Summary
Her foreslår vi enkle metoder til at teste og evaluere tilstedeværelsen af reaktive ilt arter i celler.
Abstract
Reaktive ilt arter omfatter en række molekyler, der skader DNA og RNA og oxidere proteiner og lipider (lipid peroxydation). Disse reaktive molekyler indeholder en ilt og omfatter H 2 O 2 (brintoverilte), NO (kvælstofilte), O 2 - (oxid anion), peroxynitrit (ONOO -), hydrochlorous syre (HOCl), og hydroxyl radikal (OH -) .
Oxidativ arter er fremstillet, ikke kun under patologiske situationer (kræft, iskæmisk / reperfusion, nervesystem og hjerte-kar-sygdomme, smitsomme sygdomme, inflammatoriske sygdomme 1, autoimmune sygdomme 2, osv. ...), men også under fysiologiske (ikke-patologiske) situationer, såsom cellulær stofskifte 3 , 4. Faktisk ROS spiller en vigtig rolle i mange cellulære signalveje (spredning, celle aktivering 5, 6, migration 7 mm.). ROS kan være til skade (det er herefter omtalt som"Oxidativt og nitrosative stress"), når der produceres i store mængder i det intracellulære rum, og cellerne reagerer generelt på ROS ved upregulating antioxidanter såsom superoxid dismutase (SOD) og katalase (CAT), glutathion peroxidase (GPX) og glutathion (GSH), der beskytter dem ved at konvertere farlige frie radikaler til uskadelige molekyler (dvs. vand). Vitamin C og E er også blevet beskrevet som ROS skyllevæsker (antioxidanter).
Frie radikaler er gavnlige i små mængder 3. Makrofager og neutrofiler-medierede immunrespons vedrører produktion og frigivelse af NO, som hæmmer virus, patogener og tumor spredning 8. INGEN også reagerer med andre ROS og dermed også har en rolle som en detoxifier (ROS ådselæder). Endelig NO virker på skibe for at regulere blod-flow, som er vigtigt for tilpasning af musklen til at langvarig øvelse 9, 10. Adskillige publikationer har også vist, at ROS er involveret i insulin Sensitivity 11, 12.
Adskillige metoder til at vurdere ROS produktion er tilgængelige. I denne artikel vil vi foreslå flere enkel, hurtig og økonomisk overkommelig assays; disse analyser er blevet valideret af mange publikationer og rutinemæssigt anvendes til at påvise ROS eller dens virkninger i pattedyrs celler. Mens nogle af disse assays opdage flere ROS, andre registrerer kun en enkelt ROS.
Protocol
1. Påvisning af ROS hjælp carboxy-H 2 DCFDA
Carboxy-H 2 DCFDA er ikke-fluorescerende, men i overværelse af ROS, når reagenset er oxideret, bliver det grønt fluorescerende.
- Umiddelbart før brug, udarbejde en ny stamopløsning af carboxy-H 2 DCFDA i sterile dimethylsulfoxid (DMSO) eller 100% ethanol. Undgå flere tø / fryse cyklusser af din farve.
- Vask cellerne med HEPES bufferet saltopløsning (HBSS) eller fosfatbufferet saltvand (PBS) til at fjerne spor af det oprindelige medie.
- Læg celler med farvestof (og kontrol farvestof, jf. note afsnit). I denne analyse har vi brugt Jurkat, en human leukæmi cellelinje. Brug carboxy-H 2 DCFDA i en endelig koncentration af 1μM i regelmæssig dyrkningsmedium med nedsat serum (2%).
- Inkubér kulturer i 30 minutter i mørke, i en konventionel inkubator (37 ° C, 5% CO2). Kassér alle ubrugte farvestof løsninger.
- Fjern carboxy-H 2 DCFDA indeholder medium og vaskes to gange med HBSS eller PBS. Fra dette skridt fremad, beskytter dine celler mod lys.
- Tilføj frisk substrat, der indeholder dine foretrukne stof til carboxy-H 2 DCFDA belastede celler og inkuber som ønsket. I dette eksempel bruger vi H 2 O 2 (0,03%) i 1 time.
- Vurdere ROS ved straks at analysere dine celler ved flowcytometri vha. FL1 kanal (grøn fluorescens), eller ved fluorescens pladelæseren, eller ved fluorescens mikroskopi. Fluorescensen kan registreres ved hjælp af excitation og emission bølgelængder, der er passende for grøn fluorescens.
Bemærk: Kontrollen bør omfatte carboxy-H 2 DCFDA-lastet ubehandlede celler og uplettet ubehandlede celler. Carboxy-H 2 DCFDA er kendt for at opdage peroxider, men kan også være oxideret af andre ROS. Dette reagens kan også ændres på anden måde, oxidation ufølsom kontrol farvestof såsom 5 - (og-6)-carboxy-2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetat (carboxy-DCFDA) bør derfor indgå i testen.
2. Måling af nitrogenoxid (NO) produktionen
Du skal Sulfanilamide og N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (NED) løsninger, og nitrit standard. Denne analyse kaldes Griess analysen.
NED Løsning: Lav en 0,1% opløsning af N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid fortyndet i steril water.Sulfanilamide løsning: Lav en 1% opløsning af sulfanilamide fortyndet i 5% fosforsyre. Nitrit Standard: Fortynd den 0.1M standard lagervarer natriumnitrit til 100μM i sterilt medium, gør en seriel fortynding i det samme medie.
Opbevaringsbetingelser: Opbevares kemikalier, som anvist af producenten ved stuetemperatur. Efter rekonstitution er NED og Sulfanilamide løsninger lagres umiddelbart efter brug ved 4 ° C i mørke, og i højst 3 måneder.
- Kultur celler i en 96 brønds plade,bruge tre eksemplarer til hver tilstand, og omfatter passende kontrol i henhold til dine eksperimenter.
- Forkæl celler til at fremkalde ingen produktion. I vores eksperiment bruger vi lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) og rekombinant IL-4 til at behandle vores celler. I denne protokol, brugte vi RAW 264,7, en mus macrophage cellelinie (mus leukæmiske monocyt makrofage cellelinie).
- På dagen for analysen, bringe begge reagenser til stuetemperatur.
- Spin din tallerken, indsamle celle supernatanter og overføre 50μl til en ny 96 brønds plade. Forbered begrænse fortynding brønde din standard stamopløsning at lave en standardkurve.
- Tilføj 50μl af Sulfanilamide Solution til hver prøve og kontrol godt og bland godt.
- Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter i mørke.
- Tilføj 50μl af N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid løsning til hver prøve og kontrol godt og bland godt.
- Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter i mørke.
- Mål absorbance straks ved hjælp af en tallerken læser med filter af bølgelængder mellem 520nm og 550nm.
Hvis du benytter forskellige tallerken / fad størrelser brug 1/1/1 volumen for hver enkelt løsning og prøve supernatant.
En violet farve vil blive vist i den positive brønde. Resultater opnået med den standard, vil hjælpe dig med at kontrollere stabiliteten af dine løsninger.
3. Påvisning af ROS handling: oxiderede proteiner
En anden metode til at identificere produktionen af ROS er at se på de endelige resultater ved at opdage oxidation af proteiner. Faktisk ROS ændre glutathion, en antioxidant, der er udtrykt i de fleste celler og spiller en beskyttende rolle mod ROS. Efter iltning af ROS, ændring af den reducerede glutathion (GSH) resultater i sulfhydryl (thiol) gruppe af sine cystein er knyttet til en anden glutathion via en disulfid bro. Dette fører til dannelsen af en dimerized protein (oxideret protein GSSG). GSH kan gendannes via ændring af GSSG af enzymet glutathion reduktase. Stigningen i GSSG / GSH forhold afspejler oxidativt stress. Følgende analyse er baseret på påvisning og kvantificering af disse oxiderede proteiner. Denne metode er ikke selektiv for specifikke ROS, men snarere registrerer effekten af NO, H 2 O 2, O 2 - og andre ROS. Her har vi måle den samlede mængde oxideret (GSSG) og nedsat (GSH) glutathione hjælp bioluminiscerende signaler.
- Seed dine celler i en 96 brønds plade (hvid / transparent, flad bund) som sædvanlig. For vores eksperiment, brugte vi 1x10 4 celler per brønd for vedhængende Raw 264,7 og A549 celler og suspension Jurkat celler. Afhængig af størrelsen af dine celler disse numre kunne justeres. Vi anbefaler, at pladen vedhængende celler dagen før prøven at give dem mulighed for at vedhæfte på pladen. Nok brønde bør være forberedt på oxideret og reduceret protein detektion samt for "medium kun" ogubehandlede celler som kontrolgruppe. Brug tre eksemplarer til alle forhold.
- Forkæl dine celler med dit lægemiddel til den ønskede tid. Her har vi behandlet Jurkat celler og A549 celler til 1 time med H 2 O 2 (ved 5 mm og 2,5 mm henholdsvis). Rå 264,7 celler blev behandlet med 200ng/ml af LPS for 16 timer I løbet af denne inkubationstid, bringe alle dine reagenser til stuetemperatur (RT). Gør alle reagenser ikke mere end 30 minutter, før du udfører testen. Tabellen nedenfor viser de mængder af reagenser pr godt. Når det er muligt, er det vigtigt at fjerne de medier, der indeholder de reduktionsmiddel før man går videre med testen.
| Tilhænger celler | Suspension celler | |||
| Samlet Glu Lysis | Oxideret Glu Lysis | Samlet Glu Lysis | Oxideret Glu Lysis | |
| NEM, 25MM | none | 0.5μl | none | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| Passiv lysisbuffer, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Destilleret vand | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Afsluttende volumen pr godt | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Fjern medie fra boringer med vedhængende celler. Fjern ikke medium i brønde med suspension celler.
- Tilføj reduceret glutathion lyseringsreagens eller oxideret glutathion lyseringsreagens til det tilsvarende brønde og rystes i 5 minutter ved RT.
- Tilsæt Luciferin generation reagens og incubate i 30 minutter ved RT.
- Tilsæt Luciferin detektion reagens og inkuber i 15 minutter ved RT.
- Læs bioluminiscerende signalet på integration tidspunktet for 0,25-1 sekund pr brønd med en pladelæser luminometer.
| Tilhænger celler | Suspension celler | |
| Cell antal pr godt | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Cellesuspension per brønd + stof | 100 μl, skal fjernes, før 3,4 | 25μl, at der ikke kan fjernes |
| Reduceret Glutathion lyseringsreagens | 50 μl | 25μl |
| Oxideret Glutathion lyseringsreagens | 50 μl | 25μl |
| Luciferin Generation Reagens | 50 μl | 50 μl |
| Luciferin Detection Reagent | 100 μl | 100 μl |
4. Repræsentative resultater:
Figur 1 Påvisning af ROS hjælp carboxy-H2DCFDA farvestof. Jurkat celler (human leukæmi cellelinje) behandlet med H 2 O 2 blev sammenlignet med ikke-behandlede celler. ROS inducerer ændring af carboxy-H 2 DCFDA at fluorescerer grønt som påvises ved flowcytometri, de fluorescerende højdepunkt i H 2 O 2 behandlede celler skift i forhold til de toppe i kontrol (H 2 O 2 behandlede celler farvet med oxidation ufølsom farvestof og ikke -behandlede celler farvet med carboxy-H 2 DCFDA). Resultaterne bekræfter tilstedeværelsen af ROS i behandlede celler.
Figur 2 Detection of INGEN hjælp Griess reagenser. RAW 264,7 celler (mus makrofag) blev behandlet med LPS og IL-4. En væsentlig øget i NO produktionen blev fundet i de behandlede celler sammenlignet med kontrolgruppen ubehandlede celler.
| Cellelinjer | Ikke-behandlet | Behandlet |
| Rå 264,7 | 13,0 | 8,3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5,2 | 2,8 |
Tabel 1 Påvisning af ROS medieret oxidation af proteiner. RAW 264,7 celler blev behandlet med LPS, Jurkat og A549 (human lunge kræft) celler blev behandlet med H 2 O 2. Resultaterne udtrykkes som forholdet reducerede (GSH) / oxideret (GSSG) glutathion. Af lavere glutathion (GSH) / (GSSG) blev fundet i de behandlede celler i forhold tilkontrol ubehandlede celler, der afslører, at proteiner var mere oxideret i behandlede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere patologiske situationer som inflammatoriske sygdomme, kræft, iskæmi / reperfusion, og også behandlinger såsom strålebehandling eller kemoterapi (dvs. cisplatin) inducere ROS overproduktion. Således, detektering og måling af ROS niveauer er vigtig i mange basale, prækliniske og kliniske studier. Men ROS har meget korte halveringstider og kunne være kompliceret at opdage. Her foreslår vi, simple tests, som anvendes rutinemæssigt og bredt accepteret til påvisning af fri radikal produktion i mammale celler.
Detection protokoller ved hjælp af farvestoffer tillader forsøgslederen at bruge forskellige almindeligt tilgængelige metoder (så som mikroskopi, flowcytometri, pladelæser osv. ....) At vurdere tilstedeværelsen af ROS. Flowcytometri og mikroskopi give oplysninger om cellernes levedygtighed og procent af nul, lav og høj ROS producerende celler. Mikroskopi indeholder også oplysninger om virkningerne af ROS på celle morfologi og celleadhæsionsmolekyle. Detektion ved brug af plade readers tillader det meste kvantitative oplysninger. INGEN afsløring af Griess er kvantitativ, men ikke give nogen oplysninger om form eller vedhæftning af de undersøgte celler. INGEN afsløring er relativt ligetil i muse celler. Men lavere mængder af NO findes i humane prøver, er det derfor vigtigt at være endnu mere omhyggelig på hvert trin i påvisning procedure og til også at omfatte kontrol. Påvisning af protein oxidation undersøger de samlede virkninger af alle ROS produceres af de undersøgte celler, her intensiteten af de opnåede signal repræsenterer den mængde ROS produceres. Påvisning af H 2 O 2 effekter er mere tricky, da det er meget hurtigt fjernes ved katalase. Den GSH-GSSG-Glo assay har evnen til at opdage GSSG direkte, denne analyse minimere spørgsmål af oxidation, fordi det er udført direkte på prøver uden udsugning, og med færre celler. For at forbedre GSH / GSSG aflæsninger, HBSS løsning eller glutathion-frie medier (som f.eks DMEM) bør foretrækkes;arbejder med serum frie medier vil yderligere forbedre læsning. Det er vigtigt at huske på, at flere faktorer, herunder karakteren af de celler (vævstype, normal versus patologiske væv), den confluency af monolag cellekultur, aktivering og stress status, alder (antal passager), samt som spredning på dine celler vil have en effekt på produktionen af ROS.
De fleste reagenser, der anvendes til ROS detektion er modtagelige for lys, ilt og temperatur ændringer, og det er derfor afgørende, at forsøgslederen bruger særlig pleje for opbevaring og anvendelse af alle reagenser og prøver, der skal testes, og udføre arbejdet hurtigt.
Hvert eksperiment ved hjælp af farvestoffer bør omfatte en ordentlig kontrol, såsom ubehandlet (ingen medicin), losset (ingen farve), indlæst ubehandlet, og losset behandlet celler som kontroller til ROS produktion / detektion. Brug af medie uden phenolrødt vil reducere interferens med fluorescerende farvestoffer (dvs. carboxYH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Før du starter disse eksperimenter, er det vigtigt at kontrollere den naturlige fluorescens af din medicin / behandling og af din ubehandlede celler til at tilpasse sig denne protokol. Loading dine celler med fluorescerende farvestof bør ske før eller efter behandling afhængig af varighed (minutter / timer versus flere dage) og type af behandling (narkotika, iskæmi / reperfusion, mekanisk stress), der vil blive anvendt til cellerne. Den koncentration af farvestof er nødvendige for at detektere ROS kan variere afhængigt af celletype og på aktivering status af cellerne. Vores råd er at starte med farvestofbaseret koncentrationer af 10μM og 100μM, så tjek for toksicitet og effekt af farvning, og derefter reducere koncentrationen til at bestemme den bedste dosis til brug for dine eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har modtaget støtte fra Promega for denne publikation.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
