Summary
هنا نقترح طرق بسيطة لاختبار وتقييم وجود أنواع الاكسجين التفاعلية في الخلايا.
Abstract
أنواع الاكسجين التفاعلية تشمل عددا من الجزيئات التي الحمض النووي الريبي والضرر وأكسدة البروتينات والدهون (peroxydation الدهن). هذه الجزيئات المتفاعلة تحتوي على الأوكسجين وتشمل H 2 O 2 (بيروكسيد الهيدروجين) ، لا (أكسيد النيتريك) ، O 2 -- (أنيون أكسيد) ، peroxynitrite (ONOO --) ، وحامض hydrochlorous (HOCL) والهيدروكسيل (OH --) .
ويتم إنتاج الأنواع المؤكسدة ليس فقط في ظل ظروف مرضية (السرطان ، وضخه الدماغية / ، الأمراض العصبية والقلب والأوعية الدموية ، والأمراض المعدية ، والأمراض الالتهابية 1 ، 2 أمراض المناعة الذاتية ، الخ...) ولكن أيضا في حالات فسيولوجية (غير مرضية) مثل الأيض الخلوي 3 (4). في الواقع ، ROS تلعب أدوارا مهمة في العديد من مسارات الإشارات الخلوية (الانتشار ، وتنشيط الخلايا 5 ، 6 ، 7 الهجرة وما إلى ذلك). ROS يمكن أن تكون ضارة (ويشار إلى أنه بعد ذلك"الاكسدة وnitrosative") عندما ينتج بكميات عالية في حجرات داخل الخلايا والخلايا تستجيب عموما ريوس upregulating بواسطة المواد المضادة للاكسدة مثل ديسموتاز الفائق (الاحمق) والكاتلاز (CAT) ، البيروكسيداز الجلوتاثيون (GPX) والجلوتاثيون (GSH) الذي يحمي لهم عن طريق تحويل الجذور الحرة إلى جزيئات غير ضارة خطرة (أي المياه). كما تم الفيتامينات C و E كما هو موضح الزبالين ريوس (مضادات الأكسدة).
الجذور الحرة هي مفيدة في كميات منخفضة 3. البلاعم والعدلات بوساطة الاستجابات المناعية تنطوي على إنتاج وإطلاق NO ، الذي يثبط الفيروسات والجراثيم وانتشار الورم 8. لا يتفاعل أيضا مع ريوس أخرى ، وبالتالي ، لديها أيضا دور باعتبارها detoxifier (ROS زبال). أخيرا لا يعمل على السفن لتنظيم تدفق الدم وهو أمر مهم للتكيف العضلات على ممارسة طويلة 9 و 10. وقد أظهرت عدة منشورات أيضا أن تشارك في ROS SENS الأنسولينitivity 11 و 12.
طرق عديدة لتقييم ريوس الإنتاج المتاحة. في هذه المقالة نقترح عدة فحوصات بسيطة وسريعة ، وبأسعار معقولة ، وقد تم التحقق من صحة هذه المقايسات والعديد من المنشورات التي تستخدم بشكل روتيني للكشف عن آثارها ريوس أو في خلايا الثدييات. في حين أن بعض هذه المقايسات كشف ريوس متعددة ، والبعض الآخر يكشف سوى ريوس واحد.
Protocol
1. الكشف عن استخدام كربوكسي ROS - H 2 DCFDA
كربوكسي - H 2 DCFDA غير قابل للالفلورسنت ولكن في وجود ريوس ، عندما يتأكسد هذا كاشف ، يصبح الفلورية الخضراء.
- مباشرة قبل استخدامها ، وإعداد محلول المخزون جديدة من DCFDA كربوكسي 2 - H في dimethylsulfoxide العقيمة (DMSO) أو الإيثانول بنسبة 100 ٪. تجنب متعددة الذوبان / تجميد دورات صبغ الخاص.
- غسل الخلايا مع HEPES مخزنة محلول ملحي (HBSS) أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة آثار المتوسطة الأصلي.
- تحميل الخلايا مع صبغة (وصبغ التحكم ، راجع القسم المذكرة). في هذا الاختبار استخدمنا Jurkat ، خلية سرطان الدم خط الإنسان. استخدام كربوكسي - H 2 DCFDA بتركيز نهائي 1μM في مستنبت منتظمة مع انخفاض المصل (2 ٪).
- احتضان الثقافات لمدة 30 دقيقة في الظلام ، في الحاضنة التقليدية (37 درجة مئوية ، CO2 5 ٪). رفض كل الحلول صبغة غير المستخدمة.
- إزالة كربوكسي2 - H DCFDA تحتوي على المديين المتوسط ويغسل مرتين مع HBSS أو برنامج تلفزيوني. من هذه الخطوة إلى الأمام ، وحماية خلايا الجسم من الضوء.
- إضافة المتوسطة الطازجة التي تحتوي على المخدرات التي تختارها إلى الخلايا كربوكسي DCFDA - H - 2 ، واحتضان تحميلها على النحو المرغوب فيه. في هذا المثال نستخدم H 2 O 2 (0.03 ٪) لمدة 1 ساعة.
- تقييم ريوس على الفور عن طريق تحليل الخلايا الخاص بك عن طريق التدفق الخلوي باستخدام قناة FL1 (مخضر) ، أو عن طريق لوحة مضان القارئ ، أو عن طريق الفحص المجهري مضان. ويمكن الكشف عن مضان باستخدام الإثارة وانبعاث موجات التي هي مناسبة لمضان أخضر.
ملاحظة : ينبغي أن تشمل الضوابط كربوكسي - H 2 DCFDA محملة الخلايا غير المعالجة وغير المعالجة الخلايا غير ملوثين. ومن المعروف كربوكسي - H 2 DCFDA للكشف عن البيروكسيدات ولكن يمكن أيضا أن تتأكسد بواسطة ROS الأخرى. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا كاشف عن طريق وسائل أخرى ، صبغ الأكسدة مراقبة حساسة مثل 5 -- (و- 6) ، كربوكسي - 2 ، 7' - dichlorولذلك ينبغي ofluorescein ثنائي الأسيتات (كربوكسي DCFDA) يتم تضمينها في الاختبار.
2. قياس الانتاج النيتريك (NO) أكسيد
ستحتاج السلفانيلاميد و N - 1 - napthylethylenediamine هيدروكلوريد حلول (NED) ، ومعيار النطرون. ويسمى هذا الاختبار والفحص Griess.
NED الحل : قم حلا 0.1 ٪ من N - 1 - napthylethylenediamine هيدروكلوريد المخفف في محلول معقم water.Sulfanilamide : جعل حل سلفانيلاميد 1 ٪ من حامض الفوسفوريك المخفف في 5 ٪. ستاندرد النتريت : خفف مستوى المخزون 0.1M نترات الصوديوم ل100μM في وسط معقم ، لا إلى إضعاف التسلسلي في المتوسط نفسه.
شروط التخزين : مخزن المواد الكيميائية وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة في درجة حرارة الغرفة. عندما أعيد تشكيلها ، يتم تخزين NED والحلول السلفانيلاميد فورا بعد الاستعمال في 4 درجات مئوية ، في الظلام ، ولمدة أقصاها 3 أشهر.
- خلايا الثقافة في لوحة 96 أيضا ،استخدام triplicates لكل شرط ، وتشمل الضوابط المناسبة وفقا لتجاربك.
- علاج الخلايا للحث على أي إنتاج. في تجربتنا نحن نستخدم lipopolysaccharide (LPS) (100 نانوغرام / مل) و IL - 4 المؤتلف لعلاج الخلايا. في هذا البروتوكول ، استخدمنا RAW 264.7 ، خلية بلعم خط الماوس (الفأرة leukaemic خلية الوحيدات البلاعم سطر).
- في اليوم للمقايسة ، وجلب كل من الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
- تدور صحنك ، وجمع ونقل الخلية supernatants 50μl إلى 96 لوحة جديدة أيضا. يعد الحد من الآبار تمييع الحل الأسهم القياسية لجعل منحنى القياسية.
- إضافة 50μl من الحل السلفانيلاميد لكل عينة ومراقبة جيدا ، وتخلط جيدا.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في الظلام.
- إضافة 50μl حل هيدروكلوريد N - 1 - napthylethylenediamine لكل عينة ومراقبة جيدا ، وتخلط جيدا.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في الظلام.
- قياس absorbaNCE فورا باستخدام قارئ اللوحة مع مرشح من بين موجات 520nm 550nm و.
إذا كنت تستخدم لوحة مختلفة / طبق الأحجام ، وحجم استخدام 1/1/1 لكل حل وطاف العينة.
واللون البنفسجي تظهر في الآبار الإيجابية. والنتائج التي تم الحصول عليها مع معيار الاختيار تساعدك على استقرار الحلول الخاصة بك.
3. الكشف عن إجراءات ريوس : البروتينات المؤكسدة
وهناك طريقة مختلفة لتحديد إنتاج ريوس هو ان ننظر الى النتائج النهائية عن طريق الكشف عن أكسدة البروتينات. في الواقع ، ROS تعديل الجلوتاثيون وهو مانع للتأكسد التي يعبر عنها في معظم الخلايا ويلعب دورا وقائيا ضد ريوس. التالية الأكسدة التي ريوس ، وتعديل نتائج مخفضة (GSH) الجلوتاثيون في المجموعة (ثيول) سلفهيدريل من السيستين كونها مرتبطة الجلوتاثيون الثانية عبر جسر ثاني كبريتيد. وهذا يؤدي إلى تشكيل البروتين dimerized (تتأكسد GSSG البروتين). يمكن استعادة GSH عبر تعديل GSSG من اختزال الجلوتاثيون الانزيم. الزيادة في نسبة GSSG / GSH يعكس الاكسدة. يستند مقايسة التالية على الكشف النوعي والكمي لهذه البروتينات المؤكسدة. هذا الأسلوب غير انتقائية لريوس محددة ولكن بدلا من كشف آثار NO ، H 2 O 2 ، O 2 -- وريوس أخرى. هنا علينا أن نقيس إجمالي المبلغ من الجلوتاثيون (GSH) المؤكسد (GSSG) وخفضت bioluminescent باستخدام الإشارات.
- بذور الخلايا الخاصة بك في لوحة 96 كذلك (أبيض / شفافة وقيعان مسطحة) على النحو المعتاد. لتجربتنا ، كنا 1x10 4 خلايا في الخلايا بشكل جيد لملتصقة 264.7 الخام وA549 والخلايا Jurkat التعليق. ويمكن تبعا لحجم الخلايا الخاصة بك أن تعدل هذه الأرقام. نوصي لوحة خلايا ملتصقة في اليوم السابق للاختبار للسماح لهم نعلق على طبق من ذهب. وينبغي أن تكون مستعدة بما يكفي للكشف عن البروتين الآبار وانخفاض أكسدة فضلا عن "فقط المتوسط" وعلاج الخلايا كما الضوابط. استخدام triplicates لجميع شروطه.
- علاج الخلايا الخاصة بك مع المخدرات للحصول على الوقت المطلوب. نحن هنا يعامل الخلايا Jurkat A549 والخلايا ل1H مع H 2 O 2 (في 5mM و2.5mM على التوالي). وعولج الخام 264.7 خلايا مع 200ng/ml من 16 ساعة لLPS خلال هذه الفترة الحضانة ، وتحقيق كل ما تبذلونه من الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة (RT). جعل جميع الكواشف لا تزيد عن 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار. ويبين الجدول أدناه حجم الكواشف لكل بئر. عندما يكون ذلك ممكنا ، فمن المهم لإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الحد من وكيل قبل الشروع في الاختبار.
| ملتصقة الخلايا | تعليق الخلايا | |||
| مجموع تحلل حمض الغلوتاميك | أكسدة حمض الغلوتاميك تحلل | مجموع تحلل حمض الغلوتاميك | أكسدة حمض الغلوتاميك تحلل | |
| NEM ، 25mM | لا شيء | 0.5μl | لا شيء | 0.5μl |
| Luciferin - NT | 1 ميكروليتر | 1 ميكروليتر | 1 ميكروليتر | 1 ميكروليتر |
| الاحتياطي السلبي تحلل ، 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| الماء المقطر | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| حجم النهائي لكل بئر | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- إزالة المتوسطة من الآبار مع خلايا ملتصقة. لا تقم بإزالة المتوسطة في الآبار مع الخلايا التعليق.
- إضافة كاشف خفض تحلل الجلوتاثيون المؤكسد أو كاشف للتحلل الجلوتاثيون الآبار المقابلة ويهز لمدة 5 دقائق على RT.
- إضافة كاشف الجيل Luciferin وincubatه لمدة 30 دقيقة في RT.
- إضافة كاشف الكشف Luciferin واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- قراءة إشارة bioluminescent في وقت تكامل 0،25-1 الثانية في luminometer جيدا باستخدام قارئ اللوحة.
| ملتصقة الخلايا | تعليق الخلايا | |
| عدد الخلايا لكل بئر | 1x10 4 | 1x10 4 |
| تعليق في خلية المخدرات + جيد | 100 ميكرولتر ، من الضروري إزالتها قبل 3.4 | 25μl ، وليس المراد إزالتها |
| خفضت الكاشف اكسيداز تحلل | 50 ميكرولتر | 25μl |
| تتأكسد الكاشف تحلل اكسيداز | 50 ميكرولتر | 25μl |
| Luciferin انشاء الكاشف | 50 ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| Luciferin كشف الكاشف | 100 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
4. ممثل النتائج :
الشكل 1 الكشف عن ROS باستخدام كربوكسي H2DCFDA صباغة. وتمت مقارنة الخلايا Jurkat (خط الخلية البشرية اللوكيميا) تعامل مع H 2 O 2 إلى الخلايا غير المعالجة. ROS الحث على تعديل DCFDA كربوكسي 2 - H تتفلور الخضراء والكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي ، وهي ذروة الفلورية في H 2 O 2 مقارنة تحول الخلايا المعالجة إلى القمم في الضوابط (H 2 O 2 الخلايا المعالجة ملطخة صبغة الأكسدة وغير حساسة المعالجة الخلايا ملطخة DCFDA كربوكسي 2 - H). النتائج تؤكد وجود روس في الخلايا المعالجة.
الكشف عن الشكل 2 سو لا باستخدام الكواشف Griess. وعولج RAW 264.7 خلايا (الماوس بلعم) مع وايل LPS - 4. تم الكشف عن زيادة كبيرة في الانتاج في NO الخلايا المعالجة مقارنة للسيطرة على الخلايا غير المعالجة.
| خطوط خلية | غير المعالجة | المعالجة |
| الخام 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
تتوسط الجدول 1 الكشف عن ROS أكسدة البروتينات. وعولج RAW 264.7 خلايا مع LPS ، وJurkat A549 (البشرية سرطان الرئة) وعولج الخلايا مع H 2 O 2. يتم التعبير عن النتائج على النحو نسبة انخفاض (GSH) / المؤكسد (GSSG) الجلوتاثيون. تم الكشف عن نسب أقل من الجلوتاثيون (GSH) / (GSSG) في الخلايا المعالجة مقارنةمراقبة الخلايا غير المعالجة ، وكشف عن أن أكثر أكسدة البروتينات في الخلايا المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حالات مرضية عديدة مثل الأمراض الالتهابية والسرطانات ونقص التروية / ضخه ، وكذلك العلاجات مثل العلاج الكيميائي أو الإشعاع (أي سيسبلاتين) لحث ريوس فيض الإنتاج. وهكذا ، كشف وقياس مستويات ريوس المهم في كثير من الدراسات والأساسية ما قبل السريرية والسريرية. ومع ذلك ، ونصف سكان العالم يعيشون ريوس قصيرة جدا ، ويمكن أن تكون معقدة للكشف. هنا ، فإننا نقترح الاختبارات البسيطة التي يتم استخدامها بشكل روتيني وتحظى بقبول واسع للكشف عن إنتاج الجذور الحرة في خلايا الثدييات.
الكشف عن بروتوكولات تسمح باستخدام الأصباغ المجرب لاستخدام مختلف الأساليب المتاحة على نطاق واسع (مثل المجهر ، التدفق الخلوي ، لوحة... الخ القارئ) لتقييم وجود ريوس. التدفق الخلوي ، والفحص المجهري تقديم معلومات عن الجدوى الخلية وريوس في المئة من خلايا فارغة ، وانخفاض وارتفاع انتاج. المجهري يوفر أيضا معلومات عن آثار ريوس على مورفولوجيا الخلايا والتصاق الخلية. الكشف عن استخدام لوحة صeaders يسمح معلومات كمية في الغالب. NO الكشف عن طريق Griess كمي لكنه لا يقدم أية معلومات حول الشكل أو التصاق الخلايا التي تمت دراستها. NO كشف واضح ومباشر نسبيا في خلايا الفأر. ومع ذلك ، وانخفاض كميات ولا توجد في العينات البشرية ، ولذلك فمن المهم أن تكون أكثر حذرا في كل خطوة من إجراء الكشف وتشمل الضوابط. الكشف عن أكسدة البروتين يحقق الآثار الكاملة لجميع ريوس التي تنتجها الخلايا درس ، وهنا شدة الإشارة التي تم الحصول عليها يمثل مبلغ ريوس المنتجة. اكتشاف آثار من 2 H 2 O هو اصعب كما هو سريع للغاية القضاء عليه الكاتلاز. في مقايسة GSH - GSSG - GLO لديه القدرة على كشف GSSG مباشرة ، وهذا الاختبار تقليل من القضايا بسبب الأكسدة تتم مباشرة على عينات من دون الاستخراج ، وبعدد أقل من الخلايا. لتحسين قراءات GSH / GSSG ، أو حل HBSS الجلوتاثيون خالية من وسائل الإعلام (مثل DMEM) ينبغي تفضيل ؛وسوف تعمل مع وسائل الإعلام الحرة المصل زيادة تحسين القراءة. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن العديد من العوامل بما في ذلك طبيعة الخلايا (نوع الأنسجة ، والأنسجة الطبيعية مقابل مرضية) ، وconfluency من المونولاير خلية ثقافة ، ومركز التنشيط والإجهاد ، والعصر (عدد من الممرات) ، وكذلك كما أن معدل انتشار الخلايا الخاصة بك يكون لها تأثير على إنتاج ريوس.
معظم الكواشف المستخدمة للكشف عن ROS عرضة لتغيرات الضوء ، والأكسجين ، ودرجات الحرارة ، ولذلك فمن الأهمية بمكان أن يستخدم المجرب رعاية خاصة للتخزين واستخدام جميع الكواشف وعينات لفحصها ، وأداء العمل على وجه السرعة.
يجب على كل تجربة باستخدام الأصباغ وتشمل الضوابط المناسبة مثل المعالجة (لا للمخدرات) ، تفريغ (أي صبغة) ، وتحميلها دون علاج ، وتفريغ الخلايا المعالجة وضوابط لإنتاج ريوس / الكشف. وسوف تستخدم وسيط وبدون أحمر الفينول مع تقليل التدخل الأصباغ الفلورية (أي carboxYH 2 DCFDA ، CM - H 2 DCFDA). قبل البدء في هذه التجارب ، فمن المهم للتحقق من المخدرات الطبيعية مضان الخاص / المعالجة وغير المعالجة من خلايا الجسم على التكيف مع هذا البروتوكول. وينبغي أن يتم تحميل خلايا الجسم مع صبغة الفلورسنت قبل أو بعد العلاج تبعا لمدة (دقيقة / ساعة مقابل عدة أيام) ونوع من العلاج (المخدرات ، ونقص التروية / ضخه ، والإجهاد الميكانيكية) التي سيتم تطبيقها على الخلايا. تركيز الصبغة المطلوبة لكشف ريوس يمكن أن تختلف تبعا لنوع الخلايا وعن حالة تنشيط الخلايا. نصيحتنا هي أن تبدأ مع تركيزات صبغ 10μM و100μM ، تحقق للسمية وفعالية تلوين ، ومن ثم تقليل التركيز على تحديد أفضل جرعة لاستخدامها في التجارب الخاصة بك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تلقينا الدعم من Promega لهذا المنشور.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
