Summary
כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.
Abstract
מינים החמצן מגיב לכלול מספר מולקולות DNA ו-RNA נזק ו לחמצן חלבונים ושומנים (peroxydation שומנים בדם). אלה מכילים מולקולות חמצן כוללים H 2 O 2 (מי חמצן), NO (תחמוצת החנקן), O 2 - (אניון תחמוצת), peroxynitrite (ONOO -), חומצה hydrochlorous (HOCl), ו רדיקלי הידרוקסיל (OH -) .
מינים חמצוני מיוצרים לא רק תחת מצבים פתולוגיים (סרטן, reperfusion איסכמי /, מחלות נוירולוגיות לב וכלי דם, מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות 1, מחלות אוטואימוניות 2, וכו ...) אלא גם במצבים פיזיולוגיים (לא פתולוגי) כגון חילוף החומרים התאי 3 , 4. ואכן, ROS ממלאים תפקידים חשובים רבים מסלולי איתות תאיים (התפשטות, הפעלת תא 5, 6, 7 הגירה וכו '.). ROS יכול להיות מזיק (זה נקרא אז בשם"סטרס חמצוני nitrosative") כאשר מיוצר בכמויות גבוהות של תאים תאים תאיים בדרך כלל להגיב על ידי ROS upregulating נוגדי חמצון כגון superoxide dismutase (SOD) ו Catalase (CAT), peroxidase גלוטתיון (GPX) ו גלוטתיון (GSH) המגן אותם רדיקלים חופשיים על ידי המרת מסוכן מולקולות מזיקות (כלומר מים). ויטמינים C ו-E יש גם כמתואר נבלות ROS (נוגדי חמצון).
רדיקלים חופשיים הם מועילים סכומים נמוכים 3. Macrophage ו נויטרופילים בתיווך תגובות חיסוניות לערב את ייצור שחרור NO, אשר מעכב וירוסים, פתוגנים התפשטות הגידול 8. NO גם מגיב עם ROS אחרים ולכן, יש גם תפקיד כמו detoxifier (נבלות ROS). לבסוף NO פועלת על כלי לווסת את זרימת הדם שהינה חשובה ההסתגלות של השריר לממש ממושכת 9, 10. פרסומים אחדים הראו גם כי ROS מעורבים Sens אינסוליןitivity 11, 12.
שיטות רבות להעריך ייצור ROS זמינים. במאמר זה אנו מציעים מבחני פשוט, מהיר, וזול מספר: מבחני הללו אומתו על ידי פרסומים רבים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות ROS או השפעותיו בתאי יונקים. בעוד שחלק מבחני אלה לזהות ROS מרובים, אחרים לזהות רק ROS יחיד.
Protocol
1. איתור של ROS באמצעות carboxy-H 2 DCFDA
Carboxy-H 2 DCFDA הוא לא פלורסנט אלא בנוכחותו של ROS, כאשר זה מגיב מתחמצן, הוא הופך להיות פלואורסצנטי ירוק.
- מיד לפני השימוש, פתרון להכין מלאי חדש של carboxy-H 2 DCFDA ב dimethylsulfoxide סטרילי (DMSO) או 100% אתנול. הימנע מרובים ההפשרה / ההקפאה מחזורים של צבע שלך.
- שוטפים את התאים עם HEPES שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר עקבות של המדיום המקורי.
- טען תאים עם צבען (ואת צבע שליטה, סעיף ראו הערה). ב assay זה השתמשנו Jurkat, קו אנושי תא לוקמיה. השתמש carboxy-H 2 DCFDA בריכוז הסופי של 1μM במדיום תרבות קבוע עם סרום מופחת (2%).
- דגירה התרבויות במשך 30 דקות בחושך, בתוך חממה קונבנציונלי (37 ° C, CO2 5%). מחק את כל פתרונות לצבוע בשימוש.
- הסר carboxy-H 2 DCFDA המכיל בינוני לשטוף פעמיים עם HBSS או PBS. מתוך שלב זה קדימה, להגן על התאים שלך מפני האור.
- הוסף בינוני טרי המכיל תרופה לפי בחירתך את carboxy-H 2 DCFDA טעון תאים דגירה כרצונכם. בדוגמה זו אנו משתמשים H 2 O 2 (0.03%) במשך שעה 1.
- הערכת ROS על ידי מיד לניתוח התאים על ידי זרימה cytometry באמצעות הערוץ FL1 (פלואורסצנטי ירוק), או על ידי קורא צלחת פלואורסצנטי, או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הקרינה ניתן לאתר באמצעות עירור ופליטה אורכי הגל המתאימים פלואורסצנטי ירוק.
הערה: בקרת צריכה לכלול carboxy-H 2 DCFDA טעון בתאים שלא טופלו ותאי מטופל בלא כתם. Carboxy-H 2 DCFDA ידוע לזהות peroxides אבל יכול להיות גם על ידי ROS חמצון אחרים. מגיב זה יכול גם להיות שונה באמצעים אחרים, לצבוע רגישות חמצון בקרה כגון 5 - (ו -6), carboxy-2 ", 7'-dichlordiacetate ofluorescein (carboxy-DCFDA) ולכן צריך להיכלל במבחן.
2. מדידה של ייצור תחמוצת החנקן (NO)
יהיה עליך Sulfanilamide ו-N-1-napthylethylenediamine (NED) פתרונות dihydrochloride, ורמת ניטריט. Assay זה נקרא assay Griess.
פתרון NED: הכן פתרון 0.1% dihydrochloride N-1-napthylethylenediamine מדולל פתרון water.Sulfanilamide סטרילי: הכן פתרון 1% sulfanilamide בדילול מלא חומצה זרחנית 5%. תקן ניטריט: לדלל את רמת הנתרן 0.1M הניטריט המניות 100μM במדיום סטרילי, לעשות דילול סדרתי במדיום זהה.
תנאי אחסון: כימיקלים חנות לפי הוראות היצרן בטמפרטורת החדר. כאשר מחדש, נד ופתרונות Sulfanilamide מאוחסנים מיד לאחר השימוש ב 4 ° C, בחושך, וגם לתקופה מקסימלית של 3 חודשים.
- התרבות תאים בצלחת 96 באר,השימוש triplicates עבור כל תנאי, והם כוללים בקרות נאותה על פי הניסויים שלך.
- פנקו את התאים כדי לגרום NO הייצור. בניסוי שלנו אנו משתמשים lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) ו-IL-4 רקומביננטי לטיפול בתאים שלנו. בפרוטוקול זה, השתמשנו RAW 264.7, macrophage עכבר קו תאים (leukaemic עכבר קו מונוציטים macrophage התא).
- ביום של assay, להביא את שני ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
- ספין הצלחת שלך, לאסוף supernatants תא ולהעביר 50μl לצלחת 96 חדש גם כן. הכן הגבלת בארות דילול של מניות פתרון סטנדרטי שלך לעשות עקומת סטנדרטי.
- הוסף 50μl הפתרון Sulfanilamide לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
- הוסף 50μl של פתרון N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
- מדוד absorbance מיד באמצעות קורא צלחת עם מסנן של אורכי גל שבין 520nm ו 550nm.
אם אתם משתמשים שונים צלחת / תבשיל גדלים, להשתמש 1/1/1 נפח לפתרון כל supernatant המדגם.
צבע סגול יופיעו בארות חיובית. התוצאות שהושגו עם תקן יעזור לך לבדוק את היציבות של פתרונות שלך.
3. איתור של ROS פעולה: חלבונים חמצון
שיטה אחרת כדי לזהות את הייצור של ROS הוא להסתכל על התוצאות הסופיות על ידי גילוי חמצון של חלבונים. ואכן, ROS לשנות גלוטתיון, נוגד חמצון זה בא לידי ביטוי ברוב התאים יש תפקיד מגן מפני ROS. בעקבות חמצון על ידי ROS, שינוי של הקטינה גלוטתיון (GSH) תוצאות בקבוצה (תיאול) sulfhydryl של ציסטאין היותו קשור גלוטתיון שנייה באמצעות גשר דיסולפיד. הדבר מוביל להיווצרות חלבון dimerized (GSSG חלבון חמצון). GSH ניתן לשחזר באמצעות שינוי של GSSG ידי רדוקטאז גלוטאתיון. הגידול יחס GSSG / GSH משקף סטרס חמצוני. Assay הבא מבוסס על זיהוי וכימות של החלבונים האלה חמצון. שיטה זו אינה סלקטיבית עבור ROS ספציפי אלא מזהה את ההשפעות של NO, H 2 O 2, O 2 ו - ROS אחרים. כאן אנו למדוד את הכמות הכוללת של חמצון (GSSG) ו מופחת (GSH) גלוטתיון באמצעות אותות bioluminescent.
- זרעים התאים בצלחת 96 באר (לבן / שקוף, תחתית שטוחה) כרגיל. לצורך ניסוי זה, השתמשנו 1x10 4 תאים לכל היטב חסיד 264.7 ו A549 תאים גלם Jurkat תאים ההשעיה. בהתאם לגודל של התאים שלך מספרים אלה יכולים להיות מותאמים. אנו ממליצים לתאי צלחת חסיד יום לפני המבחן כדי לאפשר להם לצרף את הצלחת. מספיק בארות צריכים להיות מוכנים לגילוי חלבון חמצון מופחתת, כמו גם עבור "רק בינוני" ובתאים שלא טופלו כפי שולטת. השתמש triplicates כל התנאים.
- פנקו את התאים שלך עם התרופה שלך בפעם הנדרש. כאן התייחסנו תאים Jurkat ו A549 תאים 1h עם H 2 O 2 (ב 5mm ו 2.5mm בהתאמה). Raw 264.7 תאים שטופלו 200ng/ml של LPS עבור 16 ח במהלך תקופה זו הדגירה, להביא את כל ריאגנטים שלך לטמפרטורת החדר (RT). הפוך את כל ריאגנטים לא יותר מ 30 דקות לפני ביצוע הבדיקה. הטבלה שלהלן מציגה את הכרכים של ריאגנטים לכל טוב. במידת האפשר, חשוב להסיר את המדיה שמכילה את סוכן הפחתת לפני שתמשיך הבדיקה.
| חסיד תאים | השעיה תאים | |||
| תמוגה סך Glu | חמצון Glu תמוגה | תמוגה סך Glu | חמצון Glu תמוגה | |
| Nem, 25mm | אף אחד | 0.5μl | אף אחד | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 μl | 1 μl | 1 μl | 1 μl |
| מאגר תמוגה פסיבי, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| מים מזוקקים | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| נפח סופי לכל טוב | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- הסר בינוני מבארות עם תאים חסיד. אל תסיר בינוני בבארות עם תאים ההשעיה.
- הוסף מופחת מגיב תמוגה גלוטתיון מחומצן או תמוגה מגיב גלוטתיון את בארות המתאים וללחוץ במשך 5 דקות ב RT.
- הוסף מגיב הדור Luciferin ו incubatדואר במשך 30 דקות ב RT.
- הוסף מגיב איתור Luciferin ו דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- קרא את האות bioluminescent בזמן שילוב של שנייה 0.25-1 דולר היטב באמצעות luminometer הקורא צלחת.
| חסיד תאים | השעיה תאים | |
| מספר נייד לכל טוב | 1x10 4 | 1x10 4 |
| תא השעיה לכל תרופה + טוב | 100 μl, יש להסיר לפני 3.4 | 25μl, לא יוסר |
| מגיב גלוטתיון מופחתת תמוגה | 50 μl | 25μl |
| גלוטתיון מחומצן תמוגה מגיב | 50 μl | 25μl |
| Luciferin מגיב דור | 50 μl | 50 μl |
| Luciferin מגיב איתור | 100 μl | 100 μl |
4. נציג תוצאות:
איור 1 איתור של ROS באמצעות carboxy-H2DCFDA לצבוע. תאים Jurkat (קו אנושי תא לוקמיה) שטופלו עם H 2 O 2 הושוו לא טופלו התאים. ROS גורם שינוי של carboxy-H 2 DCFDA כי מאיר ירוק כפי שזוהו על ידי cytometry זרימה, השיא ניאון H 2 O 2 תאים שטופלו שינוי לעומת הפסגות שולטת (H 2 O 2 תאים שטופלו מוכתמים בצבע חמצון לא רגיש ולא שטופלו בתאים מוכתם carboxy-H 2 DCFDA). תוצאות לאשר את קיומו של ROS בתאים שטופלו.
איור 2 איתור oו NO באמצעות ריאגנטים Griess. RAW 264.7 תאים (עכבר macrophage) טופלו LPS ו - IL-4. עלייה משמעותית בייצור NO זוהה בתאים שטופלו לעומת שליטה בתאים שלא טופלו.
| שורות תאים | ללא טיפול | המטופלים |
| Raw 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
לוח 1: איתור של ROS בתיווך חמצון של חלבונים. RAW 264.7 תאים שטופלו LPS, Jurkat ו A549 (סרטן ריאה אנושית) תאים שטופלו H 2 O 2. תוצאות מבוטאות כיחס מופחת (GSH) / חמצון (GSSG) גלוטתיון. יחס נמוך של גלוטתיון (GSH) / (GSSG) התגלו תאים שטופלו לעומתשליטה בתאים שלא טופלו, חושף כי חלבונים היו מתחמצן יותר בתאים שטופלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במצבים פתולוגיים אחדים כגון מחלות, סרטן דלקתיות, איסכמיה / reperfusion, גם טיפולים כגון קרינה או כימותרפיה (ציספלטין למשל) לעורר ייצור יתר ROS. לפיכך, גילוי מדידת רמות ROS חשוב רבים, מחקרים בסיסיים טרום קליניים וקליניים. עם זאת, ROS יש מחצית חיים קצר מאוד יכול להיות מסובך לזהות. כאן, אנו מציעים בדיקות פשוטות המשמשות באופן שגרתי ומקובל לצורך זיהוי של ייצור רדיקלים חופשיים בתאי יונקים.
פרוטוקולי זיהוי באמצעות צבעים לאפשר הנסיין להשתמש בשיטות הנפוצה שונים (כגון מיקרוסקופיה, cytometry זרימה, וכו 'קורא צלחת ....) כדי להעריך את הנוכחות של ROS. Cytometry זרימה מיקרוסקופית לספק מידע על כדאיות התא ואת אחוז ריק, נמוך, גבוה לייצר תאים ROS. מיקרוסקופית גם מספקת מידע על ההשפעות של ROS על המורפולוגיה של תאים הידבקות התא. איתור באמצעות צלחת readers מאפשר מידע כמותי בעיקר. NO זיהוי על ידי Griess הוא כמותי, אך אינה מספקת מידע על הצורה או הדבקה של התאים למד. איתור NO היא פשוטה יחסית בתאי עכבר. עם זאת, כמויות נמוכות של NO נמצאות דגימות אדם, ולכן חשוב להיות זהירים עוד יותר בכל שלב של הליך איתור לכלול שולטת. איתור של חמצון חלבון חוקר את ההשפעות הכולל של כל ROS המיוצר על ידי תאים למד; כאן את עוצמת האות המתקבל מייצג את כמות ROS מיוצר. הגילוי של H 2 O 2 תופעות הוא מסובך כפי שהוא מסולק במהירות רבה על ידי Catalase. Assay GSH-GSSG זוהרים יש את היכולת לזהות GSSG ישירות, assay זה למזער את בעיות של חמצון, משום שהיא מבוצעת ישירות עם מיצוי שום על דגימות, עם פחות תאים. כדי לשפר את קריאות GSH / GSSG, פתרון HBSS או גלוטתיון ללא מדיה (כגון DMEM) צריך להיות מועדף;עבודה עם תקשורת חופשית בסרום יהיה לשפר את הקריאה. חשוב לזכור כי מספר גורמים, כולל אופי של התאים (סוג רקמות, רקמות נורמלי מול פתולוגי), את confluency של התרבות התא monolayer, את מצב ההפעלה ואת הלחץ, גיל (מספר קטעים), כמו גם כמו את קצב התרבות התאים שלך תהיה השפעה על ייצור של ROS.
רוב ריאגנטים משמש לגילוי ROS רגישים לשינויים אור, חמצן, טמפרטורה, הוא לכן חיוני כי הנסיין משתמשת טיפול מיוחד לצורך אחסון ושימוש של כל ריאגנטים דגימות להיבדק ולבצע את העבודה מהר.
כל הניסוי באמצעות צבעים לכלול בקרות נאותה כגון מטופלים (לא סמים) פרקו (ללא צבע), טעון טיפול, תאים שטופלו פרקו כפי שולטת עבור ROS ייצור / זיהוי. שימוש בינוני ללא פנול אדום תפחית התערבות עם צבעי ניאון (כלומר carboxי.ח. 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). לפני התחלת הניסויים האלה, חשוב לבדוק את הקרינה הטבעית של התרופה שלך / טיפול של תאים מטופל שלך להסתגל פרוטוקול זה. טוען התאים שלך עם צבע פלואורסצנטי צריך לעשות לפני או אחרי הטיפולים תלוי משך (דקות / שעות לעומת מספר ימים) וסוג הטיפול (תרופות, איסכמיה / reperfusion, לחץ מכני), אשר תחול על התאים. ריכוז של צבע נדרש לזהות ROS יכול להשתנות בהתאם לסוג התא על מצב ההפעלה של התאים. העצה שלנו היא להתחיל עם ריכוזים של צבען 10μM ו 100μM, לבדוק רעילות והיעילות של כתמים, ולאחר מכן להפחית את ריכוז כדי לקבוע את המינון הטוב ביותר לשימוש עבור הניסויים שלך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
קיבלנו את התמיכה של Promega לפרסום זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
