Summary
Ici, nous proposons des méthodes simples pour tester et évaluer la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans les cellules.
Abstract
Espèces réactives de l'oxygène comprennent un certain nombre de molécules qui endommagent l'ADN et d'ARN et d'oxyder les protéines et les lipides (peroxydation lipidique). Ces molécules réactives contiennent un atome d'oxygène et comprennent H 2 O 2 (peroxyde d'hydrogène), NO (oxyde nitrique), O 2 - (anion oxyde), le peroxynitrite (ONOO -), l'acide hydrochlorous (HOCl), et le radical hydroxyle (OH -) .
Espèces oxydantes sont produites non seulement dans des situations pathologiques (cancers, la reperfusion ischémique /, les pathologies neurologiques et cardiovasculaires, les maladies infectieuses, maladies inflammatoires 1, 2 maladies auto-immunes, etc ...) mais également lors de situations physiologiques (non pathologiques), tels que le métabolisme cellulaire 3 , 4. En effet, les ROS jouent un rôle important dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire (prolifération, l'activation des cellules 5, 6, 7 migrations etc.). ROS peut être nuisible (elle est alors appelée"Stress oxydatif et nitrosatif»), lorsqu'elle est produite en grande quantité dans les compartiments intracellulaires et les cellules répondent généralement à des ROS par upregulating antioxydants tels que la superoxyde dismutase (SOD) et catalase (CAT), glutathion peroxydase (GPx) et glutathion (GSH) qui protège entre eux en convertissant les dangereux radicaux libres des molécules inoffensives (l'eau). Les vitamines C et E ont également été décrits comme des charognards ROS (antioxydants).
Les radicaux libres sont bénéfiques en faible quantité 3. Macrophages et des neutrophiles réponses immunitaires à médiation impliquent la production et la libération de NO, ce qui inhibe les virus, les pathogènes et la prolifération tumorale 8. NO réagit également avec d'autres ROS et donc, a aussi un rôle comme un détoxifiant (scavenger ROS). Enfin NO agit sur les navires de réguler le flux sanguin qui est important pour l'adaptation du muscle à l'exercice prolongé 9, 10. Plusieurs publications ont également démontré que les ROS sont impliqués dans des Sénateurs d'insulineitivity 11, 12.
De nombreuses méthodes pour évaluer la production de ROS sont disponibles. Dans cet article, nous proposons plusieurs tests simples, rapides et abordables; ces tests ont été validés par de nombreuses publications et sont couramment utilisées pour détecter les ROS ou de ses effets dans les cellules de mammifères. Si certains de ces dosages permettent de déceler plusieurs ROS, d'autres ne détecter que d'un seul ROS.
Protocol
1. La détection des ROS en utilisant carboxy-H 2 DCFDA
Carboxy-H 2 DCFDA est non fluorescent, mais en présence des ROS, quand ce réactif est oxydé, il devient vert fluorescent.
- Immédiatement avant utilisation, préparer une solution de base fraîches de carboxy-H 2 DCFDA dans le diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) ou de l'éthanol à 100%. Évitez de multiples dégel / gel des cycles de votre teinture.
- Laver les cellules avec HEPES solution saline tamponnée (HBSS) ou un tampon phosphate salin (PBS) pour enlever les traces du support original.
- Chargez les cellules avec le colorant (et le colorant de contrôle, l'article cf. note). Dans cet essai nous avons utilisé Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules. Utilisez carboxy-H 2 DCFDA à une concentration finale de 1 uM en milieu de culture régulier avec du sérum réduite (2%).
- Incuber les cultures pendant 30 minutes dans l'obscurité, dans un conventionnelles incubateur (37 ° C, 5% de CO2). Jeter toutes les solutions de colorant utilisé.
- Retirer carboxy-H 2 DCFDA contenant du milieu et laver deux fois avec HBSS ou PBS. A partir de ce pas en avant, protéger vos cellules de la lumière.
- Ajouter un milieu frais contenant votre médicament de choix pour les 2 carboxy-H-DCFDA chargés cellules et incuber comme désiré. Pour cet exemple nous utilisons H 2 O 2 (0,03%) pendant 1 heure.
- Évaluer les ROS en mettant immédiatement l'analyse de vos cellules par cytométrie en flux en utilisant le canal FL1 (fluorescence verte), ou par lecteur de plaque à fluorescence, ou par microscopie à fluorescence. La fluorescence peut être détectée en utilisant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission qui sont appropriés pour la fluorescence verte.
Note: Les contrôles doivent inclure carboxy-H 2 DCFDA-chargés des cellules non traitées et non colorées cellules non traitées. Carboxy-H 2 DCFDA est connu pour détecter les peroxydes, mais pourrait également être oxydé par d'autres ERO. Ce réactif peut également être modifié par d'autres moyens, colorant contrôler l'oxydation insensible comme le 5 - (et 6)-carboxy-2 ', 7'-dichlordiacétate ofluorescein (carboxy-DCFDA) devrait donc être inclus dans le test.
2. Mesure de l'oxyde (NO) de production d'azote
Vous aurez besoin de sulfanilamide et N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate (NED) des solutions, et la norme de nitrite. Ce dosage est appelé dosage de Griess.
Solution de NED: Faire une solution à 0,1% de N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate dilué dans une solution stérile de water.Sulfanilamide: Faire une solution à 1% de sulfanilamide dans l'acide phosphorique dilué à 5%. Standard de nitrite: Diluer le nitrite de sodium 0,1 M standard de stock à 100 microns en milieu stérile, faire une dilution en série dans le même milieu.
Conditions de stockage: Conservez les produits chimiques selon les directives du fabricant à la température ambiante. Une fois reconstituée, la NED et de solutions sulfanilamide sont stockées immédiatement après usage à 4 ° C, dans l'obscurité, et pour un maximum de 3 mois.
- Cellules en culture dans une plaque à 96 puits,l'utilisation triplicatas pour chaque condition, et incluent des contrôles appropriés en fonction de vos expériences.
- Traiter les cellules pour induire la production de NO. Dans notre expérience, nous utilisons un lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) et IL-4 recombinante pour le traitement de nos cellules. Dans ce protocole, nous avons utilisé RAW 264.7, une lignée de cellules macrophages de souris (souris leucémiques lignée monocytaire de cellules macrophages).
- Le jour du test, amener les deux réactifs à température ambiante.
- Spin votre assiette, la collecte et le transfert de surnageants de cellules 50 pl d'une nouvelle plaque de 96 puits. Préparer limitant la dilution des puits de votre solution standard en stock pour faire une courbe standard.
- Ajouter 50 pl de la solution de sulfanilamide à chaque échantillon et contrôle bien et bien mélanger.
- Incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans l'obscurité.
- Ajouter 50 pl de la solution de dichlorhydrate de N-1-napthylethylenediamine à chaque échantillon et contrôle bien et bien mélanger.
- Incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans l'obscurité.
- Mesure Absorbance immédiatement à l'aide d'un lecteur de plaque avec filtre de longueurs d'onde entre 520nm et 550nm.
Si vous utilisez différents plaque / plat tailles, utilisez 1/1/1 volume pour chaque solution et surnageant de l'échantillon.
Une couleur violette apparaîtra dans le puits positifs. Les résultats obtenus avec la norme vous aidera à vérifier la stabilité de vos solutions.
3. La détection des ROS action: protéines oxydées
Une méthode différente pour identifier la production de ROS est de regarder les résultats finaux en détectant l'oxydation des protéines. En effet, les ROS modifier le glutathion, un antioxydant qui est exprimé dans la plupart des cellules et joue un rôle protecteur contre les ROS. Suite à l'oxydation par les ROS, la modification de la glutathion réduit (GSH) des résultats dans le sulfhydryle (thiol) le groupe de sa cystéine étant liée à une seconde glutathion par un pont disulfure. Cela conduit à la formation d'une protéine dimérisée (GSSG protéine oxydée). GSH peut être restauré via une modification de GSSG par la réductase enzyme glutathion. La hausse du ratio de GSSG / GSH reflète le stress oxydatif. Le test suivant est basé sur la détection et la quantification de ces protéines oxydées. Cette méthode n'est pas sélective pour des ROS, mais détecte plutôt les effets du NO, H 2 O 2, O 2 - et d'autres ROS. Ici on mesure la quantité totale d'oxydé (GSSG) et réduit (GSH) glutathion en utilisant des signaux bioluminescents.
- Graine de vos cellules dans une plaque à 96 puits (blanc / transparent, fond plat) comme d'habitude. Pour notre expérience, nous avons utilisé 1x10 4 cellules par puits pour adhérente RAW 264.7 et A549 et les cellules Jurkat suspension. Selon la taille de vos cellules de ces chiffres pourraient être ajustés. Nous recommandons aux cellules de la plaque adhérente de la journée avant le test afin de leur permettre d'attacher à la plaque. Assez puits devraient être préparés pour la détection de la protéine oxydée et réduite ainsi que pour "seulement moyenne" etcellules non traitées comme témoins. Utilisez triplicatas pour toutes les conditions.
- Traitez vos cellules avec votre médicament pour le temps nécessaire. Ici, nous avons traité les cellules Jurkat et A549 pour 1h avec H 2 O 2 (à 5 mm et 2,5 mm respectivement). Des cellules RAW 264.7 ont été traités avec 200ng/ml de LPS pendant 16 h. Pendant ce temps d'incubation, apportez tous vos réactifs à température ambiante (RT). Faire tous les réactifs ne dépassant pas 30 minutes avant d'effectuer le test. Le tableau ci-dessous montre les volumes de réactifs par puits. Lorsque c'est possible, il est important de retirer le support contenant l'agent réducteur avant de procéder à l'essai.
| Les cellules adhérentes | Les cellules en suspension | |||
| Total des Lysis Glu | Oxydé Lysis Glu | Total des Lysis Glu | Oxydé Lysis Glu | |
| NEM, 25mm | aucune | 0.5μl | aucune | 0.5μl |
| Luciférine-NT | 1 pl | 1 pl | 1 pl | 1 pl |
| Lysis Buffer passif, 5X | 10 ul | 10 ul | 10 ul | 10 ul |
| L'eau distillée | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Le volume final par puits | 50 pl | 50 pl | 25 pi | 25 pi |
- Retirer moyenne des puits avec des cellules adhérentes. Ne retirez pas moyen dans les puits avec les cellules en suspension.
- Ajouter réduite réactif de lyse glutathion oxydé ou réactif de lyse glutathion dans les puits correspondants et agiter pendant 5 minutes à température ambiante.
- Ajouter le réactif luciférine et la génération Incubate pendant 30 minutes à température ambiante.
- Ajouter le réactif de détection luciférine et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
- Lire le signal de bioluminescence au temps d'intégration de 0.25 à 1 seconde par puits en utilisant un luminomètre lecteur de plaque.
| Les cellules adhérentes | Les cellules en suspension | |
| Le nombre de cellules par puits | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Suspension cellulaire par puits + médicament | 100 pi, à être enlevés avant 3.4 | 25 pi, de ne pas être retirée |
| Réduction Réactif de lyse glutathion | 50 ul | 25 pi |
| Oxydé Réactif de lyse glutathion | 50 ul | 25 pi |
| Réactif Génération Luciférine | 50 ul | 50 ul |
| Réactif de détection Luciférine | 100 ul | 100 ul |
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1: Détection de ROS en utilisant carboxy-H2DCFDA colorant. Cellules Jurkat (lignée cellulaire humaine de leucémie) et traités par H 2 O 2 ont été comparés à cellules non traitées. ROS induit la modification de la carboxy-H 2 DCFDA qui émet une fluorescence verte détectée par cytométrie en flux, le pic de fluorescence dans H 2 O 2 cellules traitées décalage par rapport aux sommets de commandes (H 2 O 2 cellules traitées tachée de colorant d'oxydation insensible et non cellules traitées colorés avec carboxy-H 2 DCFDA). Les résultats confirment la présence de ROS dans les cellules traitées.
Figure 2 Détection of NON à l'aide des réactifs de Griess. Des cellules RAW 264.7 (macrophages de souris) ont été traitées avec du LPS et l'IL-4. Une augmentation significative de la production de NO a été détectée dans les cellules traitées par rapport au contrôle des cellules non traitées.
| Les lignées cellulaires | Non-traité | Traités |
| Raw 264,7 | 13,0 | 8.3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
Tableau 1: Détection de ROS médiée oxydation des protéines. Des cellules RAW 264.7 ont été traitées avec du LPS, Jurkat et A549 (cancer du poumon humain) ont été traités avec des cellules H 2 O 2. Les résultats sont exprimés comme le ratio réduit (GSH) / oxydé (GSSG) du glutathion. Baisse des ratios des glutathion (GSH) / (GSSG) ont été détectés dans les cellules traitées par rapport àle contrôle des cellules non traitées, révélant que les protéines étaient plus oxydé dans les cellules traitées.
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Discussion
Plusieurs situations pathologiques telles que les maladies inflammatoires, les cancers, l'ischémie / reperfusion, et aussi des traitements tels que radiothérapie ou la chimiothérapie (cisplatine par exemple) induisent une surproduction de ROS. Ainsi, en détectant et en mesurant les niveaux de ROS est important dans de nombreux fondamentale, les études pré-cliniques et cliniques. Toutefois, les ROS sont des demi-vies très courtes et pourrait être compliqué à détecter. Ici, nous proposons des tests simples qui sont utilisés couramment et largement accepté pour la détection de la production de radicaux libres dans les cellules de mammifères.
Protocoles de détection utilisant des colorants permettent à l'expérimentateur d'utiliser diverses méthodes largement disponibles (telles que la microscopie, cytométrie en flux, lecteur de plaque, etc ....) Pour évaluer la présence de ROS. La cytométrie en flux et microscopie fournir des informations sur la viabilité des cellules et le ROS pour cent des cellules nul, faible, et de haute production. Microscopie fournit également des informations sur les effets des ROS sur la morphologie des cellules et l'adhésion cellulaire. Détection utilisant la plaque res lecteurs permet aux informations surtout quantitatives. Pas de détection par Griess est quantitative, mais ne fournit aucune information sur la forme ou l'adhésion des cellules étudiées. Pas de détection est relativement simple dans les cellules de souris. Cependant, des quantités plus faibles de NO sont trouvés dans des échantillons humains, il est donc important d'être encore plus attentif à chaque étape de la procédure de détection et d'inclure des contrôles. La détection de l'oxydation des protéines étudie les effets totale de tous les ROS produites par les cellules étudiées, ici l'intensité du signal obtenu représente la quantité de ROS produites. La détection de H 2 O 2 effets est plus délicat car il est très rapidement éliminé par la catalase. Le dosage de la GSH-GSSG-Glo a la capacité de détecter GSSG directement, ce test de minimiser les problèmes d'oxydation, car elle est réalisée directement sur les échantillons sans extraction, et avec moins de cellules. Pour améliorer la lecture du GSH / GSSG, solution HBSS ou le glutathion-médias libres (tels que DMEM) doit être préférée;travailler avec les médias libres sériques permettra d'améliorer encore la lecture. Il est important de garder à l'esprit que plusieurs facteurs y compris la nature des cellules (type de tissu, les tissus normaux par rapport pathologique), la confluence de la culture cellulaire monocouche, l'état d'activation et le stress, l'âge (nombre de passages), ainsi que le taux de prolifération des cellules de votre aura un effet sur la production de ROS.
La plupart des réactifs utilisés pour la détection des ROS sont sensibles aux variations de lumière, l'oxygène et la température, il est donc crucial que l'expérimentateur utilise un soin particulier pour le stockage et l'utilisation de tous les réactifs et les échantillons à tester, et effectuer les travaux rapidement.
Chaque expérience utilisant des colorants devraient inclure des contrôles appropriés tels que non traitée (sans drogue), déchargé (sans colorant), chargé non traitée, et le déchargement des cellules traitées comme des commandes pour la production de ROS / détection. L'utilisation moyenne sans rouge de phénol permettra de réduire les interférences avec des colorants fluorescents (c.-carboxylateyH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Avant de commencer ces expériences, il est important de vérifier la fluorescence naturelle de votre médicament / traitement et de vos cellules non traitées à s'adapter à ce protocole. Chargement de vos cellules avec le colorant fluorescent devrait être fait avant ou après les traitements en fonction de la durée (en minutes / heures contre plusieurs jours) et le type de traitement (médicaments, l'ischémie / reperfusion, le stress mécanique) qui sera appliqué pour les cellules. La concentration de colorant nécessaire pour détecter les ROS peuvent varier selon le type cellulaire et sur l'état d'activation des cellules. Notre conseil est de commencer avec des concentrations de teinture de 10 uM et 100 microns, vérifier la toxicité et l'efficacité de la coloration, puis réduire la concentration de déterminer la meilleure dose à utiliser pour vos expériences.
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Disclosures
Nous avons reçu le soutien de Promega pour cette publication.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de Santé (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
