Summary
Aquí proponemos métodos sencillos para probar y evaluar la presencia de especies reactivas del oxígeno en las células.
Abstract
Las especies reactivas del oxígeno incluyen una serie de moléculas que dañan el ADN y ARN, y se oxidan las proteínas y los lípidos (peroxidación lipídica). Estas moléculas reactivas contienen un átomo de oxígeno y son H 2 O 2 (peróxido de hidrógeno), NO (óxido nítrico), O 2 - (anión), peroxinitrito (ONOO -), ácido hydrochlorous (HOCl), y el radical hidroxilo (OH -) .
Especies reactivas de oxígeno se producen no sólo en situaciones patológicas (cáncer, isquemia reperfusión /, patologías neurológicas y cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias 1, 2 enfermedades autoinmunes, etc ...), sino también en situaciones fisiológicas (no patológicas), tales como el metabolismo celular 3 , 4. De hecho, ROS juegan un papel importante en muchas vías de señalización celular (proliferación, activación de las células 5, 6, 7 migración, etc.). ROS puede ser perjudicial (entonces se conoce como"El estrés oxidativo y nitrosativo") cuando se produce en grandes cantidades en los compartimentos intracelulares y las células responden en general a ROS por upregulating antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión (GSH), que protege ellas mediante la conversión de los peligrosos radicales libres a las moléculas inofensivas (por ejemplo, agua). Las vitaminas C y E también se han descrito como basureros ROS (antioxidantes).
Los radicales libres son beneficiosos en pequeñas cantidades 3. Macrófagos y neutrófilos respuestas inmunes mediadas por involucrar a la producción y liberación de NO, que inhibe virus, patógenos y la proliferación del tumor 8. El NO también reacciona con otros ROS y por lo tanto, también tiene un papel como un desintoxicante (scavenger ROS). Por último, no actúa sobre los vasos para regular el flujo de sangre que es importante para la adaptación del músculo al ejercicio prolongado 9, 10. Varias publicaciones han demostrado también que las ROS participan en sens insulinapositividad 11, 12.
Numerosos métodos para evaluar la producción de ROS se encuentran disponibles. En este artículo nos proponemos varias pruebas sencillas, rápidas y asequibles, estos ensayos han sido validadas por numerosas publicaciones y se usan rutinariamente para detectar ROS o sus efectos en células de mamíferos. Aunque algunos de estos ensayos de detección de múltiples ROS, otros detectan un solo ROS.
Protocol
1. La detección de ROS con carboxi-H 2 DCFDA
Carboxi-H 2 DCFDA no es fluorescente, pero en presencia de ROS, cuando este reactivo se oxida, se convierte en verde fluorescente.
- Inmediatamente antes de su uso, preparar una solución de frescos de carboxi-H 2 DCFDA en dimetilsulfóxido estéril (DMSO) o el 100% de etanol. Evitar la repetición descongelar / congelar los ciclos de su tinte.
- Se lavan las células con solución salina tamponada con HEPES (HBSS) o tampón fosfato salino (PBS) para eliminar los restos del medio original.
- La carga de las células con el colorante (y el tinte de control, véase el punto la nota). En este ensayo hemos utilizado Jurkat, una línea celular de leucemia humana. Use carboxi-H 2 DCFDA a una concentración final de 1μM en medio de cultivo regular con suero reducido (2%).
- Incubar los cultivos durante 30 minutos en la oscuridad, en una incubadora convencional (37 ° C, 5% CO2). Descartar las soluciones colorantes utilizados.
- Quitar carboxi-H 2 DCFDA que contienen medio y lavar dos veces con HBSS o PBS. A partir de este paso adelante, a proteger las células de la luz.
- Añadir un nuevo soporte de la droga de elección para la carboxi-H 2 DCFDA células cargadas e incubar como se desee. Para este ejemplo vamos a usar H 2 O 2 (0,03%) durante 1 hora.
- ROS evaluar de inmediato el análisis de las células por citometría de flujo a través del canal FL1 (fluorescencia verde), o mediante un lector de placas de fluorescencia, o por microscopía de fluorescencia. La fluorescencia se puede detectar mediante el uso de longitudes de onda de excitación y emisión que son apropiados para la fluorescencia verde.
Nota: Los controles deberán incluir carboxi-H 2 DCFDA cargado las células no tratadas y teñidas las células no tratadas. Carboxi-H 2 DCFDA se conoce para detectar peróxidos, pero también podría ser oxidado por otros ROS. Este reactivo también puede ser modificado por otros medios, colorantes de oxidación de control insensible como el 5 - (y-6)-carboxi-2 ', 7'-diclorodiacetato ofluorescein (carboxi-DCFDA) por lo tanto, deben incluirse en la prueba.
2. La medición del óxido nítrico (NO)
Usted tendrá que sulfanilamida y N-1-napthylethylenediamine soluciones dihidrocloruro (NED), y el nivel de nitritos. Este ensayo se denomina ensayo de Griess.
Solución NED: Haga una solución al 0,1% de diclorhidrato de N-1-napthylethylenediamine diluida en solución estéril water.Sulfanilamide: Haga una solución al 1% de sulfanilamida diluido en ácido fosfórico al 5%. Estándar de nitrito: Diluir el 0,1 M de patrón de nitrito de sodio a 100μM en medio estéril, hacer una serie de dilución en el mismo medio.
Condiciones de almacenamiento: Almacene los productos químicos según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente. Una vez reconstituido, la NED y las soluciones de sulfanilamida se almacenan inmediatamente después de su uso a 4 ° C, en la oscuridad, y por un máximo de 3 meses.
- Las células de cultivo en una placa de 96 pocillos,uso por triplicado para cada condición, e incluyen controles adecuados de acuerdo con sus experimentos.
- Tratamiento de las células para inducir la producción de NO. En nuestro experimento utilizamos lipopolisacárido (LPS) (100 ng / ml) e IL-4 recombinante para el tratamiento de las células. En este protocolo, el RAW 264.7, una línea celular de macrófagos de ratón (mouse leucémicas línea celular de macrófagos monocitos).
- En el día de la determinación, tanto de los reactivos a temperatura ambiente.
- Girar el plato, recoger los sobrenadantes celulares y la transferencia de 50μl con una nueva placa de 96 pocillos. Prepare limitar los pozos de dilución de la solución madre de patrón para hacer una curva estándar.
- Añadir 50μl de la solución de sulfanilamida a cada muestra y control, así y mezclar bien.
- Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
- Añadir 50μl de solución de clorhidrato de N-1-napthylethylenediamine a cada muestra y control, así y mezclar bien.
- Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
- Medida Absorbana inmediatamente con un lector de placas con filtro de 520 nm de longitud de onda entre 550 nm y.
Si usted utiliza diferentes plato / plato de tamaño, el uso 1/1/1 volumen para cada solución y el sobrenadante de la muestra.
Un color violeta aparecerá en los pozos positivos. Los resultados obtenidos con el estándar le ayudará a comprobar la estabilidad de sus soluciones.
3. La detección de ROS acción: proteínas oxidadas
Un método diferente para identificar la producción de ROS es ver el resultado final mediante la detección de la oxidación de las proteínas. De hecho, ROS modificar el glutatión, un antioxidante que se expresa en la mayoría de las células y juega un papel protector contra las ROS. Después de la oxidación por ROS, la modificación del glutatión reducido (GSH) se traduce en la sulfhidrilo (tiol) del grupo de la cisteína estar vinculado a un glutatión segundo a través de un puente disulfuro. Esto lleva a la formación de una proteína dimerizados (GSSG oxidada proteína). GSH puede ser restaurada a través de la modificación de GSSG por la enzima glutatión reductasa. El aumento en el cociente GSSG / GSH refleja el estrés oxidativo. El siguiente ensayo se basa en la detección y cuantificación de estas proteínas oxidadas. Este método no es selectivo para ROS específicos, sino más bien detecta los efectos del NO, H 2 O 2, O 2 - y otros ROS. Aquí se mide la cantidad total de oxidado (GSSG) y reducido (GSH) glutatión con señales bioluminiscentes.
- Semillas de las células en una placa de 96 pocillos (blanco / transparente, fondo plano), como de costumbre. Para nuestro experimento, se utilizó 1x10 4 células por pocillo de adherentes y Raw 264.7 A549 y células Jurkat suspensión. Dependiendo del tamaño de sus células estos números podrían ser ajustados. Recomendamos a las células de la placa adherida al día antes de la prueba que les permita conectar a la placa. Suficientes pozos deben estar preparados para la detección de proteínas oxidadas y reducidas, así como de "único medio" ylas células no tratadas como controles. Use triplicado en todas las condiciones.
- Tratar las células con su medicamento durante el tiempo necesario. Aquí se tratan las células Jurkat y las células A549 durante 1 hora con H 2 O 2 (a 5 mm y 2,5 mm respectivamente). Raw 264,7 células fueron tratadas con 200ng/ml de LPS durante 16 h. Durante este tiempo de incubación, llevar a todos los reactivos a temperatura ambiente (TA). Hacer todos los reactivos no más de 30 minutos antes de realizar la prueba. La tabla siguiente muestra los volúmenes de los reactivos por pozo. Cuando sea posible, es importante para eliminar los medios de comunicación que contiene el agente reductor antes de proceder con la prueba.
| Células adherentes | Células en suspensión | |||
| Lisis total de Glu | Oxidado Glu Lisis | Lisis total de Glu | Oxidado Glu Lisis | |
| NEM, 25 mM | ninguno | 0.5μl | ninguno | 0.5μl |
| Luciferina-NT | 1 l | 1 l | 1 l | 1 l |
| Tampón de lisis pasiva, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Agua destilada | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| El volumen final por pocillo | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Quitar medio de pozos con células adherentes. No quite medio de pozos con células en suspensión.
- Añadir el reactivo reducido lisis glutatión glutatión oxidado o reactivo de lisis de los pozos correspondientes y agitar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir el reactivo luciferina y la generación de incubate durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir el reactivo de detección luciferina y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Lea la señal bioluminiscente en el momento de la integración de 0,25-1 por segundo y con un luminómetro lector de placas.
| Células adherentes | Células en suspensión | |
| El número de células por pozo | 1x10 4 | 1x10 4 |
| De células en suspensión por drogas y + | 100 l, para ser removido antes de 3,4 | 25μl, para no ser eliminado |
| El glutatión reducido reactivo de lisis | 50 l | 25μl |
| Reactivo de lisis glutatión oxidado | 50 l | 25μl |
| Luciferina reactivo generación | 50 l | 50 l |
| Luciferina reactivo de detección | 100 l | 100 l |
4. Los resultados representativos:
Figura 1 La detección de ROS con carboxi-H2DCFDA tinte. Células Jurkat (línea celular humana de leucemia) tratados con H 2 O 2 se compararon con las células no tratadas. ROS induce la modificación de carboxi-H 2 DCFDA que verde fluorescente detectada por citometría de flujo, el pico fluorescente H 2 O 2 células tratadas cambio en comparación con los picos en los controles (H 2 O 2 células tratadas teñidas con colorantes de oxidación insensible y no tratados con las células teñidas con carboxi-H 2 DCFDA). Los resultados confirman la presencia de ROS en las células tratadas.
Figura 2 Detección of NO utilizando reactivos de Griess. RAW 264.7 (macrófago de ratón) fueron tratados con LPS e IL-4. Un aumento significativo en la producción de NO se detectó en las células tratadas en comparación con el control de las células no tratadas.
| Las líneas celulares | No tratados | Tratados |
| Raw 264,7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
Tabla 1 La detección de ROS mediada por la oxidación de las proteínas. RAW 264,7 células fueron tratadas con LPS, Jurkat y A549 (cáncer de pulmón humano), las células fueron tratadas con H 2 O 2. Los resultados se expresan como el cociente reducido (GSH) / oxidado (GSSG) glutatión. Cocientes más bajos de glutation (GSH) / (GSSG) se detectaron en las células tratadas en comparación concontrol de las células no tratadas, dejando al descubierto que las proteínas eran más oxidados en las células tratadas.
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Discussion
Varias situaciones patológicas, como enfermedades inflamatorias, cáncer, isquemia / reperfusión, y también tratamientos como la radioterapia o la quimioterapia (cisplatino por ejemplo) induce una sobreproducción de ROS. Por lo tanto, la detección y medición de los niveles de ROS es importante en muchos estudios básicos, pre-clínicos y clínicos. Sin embargo, ROS tienen una vida media muy corta y puede ser complicado de detectar. Aquí, proponemos pruebas simples que se utilizan habitualmente y ampliamente aceptado para la detección de la producción de radicales libres en células de mamíferos.
Protocolos de detección permite el uso de tintes, el experimentador utilizar varios métodos ampliamente disponibles (como la microscopía, citometría de flujo, etc ... el lector de placas.) Para evaluar la presencia de ROS. La citometría de flujo y microscopía de proporcionar información sobre la viabilidad celular y el porcentaje de células ROS nulo, bajo, y de alta producción. Microscopía también proporciona información sobre los efectos de ROS en la morfología celular y la adhesión celular. Detección de uso de placa readers permite que la información principalmente cuantitativa. Sin detección de Griess es cuantitativo, pero no proporciona ninguna información sobre la forma o la adhesión de las células estudiadas. NO detección es relativamente sencilla en células de ratón. Sin embargo, una cantidad menor de NO se encuentran en muestras humanas, lo que es importante para tener aún más cuidado en cada paso del procedimiento de detección y de incluir los controles. La detección de la oxidación de proteínas investiga los efectos totales de todos los ROS producidos por las células estudiadas, aquí la intensidad de la señal obtenida representa la cantidad de ROS producido. La detección de H 2 O 2 efectos es más difícil ya que es muy rápidamente eliminado por la catalasa. El ensayo de GSH-GSSG-Glo tiene la capacidad de detectar directamente GSSG, este ensayo reducir al mínimo los problemas de oxidación, ya que se realiza directamente en las muestras sin extracción, y con menor número de células. Para mejorar la lectura GSH / GSSG, la solución de HBSS o glutatión sin los medios de comunicación (por ejemplo, DMEM) debe ser preferida;de trabajo con medio libre de suero mejorará aún más la lectura. Es importante tener en cuenta que varios factores, incluyendo la naturaleza de las células (tipo de tejido, los tejidos normales frente patológica), la confluencia de la cultura monocapa de células, el estado de activación y el estrés, la edad (número de pasajes), así como la tasa de proliferación de las células que tienen un efecto sobre la producción de ROS.
La mayoría de los reactivos utilizados para la detección de ROS son susceptibles a los cambios de luz, oxígeno y temperatura, por lo que es fundamental que el investigador utiliza un cuidado especial para su almacenamiento y uso de todos los reactivos y muestras a analizar, y realizar el trabajo rápidamente.
Cada experimento debe incluir el uso de tintes controles adecuados, como sin tratar (sin drogas), sin carga (no tinta), cargada sin tratar, y descarga de las células tratadas como controles para la producción de ROS / detección. Utilizando un medio sin rojo fenol se reducen las interferencias con los tintes fluorescentes (es decir, carboyH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Antes de comenzar estos experimentos, es importante comprobar la fluorescencia natural de su medicamento / tratamiento y de las células sin tratar de adaptarse a este protocolo. Cargando sus células con el colorante fluorescente se debe hacer antes o después de los tratamientos en función de la duración (minutos / horas frente a varios días) y el tipo de tratamiento (fármacos, isquemia / reperfusión, estrés mecánico) que se aplicará a las células. La concentración de colorante para detectar ROS puede variar dependiendo del tipo de célula y en el estado de activación de las células. Nuestro consejo es comenzar con las concentraciones de tinte de 10μM y 100μM, comprobar la toxicidad y la eficacia de la mancha, y luego reducir la concentración para determinar la mejor dosis a utilizar para sus experimentos.
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Disclosures
Hemos recibido el apoyo de Promega para esta publicación.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
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