Summary
在这里，我们提出简单的方法来测试和评估细胞活性氧的存在。
Abstract
活性氧分子，破坏DNA和RNA和氧化的蛋白质和脂质（脂质peroxydation）。这些反应的分子中含有氧和包括H 2 O 2（双氧水），NO（一氧化氮），O 2 - （氧化物阴离子），过氧亚硝基阴离子（ONOO - ），hydrochlorous酸（次氯酸）和羟自由基（OH - ） 。
氧化品种生产不仅病理情况下（癌症，缺血/再灌注，神经系统及心血管病症，传染性疾病，炎症性疾病，自身免疫性疾病等... ...），而且在非生理（病理）的情况下， 如细 胞的新陈代谢3 4。事实上，活性氧在许多细胞信号通路中发挥重要作用（增殖，细胞活化5，6，7迁移等。） 。 ROS可以是有害的（然后被称为“氧化和nitrosative强调”）时，在细胞内的车厢和细胞产生高量一般回应ROS通过上调抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽（GSH），保护这些危险的自由基转换成无害的分子（即水）。维生素C和E也被形容为ROS的拾荒者（抗氧化剂）。
自由基是在3低量是有益的。巨噬细胞和中性粒细胞介导的免疫反应涉及NO的产生和释放，从而抑制病毒，病原体和肿瘤增殖8。 NO还与其他ROS反应，因此，也有作为解毒剂（活性氧清除剂）的作用。最后船只上的任何行为，调节血液流量，这是非常重要的肌肉适应长时间运动 9 ，10。一些出版物也表明，活性氧参与胰岛素SENSitivity 11，12。
许多方法来评价ROS产生。在这篇文章中，我们提出了几个简单，快速，经济实惠的的检测;这些实验已经验证了许多出版物，通常用来检测在哺乳动物细胞中ROS或其影响。虽然这些化验检测多种活性氧，其他检测只有一个单一的活性氧。
Protocol
1。 ROS的检测，使用羧基- H 2 DCFDA
羧基- H 2 DCFDA非荧光，但是，当这种试剂氧化的活性氧的存在，成为绿色荧光。
- 立即使用前，准备在无菌二甲基亚砜（DMSO）或100％的乙醇的新鲜原液的羧基- H 2 DCFDA 。避免你的染料多个解冻/冻结周期。
- 洗净细胞，与HEPES缓冲盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）删除原介质的痕迹。
- 负载与染料的细胞（和控制染料，比照注意部分）。在这个实验中，我们使用的Jurkat，人白血病细胞株。使用常规培养基中的终浓度为1μm降低血清（2％），羧基- H 2 DCFDA。
- 孵育30分钟，在黑暗中的文化，在传统的孵化器（37℃，5％CO2）。丢弃所有未使用的染料解决方案。
- 删除羧基- H 2 DCFDA介质中的HBSS或PBS洗两次。从这一步，由轻保护您的细胞。
- 加入新鲜的培养基中含有您的首选药物的羧基- H 2 DCFDA加载细胞和孵化需要。对于这个例子，我们用H 2 O 2（0.03％），1个小时。
- 评估立即流量使用FL1通道（绿色荧光），或荧光酶标仪或荧光显微镜流式细胞仪分析细胞的活性氧。可检测到使用适合绿色荧光的激发和发射波长的荧光。
注：控制应包括羧基- H 2 DCFDA载入未经处理的细胞和未染色未经处理的细胞。羧基- H 2 DCFDA是众所周知的检测过氧化物，但也可以通过其他活性氧氧化。此试剂也可以通过其他方式进行修改，不敏感控制氧化染料，如5 - （和- 6） - 羧基- 2'，7' -二氯ofluorescein双乙酸钠（羧基DCFDA），因此，应包含在测试。
2。一氧化氮（NO）生产的测量
您将需要磺胺和N - 1 - napthylethylenediamine盐酸盐（NED）解决方案，和亚硝酸盐标准。这个实验是所谓Griess检测。
NED的解决方案：请在无菌water.Sulfanilamide溶液稀释的N - 1 - napthylethylenediamine盐酸盐0.1％解决方案：1％溶液，稀释于5％磷酸的磺胺。亚硝酸盐标准：0.1M标准股票亚硝酸钠在无菌培养基稀释至100微米，在同一介质中做一个连续稀释。
储存条件：储存化学品在室温下制造商的指示。当重组，NED和磺胺解决方案存储立即使用后，在4 ° C，在黑暗中，最长不超过3个月。
- 在96孔板培养细胞，每个条件使用一式三份，并根据您的实验，包括适当的控制。
- 治疗细胞诱导NO的产生。在我们的实验中，我们用脂多糖（LPS）（100毫微克/毫升）和重组IL - 4，对待我们的细胞。在这个协议中，我们使用的RAW 264.7，小鼠巨噬细胞株（小鼠白血病单核细胞巨噬细胞系）。
- 在一天的检测，既带来试剂室温。
- 旋转你的盘子，收集细胞上清50μL转移到一个新的96孔板。准备限制您的标准储备液稀释井，使标准曲线。
- 加入50μL的磺胺解决方案以及每个样品和控制，并拌匀。
- 在室温孵育10分钟在黑暗中。
- 添加每个样品和控制以及N - 1个napthylethylenediamine盐酸盐溶液50μL，拌匀。
- 在室温孵育10分钟在黑暗中。
- 测量absorbaNCE立即用酶标仪波长520nm和550nm的过滤器之间的一个。
如果你使用不同的盘/碟大小，使用1/1/1每个解决方案的体积和样品上清。
紫罗兰的颜色会出现在正井。标准取得的成果将帮助您检查您的解决方案的稳定性。
3。检测ROS的行动：氧化蛋白质
ROS产生不同的方法来确定最终结果看，通过检测的蛋白质氧化。事实上，在大多数细胞中表达及抗氧化活性氧修改谷胱甘肽，对ROS的保护作用。以下氧化活性氧，谷胱甘肽（GSH）在其半胱氨酸的巯基（硫醇）通过二硫键连接到第二个谷胱甘肽组的结果修改。这会导致形成一个二聚体蛋白质（蛋白质氧化的GSSG）。 GSH可以通过修改酶谷胱甘肽还原酶的GSSG恢复。中的GSSG /谷胱甘肽比例的增加反映氧化应激。下面的实验是基于这些氧化蛋白的检测和定量。这种方法是没有选择性针对特定ROS的，而是检测NO的影响 ，H 2 O 2，O 2 -和其他活性氧。在这里，我们使用发光信号测量氧化（GSSG）和减少（GSH）的谷胱甘肽总量。
- 种子你的细胞在96孔板（白色/透明，平底）像往常一样。我们的实验中，我们用1 × 10，每孔壁RAW 264.7和A549细胞和悬浮Jurkat细胞的细胞。根据细胞的大小，可以调整这些数字。我们建议板块当天贴壁细胞在测试之前，让它们附加到该板块。足够的井应准备氧化和减少蛋白质检测，以及“中唯一的”未经处理的细胞作为对照。使用一式三份的所有条件。
- 与您所需要的时间药物治疗你的细胞。在这里，我们处理Jurkat细胞和A549细胞1h后， 与 H 2 O 2（分别为5mm和2.5mm的）。 RAW 264.7细胞经200ng/ml的LPS 16小时在此期间培养时间，带上所有的试剂室温（RT）。不超过30分钟，然后再执行测试的所有试剂。下表显示了每口井的试剂卷。在可能的情况下，重要的是要删除的媒体进行测试之前，含有还原剂。
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | |||
| 总谷氨酸裂解 | 氧化谷氨酸裂解 | 总谷氨酸裂解 | 氧化谷氨酸裂解 | |
| NEM，25MM | 没有 | 0.5μL | 没有 | 0.5μL |
| 荧光素- NT | 1μL | 1μL | 1μL | 1μL |
| 被动裂解缓冲液，5X | 加入10μl | 加入10μl | 加入10μl | 加入10μl |
| 蒸馏水 | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| 每口井的最终体积 | 50μL | 50μL | 25μl | 25μl |
- 从贴壁细胞的水井中删除的媒介。不要删除介质悬浮细胞的水井。
- 谷胱甘肽裂解试剂或氧化型谷胱甘肽裂解试剂添加到相应的井和动摇在室温下5分钟。
- 添加荧光素代试剂和incubatE为30分钟，在室温下。
- 加入荧光素检测试剂和孵育在室温下15分钟。
- 阅读整合时间0.25-1第二，每使用一盘读者光度计的发光信号。
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | |
| 每孔细胞数 | 1 × 10 4 | 1 × 10 4 |
| 每口井+药物的细胞悬液 | 100μL，3.4之前删除 | 25μl，不得被遣送 |
| 还原型谷胱甘肽裂解试剂 | 50μL | 25μl |
| 氧化型谷胱甘肽裂解试剂 | 50μL | 25μl |
| 荧光素代试剂 | 50μL | 50μL |
| 荧光素检测试剂 | 100μL | 100μL |
4。代表性的成果：
图1的活性氧，用羧基- H2DCFDA染料的检测。非治疗细胞与H 2 O 2处理的Jurkat细胞（人白血病细胞株）进行了比较。活性氧诱导的羧基- H 2 DCFDA修改，通过流式细胞仪，荧光峰在H 2 O 2处理的细胞转移相比，在控制峰（H 2 O 2处理细胞氧化不敏感的染料和非染色检测荧光绿色治疗羧基- H 2 DCFDA染色细胞）。结果证实处理的细胞中ROS的。
图2检测Øf不使用Griess试剂。与LPS和IL - 4处理的RAW 264.7细胞（小鼠巨噬细胞）。检测处理的细胞相比，控制未经处理的细胞中的NO产量显着增加。
| 细胞株 | 非治疗 | 治疗 |
| RAW 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| 的Jurkat | 5.2 | 2.8 |
表1检测的ROS介导的蛋白质氧化。 RAW 264.7细胞治疗与LPS，Jurkat细胞和A549（人肺癌）细胞经与H 2 O 2。结果表示比例减少（GSH）/氧化谷胱甘肽（GSSG）。谷胱甘肽（GSH）/（GSSG）的检出率分别为处理的细胞相比，控制未经处理的细胞，揭示蛋白质氧化处理的细胞。
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Discussion
一些病理情况，如炎症性疾病，癌症，缺血/再灌注，如放疗或化疗治疗（即顺铂）诱导ROS的生产过剩。因此，检测和测量ROS水平是很重要的，在很多的基础，临床前和临床研究。但是，活性氧有很短的半衰期，可能是复杂的检测。在这里，我们建议经常使用，并免费在哺乳动物细胞中的激进生产检测被广泛接受的简单测试。
使用染料的检测协议允许实验者使用各种广泛使用的方法（如显微镜，流式细胞仪，酶标仪等... ...），评估的活性氧的存在。流式细胞仪和显微镜提供细胞活力和空，低和高活性氧产生细胞的百分比的信息。显微镜还提供了ROS的细胞形态和细胞粘附影响的信息。检测板řeaders允许大多是定量信息。没有通过Griess检测是定量的，但不提供任何形状或研究细胞粘附的信息。没有检测是在老鼠细胞相对简单。然而，较低的数额没有在人类样本中发现，因此，重要的要更仔细的检测过程中的每一步，包括控制。蛋白质氧化的检测调查研究细胞产生活性氧的总影响，这里所获得的信号强度代表ROS的产生量。检测的H 2 O 2的效果是棘手的，因为它是非常由过氧化氢 酶迅速消除。 GSH - GSSG - GLO检测GSSG的直接探测能力，最大限度地减少这种检测氧化的问题，因为它是直接对样品进行提取没有，用较少的细胞。为了提高GSH / GSSG的读数，解决方案的HBSS或谷胱甘肽自由媒体（如DMEM培养液）应首选;与无血清媒体合作，将进一步提高阅读。重要的是要牢记几个因素，包括性质的细胞（组织类型，正常与病理组织），汇合的单层细胞培养，激活和应力状态，年龄（通道数），以及你的细胞增殖率将有一个ROS产生的影响。
用于活性氧检测试剂是易受光，氧和温度的变化，因此，至关重要的实验者使用，储存和使用所有试剂和样品进行测试，并迅速执行工作的特殊照顾。
每次实验使用的染料应包括适当的控制，如未经处理的（无药物），卸载（无染料），未经处理的加载和卸载处理的细胞ROS生产/检测控制。使用无酚红的培养基将减少干扰荧光染料（即羧酸YH 2 DCFDA，CM - H 2 DCFDA）。这些实验开始之前，重要的是要检查天然药/治疗和未经处理的细胞的荧光，以适应本议定书。载入你的细胞用荧光染料应做之前或之后，根据治疗持续时间（分钟/小时，与数天）和治疗（药物，缺血/再灌注，机械应力）将被应用到细胞。染料浓度检测ROS可根据不同的细胞类型和细胞的激活状态。我们的建议是开始与染料浓度10μM和100μm的，染色的毒性和疗效检查，然后降低浓度，以确定为您的实验中使用的最佳剂量。
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Disclosures
我们收到这本刊物的Promega公司的支持。
Acknowledgments
这项工作是支持由国立卫生研究院（CA142664）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
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