Summary
Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden voor het testen en evalueren van de aanwezigheid van reactieve zuurstofradicalen in de cellen.
Abstract
Reactieve zuurstof soorten zijn een aantal moleculen die schade DNA en RNA en oxideren eiwitten en lipiden (lipiden peroxydation). Deze reactieve moleculen bevatten een zuurstof-en onder meer H 2 O 2 (waterstofperoxide), NO (stikstofoxide), O 2 - (oxide anion), peroxynitriet (Onoo -), hydrochlorous zuur (HOCl) en hydroxyl radicaal (OH -) .
Oxidatieve soorten worden geproduceerd niet alleen onder pathologische omstandigheden (kanker, ischemische / reperfusie, neurologische en cardiovasculaire aandoeningen, infectieziekten, ontstekingsziekten 1, 2 auto-immuunziekten, etc ...) maar ook tijdens fysiologische (niet-pathologische) situaties, zoals cellulaire stofwisseling 3 , 4. Inderdaad, ROS spelen een belangrijke rol in vele cellulaire signaalwegen (proliferatie, cel activatie 5, 6, 7 migratie etc..). ROS kan nadelig worden (het is dan bedoeld als"Oxidatieve en nitrosatieve stress"), wanneer deze wordt geproduceerd in grote hoeveelheden in de intracellulaire compartimenten en cellen in het algemeen reageren op de ROS door opregulerende anti-oxidanten, zoals superoxide dismutase (SOD) en catalase (CAT), glutathion peroxidase (GPX) en glutathion (GSH) dat beschermt hen door het omzetten van gevaarlijke vrije radicalen tot onschadelijke verbindingen (dat wil zeggen water). Vitamine C en E zijn ook beschreven als ROS (anti-oxidanten).
Vrije radicalen zijn gunstig in lage hoeveelheden 3. Macrofagen en neutrofielen-gemedieerde immuunrespons betrekking hebben op de productie en afgifte van NO, die virussen, ziekteverwekkers en tumorcellen proliferatie 8 remt. GEEN reageert ook met andere ROS en dus, heeft ook een rol als een detoxifier (ROS aaseter). Eindelijk geen handelingen op schepen om de bloedstroom die van belang is voor de aanpassing van de spier om langdurige oefening 9, 10 reguleren. Verschillende publicaties hebben ook aangetoond dat ROS betrokken zijn bij insuline sensitivity 11, 12.
Tal van methoden om de ROS productie te evalueren zijn beschikbaar. In dit artikel stellen we een aantal eenvoudige, snelle en betaalbare testen, deze testen zijn gevalideerd door de vele publicaties en worden routinematig gebruikt om de ROS of de gevolgen ervan op te sporen in zoogdiercellen. Hoewel sommige van deze testen te detecteren meerdere ROS, anderen te detecteren slechts een ROS.
Protocol
1. Detectie van ROS gebruik van carboxy-H 2 DCFDA
Carboxy-H 2 DCFDA is niet-fluorescerende, maar in de aanwezigheid van ROS, wanneer dit reagens is geoxideerd, wordt het groen fluorescerend.
- Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, bereiden een verse voorraad oplossing van carboxy-H 2 DCFDA in steriele dimethylsulfoxide (DMSO) of 100% ethanol. Vermijd meerdere dooi / vries-cycli van de kleurstof.
- Was de cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HBSS) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om sporen van de oorspronkelijke medium te verwijderen.
- Laad de cellen met de kleurstof (en de controle kleurstof, zie noot sectie). In deze test gebruikten we Jurkat, een menselijke leukemie cellijn. Gebruik carboxy-H 2 DCFDA bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM in de reguliere kweekmedium met verminderde serum (2%).
- Incubeer de culturen gedurende 30 minuten in het donker, in een conventionele incubator (37 ° C, 5% CO2). Gooi alle ongebruikte kleurstof oplossingen.
- Verwijder carboxy-H 2 DCFDA bevattend medium en was twee keer met HBSS of PBS. Vanaf deze stap voorwaarts, beschermen je cellen tegen licht.
- Voeg vers medium met uw geneesmiddel van keuze om de carboxy-H 2 DCFDA-geladen cellen en incubeer zoals gewenst. Voor dit voorbeeld gebruiken we H 2 O 2 (0.03%) gedurende 1 uur.
- Beoordeel ROS door onmiddellijk het analyseren van uw cellen door flowcytometrie met behulp van de FL1 kanaal (groene fluorescentie), of met behulp van fluorescentie plaat lezer, of met behulp van fluorescentie microscopie. De fluorescentie kan worden gedetecteerd door gebruik te maken excitatie en emissie golflengtes die geschikt zijn voor groene fluorescentie.
Let op: Controles dienen te bestaan carboxy-H 2 DCFDA-geladen onbehandelde cellen en ongekleurde onbehandelde cellen. Carboxy-H 2 DCFDA is bekend om peroxiden te sporen, maar kan ook worden geoxideerd door andere ROS. Dit reagens kan ook worden gewijzigd door andere middelen, oxidatie ongevoelig controle kleurstof, zoals 5 - (en-6)-carboxy-2 ', 7'-dichloorofluorescein diacetaat (carboxy-DCFDA) moet daarom worden opgenomen in de test.
2. Meten van stikstofmonoxide (NO) productie
U moet sulfanilamide en N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (NED) oplossingen, en nitriet standaard. Deze test heet de Griess test.
NED oplossing: Maak een 0,1% oplossing van N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride verdund in een steriele water.Sulfanilamide oplossing: Maak een 1% oplossing van sulfanilamide verdund in 5% fosforzuur. Nitriet Standaard: Verdun de 0,1 M standaard voorraad natriumnitriet op 100 urn in een steriele medium, een seriële verdunning doen in hetzelfde medium.
Opslag: Bewaren chemicaliën zoals aangegeven door de fabrikant bij kamertemperatuur. Na reconstitutie, zijn NED en sulfanilamide oplossingen opgeslagen onmiddellijk na het gebruik bij 4 ° C, in het donker, en voor een maximum van 3 maanden.
- Cultuur cellen in een 96 well plaat,gebruik triplo voor elke aandoening, en omvatten een goede controle op basis van uw experimenten.
- Behandel cellen om NO productie te induceren. In ons experiment gebruiken we lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) en recombinant IL-4 naar onze cellen te behandelen. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt RAW 264,7, een muis macrofaag cellijn (Mouse leukemische monocyte macrofaag cellijn).
- Op de dag van de test, brengen beide reagentia op kamertemperatuur.
- Spin je bord, verzamel celsupernatanten en overdracht 50μl aan een nieuwe plaat met 96 putjes. Bereid beperkende verdunning putten van uw standaard voorraad oplossing voor een standaard curve te maken.
- Voeg 50μl van sulfanilamide oplossing voor elk monster en controle goed en meng goed.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
- Voeg 50μl van N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride oplossing voor elk monster en controle goed en meng goed.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
- Meten absorbance onmiddellijk behulp van een plaat reader met filter van golflengtes tussen 520nm en 550nm.
Als u gebruik maken van verschillende bord / schaaltje maten, gebruik 1/1/1 volume voor elke oplossing en monster supernatant.
Een violette kleur verschijnt in het positieve putten. Resultaten verkregen met de standaard zal helpen u de stabiliteit van uw oplossingen.
3. Detectie van ROS actie: geoxideerde eiwitten
Een andere methode om de productie van ROS te identificeren is aan het eind resultaten zien er door het detecteren van de oxidatie van eiwitten. Inderdaad, ROS wijzigen glutathion, een antioxidant die wordt uitgedrukt in de meeste cellen en speelt een beschermende rol tegen ROS. Naar aanleiding van oxidatie door ROS, wijziging van het gereduceerd glutathion (GSH) resulteert in de sulfhydryl (thiol) groep van de cysteïne wordt gekoppeld aan een seconde glutathion via een disulfide brug. Dit leidt tot de vorming van een gedimeriseerde eiwit (geoxideerd eiwit GSSG). GSH kan worden hersteld via een wijziging van GSSG door het enzym glutathion reductase. De toename van de GSSG / GSH ratio weerspiegelt oxidatieve stress. De volgende test is gebaseerd op de detectie en kwantificering van deze geoxideerde eiwitten. Deze methode is niet selectief voor specifieke ROS, maar detecteert de effecten van NO, H 2 O 2, O 2 - en andere ROS. Hier meten we de totale hoeveelheid geoxideerd (GSSG) en gereduceerd (GSH) met behulp van glutathion bioluminescente signalen.
- Seed je cellen in een 96 well plaat (wit / transparant, platte bodem), zoals gewoonlijk. Voor ons experiment gebruikten we 1x10 4 cellen per putje voor aanhanger Raw 264,7 en A549 cellen en vering Jurkat cellen. Afhankelijk van de grootte van je cellen deze nummers kunnen worden aangepast. Wij raden u aan bord hechtende cellen de dag voor de test om hen in staat stellen te hechten aan de plaat. Genoeg putten moeten worden voorbereid om geoxideerd en gereduceerd eiwitdetectie alsook voor "medium only" enonbehandelde cellen als controle. Gebruik triplo voor alle omstandigheden.
- Behandel uw cellen met uw geneesmiddel voor de vereiste tijd. Hier hebben we Jurkat cellen en A549 cellen voor 1 uur behandeld met H 2 O 2 (bij 5 mm en 2,5 mm respectievelijk). Raw 264,7 cellen werden behandeld met 200ng/ml van LPS voor 16 uur Tijdens deze incubatietijd, breng al je reagentia op kamertemperatuur (RT). Maak alle reagentia niet meer dan 30 minuten voor het uitvoeren van de test. De tabel hieronder toont de volumes van de reagentia per goed. Als het mogelijk is, is het belangrijk om te verwijderen van de media die het reductiemiddel alvorens verder te gaan met de test.
| Hechtende cellen | Suspensie-cellen | |||
| Totaal Glu Lysis | Geoxideerd Glu Lysis | Totaal Glu Lysis | Geoxideerd Glu Lysis | |
| NEM, 25mm | geen | 0.5μl | geen | 0.5μl |
| Luciferine-NT | 1 pi | 1 pi | 1 pi | 1 pi |
| Passieve Lysis Buffer, 5x | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Gedistilleerd water | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Eindvolume per goed | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Verwijder medium van putten met hechtende cellen. Verwijder geen medium in putten met vering cellen.
- Voeg gereduceerd glutathion lysis reagens of geoxideerde glutathione lysis reagens om de corresponderende putten en schud gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg de Luciferine generatie reagens en incubate gedurende 30 minuten bij RT.
- Voeg de Luciferine detectie reagens en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Lees de lichtgevende signaal op de integratie tijd van 0,25 tot 1 seconde per putje behulp van een plaat lezer luminometer.
| Hechtende cellen | Suspensie-cellen | |
| Aantal cellen per goed | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Celsuspensie per goed + drugs | 100 ul, worden verwijderd voordat 3.4 | 25μl, om niet te worden verwijderd |
| Gereduceerd glutathion Lysis Reagens | 50 ul | 25μl |
| Geoxideerde glutathione Lysis Reagens | 50 ul | 25μl |
| Luciferine Generation Reagens | 50 ul | 50 ul |
| Luciferine Detectie Reagens | 100 pi | 100 pi |
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1 Detectie van ROS gebruik van carboxy-H2DCFDA kleurstof. Jurkat cellen (humane leukemie cellijn) behandeld met H 2 O 2 werden vergeleken met niet-behandelde cellen. ROS induceert de wijziging van carboxy-H 2 DCFDA dat licht groen zoals gedetecteerd door flowcytometrie, de tl-piek in H 2 O 2 behandelde cellen verschuiving ten opzichte van de pieken in de controlegroep (H 2 O 2 behandelde cellen gekleurd met oxidatie ongevoelige kleurstof en niet- -behandelde cellen gekleurd met carboxy-H 2 DCFDA). Resultaten bevestigen de aanwezigheid van de ROS in de behandelde cellen.
Figuur 2 Detectie of GEEN gebruik van Griess reagentia. RAW 264.7 cellen (muis macrofaag) werden behandeld met LPS en IL-4. Een significante toename in de NO productie werd waargenomen in behandelde cellen in vergelijking met onbehandelde cellen te controleren.
| Cellijnen | Niet-behandelde | Behandelde |
| Raw 264,7 | 13,0 | 8.3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
Tabel 1 Detectie van ROS gemedieerde oxidatie van eiwitten. RAW 264.7 cellen werden behandeld met LPS, Jurkat en A549 (menselijke long kanker) cellen werden behandeld met H 2 O 2. Resultaten worden uitgedrukt als de verhouding gereduceerd (GSH) / geoxideerd (GSSG) glutathion. Lagere ratio's van glutathion (GSH) / (GSSG) werden ontdekt in behandelde cellen in vergelijking metcontrole onbehandelde cellen, waaruit blijkt dat eiwitten werden meer geoxideerd in behandelde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende pathologische situaties, zoals inflammatoire ziekten, kanker, ischemie / reperfusie, en ook behandelingen zoals bestraling of chemotherapie (dat wil zeggen cisplatine) veroorzaken ROS overproductie. Zo, het opsporen en het meten van ROS niveaus is belangrijk in veel basic, pre-klinische en klinische studies. Echter, ROS hebben zeer korte halfwaardetijd en kan ingewikkeld op te sporen. Hier stellen we voor eenvoudige tests die routinematig worden gebruikt en algemeen aanvaard voor de detectie van de vrije radicalen productie in zoogdiercellen.
Detectie protocollen met behulp van kleurstoffen kan de onderzoeker verschillende overal verkrijgbaar methoden (zoals microscopie, flow cytometrie, plaat lezer etc ....) Gebruiken om de aanwezigheid van de ROS te beoordelen. Flowcytometrie en microscopie informatie te verstrekken over levensvatbaarheid van de cellen en het percentage van de null, lage en hoge ROS-producerende cellen. Microscopie biedt ook informatie over de effecten van ROS op cel morfologie en cel adhesie. Detectie met behulp van plaat readers laat vooral kwantitatieve informatie. GEEN detectie door Griess is kwantitatief, maar geeft geen enkele informatie over de vorm of hechting van de bestudeerde cellen. Geen detectie is relatief eenvoudig in de muis cellen. Echter, lagere hoeveelheden NO zijn te vinden in de menselijke monsters, is het daarom belangrijk om nog meer voorzichtig te zijn bij elke stap van de detectie-procedure en de controles op te nemen. Detectie van eiwit oxidatie onderzoekt het totale effect van alle ROS geproduceerd door de bestudeerde cellen, hier de intensiteit van het verkregen signaal vertegenwoordigt de hoeveelheid ROS geproduceerd. De detectie van H 2 O 2-effecten is lastiger omdat het zeer snel door catalase. De GSH-GSSG-Glo assay heeft de mogelijkheid om te detecteren GSSG direct, deze test het minimaliseren van de problemen van oxidatie, omdat het direct uitgevoerd op monsters met geen extractie, en met minder cellen. Om GSH / GSSG lezingen, HBSS oplossing of glutathion-vrije media (zoals DMEM) zou de voorkeur te verbeteren;het werken met serum vrije media zal een verdere verbetering van het lezen. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat een aantal factoren waaronder de aard van de cellen (weefsel type, normale versus pathologische weefsels), de confluentie van de monolaag celkweek, de activering en stress status, de leeftijd (aantal passages), evenals zoals de proliferatie snelheid van uw cellen zal een effect hebben op de productie van ROS.
De meeste reagentia gebruikt voor ROS detectie zijn gevoelig voor licht, zuurstof en temperatuur verandert, het is dan ook cruciaal dat de experimentator speciale zorg gebruikt voor opslag en gebruik van alle reagentia en monsters te testen, en snel uit te voeren het werk.
Elk experiment met behulp van kleurstoffen moet ook de juiste controles, zoals onbehandelde (geen drugs), gelost (geen kleurstof), geladen onbehandeld, en gelost behandelde cellen als controle voor de ROS productie / detectie. Met behulp van medium zonder fenol rood vermindert interferentie met fluorescente kleurstoffen (dat wil zeggen CarBoxyH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Voordat u begint met deze experimenten, is het belangrijk om de natuurlijke fluorescentie van uw geneesmiddel / behandeling en van uw onbehandelde cellen cheque aan te passen aan dit protocol. Het laden van uw cellen met de fluorescerende kleurstof moet worden gedaan vóór of na behandeling, afhankelijk van de duur (minuten / uren versus enkele dagen) en het type van de behandeling (drugs, ischemie / reperfusie, mechanische stress) die zullen worden toegepast op de cellen. De concentratie van de kleurstof nodig is om te detecteren ROS kan variëren, afhankelijk van het celtype en van de activatie status van de cellen. Ons advies is om te beginnen met kleurstof concentraties van 10μM en 100 urn, controleer op toxiciteit en effectiviteit van de kleuring, en dan verlagen de concentratie om de beste dosis om te gebruiken voor uw experimenten vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We kregen de steun van Promega voor deze publicatie.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
