma ve emisyon dalga boyları kullanarak tespit edilebilir.
Not: Kontroller karboksi-H 2 DCFDA yüklenmiş tedavi edilmezse hücreleri ve lekesiz tedavi edilmezse hücreleri içermelidir. Karboksi-H 2 DCFDA peroksitler tespit bilinen değil, aynı zamanda diğer ROS tarafından okside olabilir. Bu reaktif da başka yollarla, örneğin 5 olarak oksidasyon duyarsız kontrolü boya değiştirilmiş olabilir (ve-6)-karboksi-2 ', 7'-dichlorBu nedenle test ofluorescein diasetat (karboksi-DCFDA) dahil edilmelidir.
2. Nitrik oksit (NO) üretimi ölçümü
Sülfanilamid ve N-1-napthylethylenediamine dihidroklorür (NED) çözümleri ve Nitrit standart gerekecektir. Bu testte Griess analiz denir.
NED çözüm:% 5 fosforik asit seyreltilmiş sülfanilamid% 1'lik bir çözüm olun: N-1-napthylethylenediamine dihidroklorür steril water.Sulfanilamide çözelti içinde seyreltilmiş% 0,1 çözüm olun. Nitrit Standart: 100μM 0.1M standart stok sodyum nitrit sulandırınız steril ortamda, aynı ortamda bir seri seyreltme yapmak.
Saklama Koşulları: oda sıcaklığında üreticisi tarafından yönetilen Mağaza kimyasallar. NED ve sülfanilamid çözümleri sulandırılmış zaman, karanlık, en fazla 3 ay, 4 ° C hemen sonra saklanır.
- 96 plaka Kültür hücreleri,kullanımı, her bir durum için triplicates ve deneylere göre uygun kontrolleri içermektedir.
- NO üretimini neden hücreleri davranın. Deneyde bizim hücrelerin tedavisinde lipopolisakkarit (LPS) (100 ng / ml) ve rekombinant IL-4 kullanın. Bu protokol, RAW 264,7, bir fare makrofaj hücre hattı (Fare lösemiye monosit makrofaj hücre hattı) kullanılır.
- Testin yapıldığı gün, hem reaktifler oda sıcaklığına getirin.
- Plaka Spin hücre Süpernatantları toplamak ve yeni bir 96 plaka 50μl transferi. Bir standart eğri yapmak için standart stok solüsyonu seyreltme kuyu sınırlayıcı hazırlayın.
- Her bir örnek ve iyi kontrol sülfanilamid Çözüm 50μl ekleyin ve iyice karıştırın.
- Karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- , Her bir örnek ve iyi kontrol için N-1-napthylethylenediamine dihidroklorür çözüm 50μl ekleyin ve iyice karıştırın.
- Karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Absorba ölçün520Nm ve 550nm arasındaki dalga boylarında filtresi ile hemen bir plaka okuyucu kullanarak nce.
Farklı plaka / çanak boyutları kullanmaktadır 1/1/1 hacmi, her çözümü ve örnek süpernatant için kullanın.
Bir mor renk pozitif kuyularda görünecektir. Standardı ile elde edilen sonuçlar, çözümler istikrar kontrol yardımcı olacaktır.
3. ROS aksiyon Tespiti: okside proteinler
ROS üretimi tanımlamak için farklı bir yöntem, proteinlerin oksidasyonu tespit ederek sonunda sonuçlarına bakmak için. Gerçekten de, ROS değiştirme glutatyon, birçok hücreleri dile getirdi ve bir antioksidan, ROS karşı koruyucu bir rol oynar. ROS bir disülfit köprüsü üzerinden ikinci bir glutatyon, sistein sülfidril (tiyol) grubu indirgenmiş glutatyon (GSH) sonuçları değişiklik ile oksidasyon ardından. (Okside protein GSSG) bir dimerized proteinin oluşumuna yol açar. GSH enzim glutatyon redüktaz tarafından GSSG değişiklik ile restore edilebilir. GSSG / GSH oranında artış oksidatif stres yansıtır. Aşağıdaki testi bu okside proteinlerin tespiti ve ölçülmesi dayanmaktadır. Bu yöntem, özel ROS için seçici değildir ama NO etkileri oldukça algılar, H 2 O 2, O 2 ve diğer ROS. Burada bioluminescent sinyalleri kullanarak okside (GSSG) ve düşük (GSH), glutatyon toplam miktarını ölçmek.
- Her zamanki gibi 96 plaka (şeffaf / beyaz, düz dipleri) Tohum hücreleri. Deneme için, biz yapışık Ham 264,7 ve A549 hücreleri ve süspansiyon Jurkat hücreleri için de ortalama 1x10 4 hücreler kullanıldı. Bu sayılar hücrelerinin büyüklüğüne göre ayarlanabilir. Test plaka takmak için izin önce plaka yapışık hücrelere gün öneriyoruz. Yeter kuyu gibi "orta sadece" için okside ve düşük protein tespiti için hazır olmalıdırkontrol grubu olarak tedavi edilmezse hücreleri. Kullanım koşulları için triplicates.
- Gerekli zaman için ilaç hücreleri davranın. Burada H 2 O 2 (sırasıyla 5mM ve 2.5mm) ile Jurkat hücreleri ve A549 hücreleri için 1h davrandı. Ham 264,7 hücreler 16 saat boyunca LPS 200ng/ml ile tedavi edildi Bu inkübasyon süresi boyunca, tüm reaktifler oda sıcaklığında (RT) getirin. En fazla 30 dakika Testi gerçekleştirmeden önce tüm reaktifler olun. Aşağıdaki tablo, iyi ortalama reaktiflerin birimleri gösterir. Mümkün olduğunda, bu test ile devam etmeden önce indirgen içeren ortamı çıkarmak için önemlidir.
| Yapışık hücrelere | Süspansiyon hücreleri | |||
| Toplam Glu Lizis | Okside Glu Lizis | Toplam Glu Lizis | Okside Glu Lizis | |
| Milli Ekonomi Modeli'nde, 25mm | hiçbiri | 0.5μl | hiçbiri | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 ul | 1 ul | 1 ul | 1 ul |
| Pasif Lizis Tampon, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Damıtılmış su | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Final de ortalama hacmi | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Yapışık hücreleri ile kuyulardan orta çıkarın. Süspansiyon hücreleri ile kuyu orta çıkarmayın.
- Indirgenmiş glutatyon reaktifi veya okside glutatyon reaktifi ile ilgili kuyu ekleyin ve 5 dakika RT çalkalanır.
- Luciferase nesil reaktif ve incubat eklee az 30 dakika RT.
- Luciferase algılama reaktif ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- 0,25-1 saniyede bir plaka okuyucu luminometre kullanarak entegrasyonu zamanda bioluminescent sinyal okuyun.
| Yapışık hücrelere | Süspansiyon hücreleri | |
| De ortalama hücre sayısı | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Iyi + ilaç başına hücre süspansiyonu | 100 ul, 3.4 önce çıkartılmalıdır | 25μl, kaldırılacak değil |
| Glutathione reaktifi | 50 ul | 25μl |
| Okside glutatyon Lizis Reaktif | 50 ul | 25μl |
| Luciferase Üretimi Reaktif | 50 ul | 50 ul |
| Luciferase Algılama Reaktif | 100 ul | 100 ul |
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1, karboksi-H2DCFDA boya kullanarak ROS Algılama . H 2 O 2 ile tedavi edilen Jurkat hücreleri (insan lösemi hücre hattı) ile tedavi olmayan hücrelere karşılaştırıldı . ROS flow sitometri, H 2 O 2 muamele edilen hücreler kontrolleri doruklarına (H 2 O 2 tedavili hücrelerde oksidasyon duyarsız boya ve sigara ile boyanmış kıyasla vardiya floresan pik tespit edilen yeşil fluoresces karboksi-H 2 DCFDA değişiklik neden olur karboksi-H 2 DCFDA ile boyanan ile tedavi edilen hücreleri). Sonuçlar, tedavi edilen hücrelerde ROS varlığını doğrulamaktadır.
Şekil 2 Algılama of Griess reaktifleri kullanarak YOK. RAW 264,7 hücreleri (fare makrofaj) LPS ve IL-4 ile tedavi edildi. Tedavi edilmezse hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında tedavi edilen hücrelerde NO üretiminin önemli bir artış tespit edildi.
| Hücre dizileri | Sigara ile tedavi edilen | Arıtılmış |
| Ham 264,7 | 13,0 | 8,3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5,2 | 2,8 |
Tablo 1 Algılama ROS aracılı protein oksidasyonu. RAW 264,7 LPS, Jurkat ve A549 hücreleri ile tedavi edildi (insan akciğer kanserli) hücreler H 2 O 2 ile tedavi edildi. Sonuçlar oranı azalır (GSH) / (GSSG) glutatyon okside olarak ifade edilir. Glutatyon (GSH) / (GSSG) daha düşük oranlara göre muamele edilen hücreler tespit edildiproteinler muamele edilen hücreler okside olduğunu açıklayan, işlenmemiş hücreleri kontrol eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inflamatuar hastalıklar, kanserler, iskemi / reperfüzyon, ve aynı zamanda, radyasyon veya kemoterapi gibi tedaviler gibi bazı patolojik durumlarda (yani sisplatin) ROS aşırı üretimi neden olur. Böylece, tespit etmek ve ROS düzeylerini ölçerek çok basit, klinik öncesi ve klinik çalışmalar önemlidir. Ancak, ROS çok kısa yarı ömre sahip ve tespit etmek için karmaşık olabilir. Burada, memeli hücreleri serbest radikal üretiminin tespiti için rutin olarak kullanılan ve yaygın olarak kabul edilmektedir basit testler öneriyoruz.
Algılama protokolleri kullanarak boyalar deneyci ROS varlığını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemleri (örneğin mikroskopi, akış sitometri, plaka okuyucu vb ... gibi) kullanmak için izin verir. Flow sitometri ve mikroskopi hücre canlılığı ve boş, en düşük ve yüksek ROS üreten hücrelerin yüzde bilgi sağlar. Mikroskopi hücre morfolojisi ve hücre adezyon ROS etkileri hakkında da bilgi sağlar. Algılama kullanarak plaka readers çoğunlukla nicel bilgi verir. Griess NO tespiti kantitatif ancak incelenen hücrelerinin şekil veya yapışma ile ilgili herhangi bir bilgi vermemektedir. Fare hücrelerinde NO algılama nispeten basittir. Ancak, düşük miktarda NO insan örnekleri bulunan, bu nedenle algılama prosedürün her adımı daha dikkatli olmak ve kontrolleri de önemlidir. Protein oksidasyon Algılama çalışılan hücreleri tarafından üretilen tüm ROS toplam etkilerini inceler, burada elde edilen sinyalin yoğunluğunu ROS miktarını temsil eder. H 2 O 2 etkilerinin tespiti katalaz tarafından çok hızlı bir şekilde elimine edilir yanıltıcıdır. GSH-GSSG-Glo tahlil yeteneği doğrudan GSSG algılamak için, bu testte hiçbir çıkarımı ile numuneler üzerinde doğrudan yapılır çünkü oksidasyon sorunları en aza indirmek ve daha az hücre ile. GSH / GSSG okuma, HBSS çözüm ya da glutatyon-medya (DMEM gibi) tercih edilmelidir artırmak için;serum serbest medya ile çalışan okuma daha da artıracak. Akılda tutulması gereken önemli olduğunu hücrelerinin doğa (doku tipi, normal karşı patolojik dokular), tek tabaka hücre kültürü confluency, aktivasyon ve stres durumu, yaş (pasajların sayısı) de dahil olmak üzere çeşitli faktörler hücrelerinin yayılması oranı ROS üretimi üzerinde bir etkisi olacak.
ROS tespiti için kullanılan çoğu reaktif, ışık, oksijen, ve sıcaklık değişimlerine duyarlı olan; deneyci, test edilmiş ve hızlı bir şekilde çalışmak için bütün reaktifler ve numune saklama ve kullanımı için özel bakım kullanır bu nedenle çok önemlidir.
Boyalar kullanarak her bir deney için ROS üretim / algılama kontrolleri (boya), (ilaç) tedavi edilmezse yüksüz olarak uygun kontroller tedavi edilmezse yüklü ve yüksüz muamele edilen hücreler içermelidir. Fenol kırmızısı olmadan orta kullanılması (yani carbox floresan boya ile girişim azaltacaktırYH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Bu deneyler başlamadan önce, bu protokole uyum için ilaç / tedavi ve tedavi edilmezse hücreler doğal floresans kontrol etmek önemlidir. Floresan boya ile hücrelerin yükleme öncesinde veya hücrelere uygulanacak süresi (dakika / saat karşı birkaç gün) ve tedavi (ilaç, iskemi / reperfüzyon, mekanik stres) türüne bağlı olarak tedavi edildikten sonra yapılmalıdır. Boya konsantrasyonu ROS hücre tipi ve hücrelerin aktivasyon durumuna bağlı olarak değişebilir algılamak için gereklidir. Bizim tavsiyemiz, boya 10μM ve 100μM konsantrasyonları ile başlamak, boyama toksisitesi ve etkinliği kontrol edin ve sonra deneyler için kullanılacak en iyi dozu belirlemek için konsantrasyonunu azaltmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz, bu yayın için Promega destek aldı.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (CA142664) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
