Summary
We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.
Abstract
Identificatie van biomarkers die de evolutie van de pathofysiologie van Post Traumatische Stress Stoornis (PTSS) is van vitaal belang, niet alleen om objectieve diagnose, maar ook voor de evaluatie van de therapeutische werkzaamheid en veerkracht van trauma. Lopend onderzoek richt zich op het identificeren van moleculaire biomarkers voor PTSS, met inbegrip van traumatische stress geïnduceerde eiwitten, transcriptomen, genomische afwijkingen en genetische modulatoren, met behulp van biologische monsters van proefpersonen bloed, speeksel, urine en postmortem hersenweefsel. Echter, de correlatie van deze biomarker moleculen in perifere of postmortem monsters veranderde hersenfuncties geassocieerd met psychiatrische symptomen in PTSS is nog niet opgelost. Hier geven we een diermodel van PTSD waarin zowel perifeer bloed en centrale hersenen biomarkers, en gedragsfenotype, worden verzameld en gemeten, waardoor de noodzakelijke samenhang van de centrale biomarkers van PTSD, die mechanisch en pathognoMonic maar kan niet worden verzameld van mensen, met de perifere biomarkers en gedragsmatige fenotypes, wat kan.
Onze diermodel van PTSS maakt gebruik van terughoudendheid en staart schokken herhaald voor drie aaneengesloten dagen - de onontkoombare staart-shock model (ITS) bij ratten. Dit zijn model bootst de pathofysiologie van PTSS 17, 7, 4, 10. Wij en anderen hebben geverifieerd dat de ITS-model leertheoretische en neurobiologische veranderingen vergelijkbaar met die gevonden bij PTSS patiënten 17, 7, 10, 9 induceert. Specifiek deze gespannen ratten vertonen (1) een vertraagde en overdreven schrikreactie verschijnen enkele dagen na stressor stoppen, waaruit het gecomprimeerde tijdschaal van het leven van de rat ten opzichte van een mens gegeven, aan de een tot drie maanden vertraging van symptomen van PTSS patiënten (DSM-IV-TR PTSS Criterian D / E 13), (2) een betere plasma corticosteron (CORT) voor meerdere dagen, met vermelding van aantasting van de hypothalamopituitary as (HPA), en (3) vertraagde body gewichtstoename na stoppen met stressor, wat aangeeft disfunctie van metabole regulering.
De experimentele paradigma dat voor dit model zijn: (1) een aangeleerde hulpeloosheid paradigma in de rat onderzocht door meting van akoestische schrikreactie (ASR) en in kaart brengen van lichaamsmassa (2) microdissectie van de rat hersenen in gebieden en kernen; ( 3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor bloedspiegels van CORT, (4) een genexpressie microarray en de bijbehorende bioinformatica 18. Dit microarray, genaamd rMNChip, gericht op mitochondriale en mitochondria gerelateerde nucleaire genen in de rat om specifiek de neuronale bioenergetica hypothese betrokken bij PTSD pakken.
Protocol
1. Animal Behavioral Model van PTSS
- Onderwerpen: Mannelijke albino Sprague Dawley ratten (Taconic Farms, Derwood, MD) gebruikt weging 150 tot 200 g op het tijdstip van toediening van de stress protocol.
- Meting van voedsel, water-inname en lichaamsgewicht: Bij aankomst in het laboratorium ratten een gewicht van 100 ± 25 g zijn ondergebracht twee tot een kooi (cage grootte: 45x24x20 cm). Cage padding substraat (houtsnippers) worden twee keer per week. Dieren worden bijgehouden op een omgekeerde 12-uur licht cyclus (lichten aan: 1800/0600 en off: 0600-1800) in een temperatuur (22 ± 4 ° C) - en relatieve vochtigheid (30-70%) worden geregeld een week voor experimenten. Water en standaard gepelleteerd chow (Harlan (2018) 18% eiwit Knaagdieren voeding, Global diëten, Harlan Teklad) zijn vrij verkrijgbaar in de woning kooien, en bodyweights worden dagelijks 3 dagen voor opgenomen, 3 dagen tijdens en 3 dagen na de beëindiging van stress .
- Acclimatisatie: Ratten zijn gewend voor drie dagen naar boe het dier faciliteit en een akoestische schrikreactie kamer. Ze wennen aan de akoestische schrikreactie kamer worden dieren behandeld in het 5 min per dag gedurende drie opeenvolgende dagen vóór de initiële metingen.
- Benadrukt protocol: De dieren worden eveneens toegewezen aan elke groep op basis van hun lichaamsgewicht en basislijn schrikreactie. Tests worden uitgevoerd op twee groepen van dieren, waarbij elke groep bestaat uit 16 dieren. Groep 1 ontvangt de stress protocol, en groep 2 is de controle.
De stress blootstelling protocol is een continue 2-hr procedure, waarbij elke sessie bestaat uit bevestigingssysteem ("onontkoombaar") en staart-schokken, herhaalde eenmaal per dag gedurende 3 opeenvolgende dagen. Nadruk wordt gedaan in de ochtend (binnen het venster 0800 en 1200). Dieren worden beperkt door worden geïmmobiliseerd in een geventileerde plexiglas buis. Veertig elektrische schokken (2 mA, 3 sec duur, Animal testkooi roostervloer Shocker, Coulbourn Instruments, USA) worden geleverd aan hun staarten op semi-willekeurige intervallen van 150 to 210 sec (Graphic Staat notatie software, Habitest Universal Link, Coulbourn Instruments, USA). Stimulatie bij 2 mA is gekozen omdat het aversieve, maar niet pijnlijk, als de stimulerende uitgang wordt geplaatst over de vinger van de experimentator. Electrode gel wordt aangebracht met Q-tip een dunne laag geleidend gel tussen elektrode en de huid van de staart van de rat te vormen. De elektrode clips worden aangepast en aangesloten op de staart om een goede verbinding te waarborgen zonder de bloedsomloop van de staart. - Akoestische schrikreactie (ASR): akoestische schrikreactie meting werd uitgevoerd met een schrikreactie Acoustic Test System (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, USA) 3. Dit systeem bestaat uit gewichtsgevoelige platforms in een geluiddichte kamer verzwakt. De transducer, een rekstrookje in elk van de schrikreactie platforms kalibratie vereist voor gebruik. Ten eerste moet de koppeling in de gekoppelde DC mode voor kalibratie. In deze stand is de koppeling uitgang van direct volgt de input van het platform, de wijze vereist voor kalibratie met statische gewichten. De transducer wordt overgeschakeld naar de AC gekoppelde stand tijdens de experimenten, zodat alleen snelle verandering in kracht, die schrikreactie aangeeft, wordt uitgevoerd. De dieren bewegingen in reactie op geluidsstimuli worden dus bepaald als een spanningsverandering van een rekstrookje in elke platform en geregistreerd als de maximale respons die binnen 200 ms na het begin van de schrikreactie-stimulus.
Er zijn zes soorten van de stimulus trials: 100 dB alleen, 100 dB met pre-puls, 110 dB alleen, 110 dB met pre-puls, pre-puls alleen en geen stimulus controle. Elk proces-type werd gepresenteerd acht keer. Trial soorten worden gepresenteerd in willekeurige volgorde te bestellen effecten en gewenning te voorkomen. Inter-trial intervallen variëren willekeurig 15 tot 25 sec. Van de acht proeven alleen de maximum waarden worden verzameld in de resultaten en uiteindelijk gecorrigeerd met het dier lichaamsgewicht van de dag. Dieren worden getest een dag before stress of andere behandeling als nulmeting en 1, 7, 14 en 21 dagen na de laatste dag van de opeenvolgende 3 dagen stress procedure of andere behandelingen. - Gegevensanalyse:
- ASR: De amplitude van akoestische schrikreactie getest elke keer wordt weergegeven als "% van de baseline", die wordt berekend met de formule:% van de uitgangswaarde = (absolute amplitude / baseline absolute amplitude) × 100%. Voor elke test dag worden ANOVA voor herhaalde metingen uitgevoerd op schrikreacties amplitudes met factoren van stress status en doseringen van geneesmiddelen met behulp van SPSS (versie 16) software. Tukey, Bonferroni of Dunnett tests worden gebruikt om belangrijke post-hoc verschillen tussen afzonderlijke groepen te beoordelen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM
- Groei: Lichaamsgewicht en voedsel en water worden gemeten op dag -1 voorafgaande stress en op de dagen 14, 21 en 30 na afronding van de stress-protocol. Statistische analyse: voedsel-en wateropname gegevens worden onderworpen aan eenZo herhaalde-maatregelen variantieanalyse (ANOVA). De veranderingen in voedselconsumptie snelheid over de tijd te analyseren, wordt de hoeveelheid voedselinname verder verdeeld door het lichaamsgewicht van het onderwerp de variantie in lichaamsgewicht veroorzaakt door de stress protocol en initiële verschil in lichaamsgewicht tussen de groepen te minimaliseren. Alle procedures worden uitgevoerd onder de goedkeuring in overeenstemming met de institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
2. Brain Dissection
- Instrumenten & Materialen:
- Anesthesie jar: ". Specerij jar" Dit is een glazen pot met deksel, het meten van ongeveer 6 cm hoog en 5 cm in diameter, zoals een "apotheker jar", "katoenen bal pot", of
- Guillotine voor ratten, zoals geleverd door Kent Scientific.
- Vibratome 1000:
- Snijd scheermesje lengterichting doormidden, was olie af met alcohol, in te voegen in klem.
- Vul bad met gewone gemalen ijs.
- Plaatsde lade lengterichting.
- Veeg de lade van vocht voordat u een druppel cyanoacrylaat.
- Rongeurs (Voorbeelden zijn micro Friedman rongeur van Miltex, cat.. 17-4801 of Pearson rongeur van Fine Science Tools cat. 16015-17).
- # 3 of # 5 juweliers pincet (scherpe te trekken uit dura).
- Kleine schaar met scherpe punten (Vantage V95-304 is een voorbeeld).
- (2) roestvrijstalen platte mini spatels, zoals gebruikt voor poedervormige stoffen naar een weegschaal. De brede uiteinde naar voren, zodat gebogen om te passen tussen telencephalon en calvarium.
- Lepel de hersenen blok over te dragen. (Een plastic soep lepel uit de kantine werkt prima.)
- Scalpel # 10.
- Dubbele rand scheermesje (koolstofstaal):
- De ene helft voor Vibratome.
- Een half voor dissectie.
- Twee glazen petrischaaltjes, ~ 3,5 cm en 4 cm in diameter, zodanig dat past in de andere. Crushed ijs in de bottom schotel. Twee filtreerpapier in de top schotel. Verplaats slice om de gewenste posities door het bewegen van het filtreerpapier.
- 100 ml bekerglas.
- Pipet naar de hersenen bevloeien met ijs gekoeld een CSF. (Glas Pasteur pipet met smalle uiteinde gestoken in 1/2 inch breed latex lamp werkt goed.)
- Crushed ice tray: Ongeveer 5 cm hoog, 20 cm lang, 10 cm breed. Bevat:
- Plak alle instrumenten in de gemalen ijs.
- Laag calcium / hoog magnesium aCSF in plastic fles die kunnen worden geneukt om het ijs te breken.
- Cyanoacrylaat.
- Laag calcium / magnesium hoge kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF):
- In mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2 * 2H 2 O, 2,0 MgCl2 * 6H 2 0, 1,2 NaH 2PO 4 * H 2 O, 25 NaHCO, 11 Glucose.
- In plastic fles die kunnen worden geneukt om het ijs te breken.
- Chill voor 20 min in -80 ° C vriezer om het te maken in een slush.
- Wattenstaafjes.
- Filter: Whatman 42,5 mm (Cat nr. 1001 042.).
- Mini centrifugebuizen kleinere secties van weefsel verzamelen.
- Wells plaat grotere structuren en secties van weefsel verzamelen.
- Papieren handdoek.
- Rode biohazard zak.
- Anesthesie:
- Anesthesie jar, gaasjes, isofluraan, metalen tang, zijn geplaatst in een zuurkast.
- Rat wordt geplaatst in de anesthesie pot.
- Bevochtig gaasje met isofluraan en plaats in de anesthesie pot.
- Wacht tot pedaal reflex - de terugtrekking van de poot wanneer het web is geknepen met een tang - of corneale reflex verdwijnt.
- Onthoofden: Grijpen rat met een hand rond thorax van achteren, rat onthoofden met guillotine zo dicht bij de achterhoofdsknobbel mogelijk te maken. De atlas zal nog steeds blijven gewoonlijk verbonden aan de schedel.
- Bloedafname: Squeeze rat op thorax te voorkomen dat het bloed spoot uit halsslagaders.Geleidelijk ontspannen grip om de bloedstroom in de verzamelcontainer regelen.
- Het verwijderen van de hersenen:
- Snel gesneden spier-en eventuele resterende wervels uit de buurt van de basiocciput met de kleine schaar.
- Met behulp van rongeur en te beginnen bij het foramen magnum, weggesneden de occipitale condylus en de basiocciput.
- Middellijn hoofdhuid incisie met scalpel.
- Met behulp van de schaar, knipte een half sagittale incisie in de occipitale en pariëtale botten. Grijpen de cut marge van de schedel met de rongeurs, breek het terug als een eierschaal uit de buurt van de middellijn, die zorgvuldig om elk contact met de hersenen te minimaliseren. De middellijn gesneden en obstakelbeveiliging kan worden uitgevoerd in fasen.
- Omdat de hersenen verder wordt belicht, is het essentieel om het te blussen met ijs gekoeld aCSF om de integriteit en de vitaliteit van het weefsel te behouden.
- Ook break-away temporale en frontale beenderen.
- Met fijne tang, losrukken van de dura, en zorg ervoor dat de gettentorum cerebelli.
- Met mini spatel ingevoegd onder de frontale kwab van de hersenen te verhogen van de calvarium net genoeg om de spanning op de hersenzenuwen.
- Transect de hersenzenuwen met de schaar.
- Geheel Til de hersenen uit de schedel en laat vallen in de beker ijskoude lage calcium / magnesium hoge aCSF. Laat een minuut of langer te koelen dat het weefsel zal vast zijn, zullen de structuren duidelijk zichtbaar, en de gezondheid van het weefsel worden behouden.
- De plastic Schep de hersenen op het filterpapier in de petrischaal ijs gekoeld, ventrale boven.
- Dissectie van de hersenen:
- Maak een coronale doorsnijding met scheermesje in het midden cerebrale slagader (Figuur 2A).
- Tijdelijk opslaan frontale kwab in ijs gekoeld lage calcium / hoog magnesium aCSF in bekerglas van 100 ml.
- Flip hersenen, zodat het dorsale oppervlak omhoog. Transect de hersenstam op het kruispunt van de middenhersenen eennd diencaphalon. Het resulterende blok hersenen is te zien in figuur 2B.
- Laat de geblokkeerde hersenen terug in iced lage calcium / magnesium hoge aCSF.
- Met behulp van mini spatels, ontleden cerebellum van medulla / pons. Opslaan in media geschikt voor het beoogde analyse.
- Zet de geblokkeerde cerebrum naar de petrischaal. Met behulp van twee filtreerpapier, til de hersenen door het plaatsen van een filter papier op de ventrum. Hiermee plaats de achterste frontale vlak van de geblokkeerde cerebrum aan de rand van de tweede filtreerpapier. Met deze filtreerpapier plaats de voorste cut vlak van de geblokkeerde cerebrum op een daling van cyanoacrylaat op de Vibratome snijplaat, cortex tegenover het blad.
- Met de Vibratome, afgesneden net genoeg van de caudale hersenen, zodat de hippcampus shows (figuur 2C).
- Neem een sectie, 2.400 μ dik in een 125 g rat, 2.700 μ dik in 200 g rat. Breng het gedeelte met een wattenstaafje op de filtreerpapier op de petrischaal(Figuur 2D).
- Snijd en opslaan cingulate cortex met het scheermesje.
- Met een tandheelkundige spatel, duwen in de verste rand van het corpus callosum om te snijden, trek het isocortex.
- Vanuit haar ventolateral marge, afpellen de hippocampus (figuur 2E).
- Sla de middenhersenen.
- Neem een tweede deel, 2.400 pm dik in 120 g rat, 2.500 pm dik in 200 g rat. Plaats de paragraaf over de filtreerpapier op de petrischaal (figuur 2F). Alternatief, vijf secties 500 urn genomen op dit punt voor elektrofysiologie.
- Snijd en opslaan cingulate cortex met het scheermesje.
- Maak zijdelingse delen, met het scheermes op de interne capsule aan de isocortex (figuur 2F) te verwijderen.
- Maak schuine delen, met het scheermes aan de amygdali (figuur 2F, G) te verwijderen.
- Maak een doos gesneden met het scheermes om de hypothalamus te verwijderen. De lateralesneden lateraal van de ventromediale kern van de hypothalamus, die zichtbaar is. Wij maken de dorsale snede net boven het derde ventrikel of ventrale tegmentale gebied (Figuur 2H).
- Duw spatel in het corpus callosum en weg te trekken het kleine stukje isocortex aan de hippocampus. Plaats het smalle uiteinde van de spatel ventraal van de hippocampus commissuur en verhogen dorsaal te trekken uit de hippocampus.
- Behoud van RNA en Eiwitten in monsters van het hersenweefsel en Bloed:
- Media voor RNA assay:
- Brain: RNAlater RNA stabilisatie reagens # 76106 in Eppendorf buizen.
- Bloed: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
- Media voor eiwit (CORT) assay uit bloed: Solution d-HBSS, w / o Ca2 + en Mg2 +, (Quality Biological, Inc).
- Opslag:
- Verzameld hersenweefsel eerst wordt opgeslagen in een korf van droog ijs niet meer dan 12 uur en daarna in een -70 ° C vriezervoor gebruik binnen 6 maanden, de duur van de studie.
- Verzamelde bloed wordt bewaard bij kamertemperatuur geroerd om reagentia te dringen, waarna het wordt opgeslagen in een -70 ° C vriezer voor gebruik binnen 6 maanden, de duur van de studie.
- Media voor RNA assay:
3. Gene Microarray van mitochondriale & Mitochondria verband Nuclear Genes
Om rat mitochondriale functies in de hersenen weefsels te bestuderen, hebben we recent ontwikkelde de rat mitochondrion-neuron gerichte microarray (rMNChip) en bio-informatica tools voor snelle identificatie van differentiële paden in de hersenen weefsels 18. rMNChip bevat 1.500 genen die betrokken zijn bij mitochondriale functies, stress respons, circadiane ritmes en signaaltransductie. De bioinformatica tool bevat een algoritme voor het berekenen van van differentieel tot expressie genen, en een database voor eenvoudige en intuïtieve interpretatie voor microarray resultaten.
- Purification totaal RNA uit weefsels (Cat # 2011-1 GPM-Kit, GenProMarkers):
- Hersenweefsel van ratten specifieke kernen in RNA RNA later stabilisatie reagens (Qiagen).
- Tissue (30 mg in 600 pi GPM-L / B buffer) homogeniseren met Ultra-Turrax T8 Dispergierstation (IKA Labortechnik).
- Centrifugeren in 1,5 ml buizen bij Sorvall 21.000 rpm gedurende 15 minuten.
- Giet het supernatant in een spin kolom met 2-ml verzamelbuis.
- Centrifugeer de kolom buizen bij 15.000 rpm gedurende 3 min, gooi de doorstroom.
- Voeg 700 ul GPM-B / W buffer aan elk van de spin kolommen wordt gecentrifugeerd kolom-buizen bij 16.000 rpm gedurende 15 sec, gooi de doorstroom.
- Voeg 500 ul GPM-W buffer aan elk van de spin kolommen wordt gecentrifugeerd kolom-buizen bij 16.000 rpm gedurende 15 sec, herhaal eenmaal.
- Plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml verzamelbuis.
- Voeg 30 pl DEPC-behandeld water aan elk van de spin kolommen gecentrifugeerd bij 16.000 rpm gedurende1 min, eenmaal herhalen.
- RNA meten concentratie, de concentratie aan te passen aan 1 ug / ul met DNase-en RNase-vrij water, de monsters klaar voor microarray labeling.
- Microarray etikettering en hybridisatie (Cat # Array 900, Genisphere):
- 1,0 ug rat totale RNA wordt gebruikt voor cDNA synthese en microarray etikettering volgens instructies van de fabrikant.
- Microarray hybridisatie wordt uitgevoerd op een rMNChip bij 65 ° C gedurende 12-16 uur zoals eerder beschreven 18.
- Wassen gehybridiseerd Microarray Slides (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
Wassen Oplossing Volume 20 X SSC 10% SDS ddH 2 O 0,5 x SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml tot 500 ml 0,5 x SSC 500 ml 12,5 ml tot 500 ml 0,1 x SSC 500 ml 2,5 ml tot 500 ml 0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml tot 500 ml
Tijdens het wassen van de glaasjes worden beschermd tegen licht. Laat geen dia's uitdrogen in elke fase.- Wassen slides in 250 ml oplossing 1 in een glazen pot Coplin (Cat #: 70312-20, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) bij kamertemperatuur door schudden van de pot op een BioShaker (Molecular Technologies Inc, St. Louis, MO ) vallen totdat alle dekglaasjes van de objectglaasjes (duurt <3 minuten).
- Was de dia's met 250 ml oplossing 2 in een andere pot door de pot roeren gedurende 3 minuten.
- Was dia's met 250-ml Oplossing 3in een andere pot door draaien van de pot voor 3 min, tweemaal herhalen stap.
- Was dia's met 250-ml Oplossing 4 in een andere pot voor 10 sec. Droog de glaasjes direct door centrifugeren van het potten op de PN11779 platen en ST-H750 rotor in een Sorvall Super T21 centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
- Plaats de objectglaasjes gewassen in een doos voor het aftasten zo spoedig mogelijk.
- Microarray scan en analyse met behulp ScanArray Express Microarray Scanner (PerkinElmer) naar aanleiding van de handleiding en de focus op:
- Microarray beeld scannen: makkelijk te scannen scannen versus protocol.
- Effecten van laservermogen, PMT en normalisatie methoden op gegevens uitkomsten.
- Uitlijning van GAL-bestand naar beeld.
- Afstemming van plekken om roosters precies.
- Data-analyse: De aangepaste computationele procedures voor microarray data-analyse zijn microarray beeld evaluatie, gegevens filteren, puntgrootte correctie, integratie, normalization en vergelijking zoals eerder beschreven 18. Bovendien zijn de werkwijzen voor ontologie, route en netwerkanalyses zijn dezelfde zoals eerder beschreven om de productie van reproduceerbare en controleerbare microarray resultaten 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18 verzekeren.
4. Blood Sample Collection en Plasma CORT concentratiemeting
- Pre-of post-stress staart bloedmonsters van verdoofde dieren worden verzameld Op dag 1, 14, 21 en 30 in gehepariniseerde buisjes voor het bepalen van circulerende niveaus CORT.
- Trunk bloedmonsters worden ook verzameld in gehepariniseerde buizen na dieren worden gedood. Plasma wordt gewonnen en bewaard bij -70 ° C tot analyse.
- Media voor plasma extractie:
- Bloedmonsters voor RNA-extractie worden verzameld met behulp van PAXgene Blood RNA buizen (PreAnalytix, Quagen)
- Bloedmonsters voor DNA-extractie worden verzameld met behulp van PAXgene Blood DNA buizen (PreAnalytix, Quagen). Bloedmonsters voor eiwitanalyse geschiedt volgens lithiumheparine capillaire buis Collection (200 ul) van MaketLab # ML5601.
- Plasma CORT concentratie is getest en geanalyseerd met Active Rat Cort EIA (Diagnostic Systems Labs Inc http://www.beckmancoulter.com/ ) als volgt:
- Markeer de microtitratie strips worden gebruikt.
- Bereid Rat CORT enzym conjugaat oplossing door verdunnen van Rat CORT enzym conjugaat Concentraat in de Conjugate Diluent.
- Pipetteer 25 ul standaarden, controles en onbekenden in putten.
- Voeg 100 ul enzymconjugaat oplossing in elk putje met een semi-automatische dispenser. Tik voorzichtig de goed houder 5-10 sec.
- Voeg 100 ul Rat CORT Antiserum aan elk putje met een semi-automatische dispenser.
- Incubeer de putjes bij kamertemperatuur, 25 ° C, op een schudapparaat ingesteld op 500 tot 700 rpm gedurende 60 minuten.
- Zuig en was elke WELl 5 keer met Wash Solution met behulp van een automatische microplaat wasmachine. Dep droog door het omkeren plaat op absorberend materiaal.
- Voeg 100 ul van de TMB Chromogeen oplossing in elk putje met een semi-automatische dispenser.
- Incubeer bij kamertemperatuur 15-20 minuten op een orbitale microtiterplaatschudder ingesteld op 500 tot 700 toeren per minuut. Let op de kleur te veranderen.
- Voeg 100 ul stopoplossing aan elk putje met een semi-automatische dispenser.
- Schud plaat met de hand 5-10 sec.
- Lees de extinctie van de oplossing in het ruim binnen 30 minuten.
- Filter is ingesteld op 450 nm. * EIA kits kunnen worden gekocht bij immunobiologische Laboratories ( www.ibl-america.com ).
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. Ratten worden beperkt en worden blootgesteld aan de staart schok. Latere lichaamsgewicht, Zijn plasma corticosteron concentratie en akoestische schrikreactie gemeten A:. Stress Belichting: Dieren worden beperkt door worden geïmmobiliseerd in een geventileerde plexiglas buis. Veertig elektrische schokken (2 mA, 3 sec duur ;) worden geleverd aan hun staarten op semi-willekeurige tussenpozen van 150 tot 210 sec B en C:. Stress vertraagt winst in lichaamsgewicht tijdens de groei: Lichaamsgewicht en voedsel en water worden gemeten onmiddellijk voorafgaand aan stress (Day -3) op de dag van de drie dagen van stress en elke andere dag na maximaal Dag 14. Het gebrek aan winst van het lichaamsgewicht tijdens stress wordt nooit vergoed D:.. Stress verhoogt plasma corticosteron concentratie E: akoestische schrikreactie: Dieren worden getest een dag voor stress (dag-1) als een nulmeting en 12 dagen na de laatste dag van de opeenvolgende 3 dagen van de stress. Gegevens voor elke groep - Stress and Control - zijn uitgedrukt als percentage van akoestischeschrikken op dag 12 ten opzichte van dag -1. Stress verhoogt aanzienlijk de akoestische schrikreflex. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2 Dissectie van de amygdala, hippocampus en hypothalamus van de hersenen slice A:.. Rat hersenen, ventrale uitzicht: Pijlen wijzen op de middelste cerebrale slagaders B:. De hersenen blokkeren, ventrale uitzicht, klaar om te worden vervoerd naar de Vibratome. C: De hersenen blok vastgelijmd aan de vibratome lade, caudale zijde omhoog, cortex tegenover het blad. De caudale hersenen is al weggesneden het blootstellen van de caudale hippocampus. Het blok is nu klaar voor de 2.500 urn plak die het grootste deel van de hippocampus te nemen D:. De 2.500 urn dikke plak met de caudale hippocampus E:. Thij isocortex (ISO) wordt afgepeld van de hippocampus (HC) en de hippocampus afgepeld van de middenhersenen F:.. De 2.500 urn dikke plak met de amygdala en de rostrale hippocampus G: De isocortex is uitgesneden en de amygdala (AmyG) gereseceerd . H:. De hypothalamus (HT) wordt uitgesneden en verplaatst Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Expression niveaus mRNA van de glucocorticoïdreceptor (GR) en minerocorticoid receptor (MR) in amygdala, hippocampus, hypothalamus en frontale cortex voor (C, controle) en na (Str) staart-shock stress. Eenheden zijn percentage van controle; bars zijn SEM A: Amygdala: Stress vermindert minerocorticoid receptor mRNA expressie B: Hippocampus: Stress increa.ses minerocorticoid receptor mRNA expressie C:. Hypothalamus:. Stress verhoogt minerocorticoid receptor mRNA expressie D: frontale cortex: Stress vermindert glucocorticoïd receptor mRNA expressie alsook minerocorticoid receptor mRNA expressie.
| De (121bp) PCR-primers voor rat GR zijn: | 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC |
| De (99 bp) PCR-primers voor rat MR zijn: | 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT |
Figuur 4. Cluster en heatmap van RNA differentieel tot expressie van 64 genen afgeleid van 5 rattenhersenen weefsels, waaronder cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontale cortex (FC), hypothalamus (HT), en hippocampus (HC). Kleur kaart geeft vouw veranderingen in deigen-(groen) en up-(rood) tot expressie gebrachte genen. (A) Cluster en heatmap van de genormaliseerde signaalintensiteiten van 9 metingen per 64 genen afgeleid van 15 microarray experimenten voor deze vijf hersenweefsel. De expressie van elk gen werd gemeten door technische drievoud en experimentele triplo. (B) Cluster en heatmap van het gemiddelde RNA niveaus van deze 9 metingen van elk van de 64 genen. Deze resultaten tonen duidelijke verschillen in mitochondriale genexpressie en dus gerelateerde functies, die onze hypothese dat verschillende hersengebieden verschillende energie-eisen hebben. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
De toepassing van de rMNChip en bioinformatica instrumenten leidde tot identificatie van een cluster en heatmap van 64 genen differentieel tot expressie RNA afgeleid van 5 rattenhersenen weefsels waaronder cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontale cortex (FC), hypothalamus (HT), en hippocampus (HC) (Figuur 4). Deze gegevens tonen het duidelijke verschillen in mitochondriale genexpressie en dus gerelateerde functies. De resultaten tonen dat de verschillende hersengebieden verschillende hoeveelheid energie vereisen om de uitvoering van overeenkomstige hersenfuncties.
Discussion
De diagnose van PTSS is gebaseerd op zelf gerapporteerde psychiatrische symptomen (DSM IV) van mogelijke onderwerpen. Geen goed gedefinieerde biomarker is momenteel beschikbaar voor de pathofysiologische status van potentiële PTSS-patiënten te openen. PTSS is een aandoening veroorzaakt door levensbedreigende traumatische gebeurtenissen en de belangrijkste psychiatrische symptomen aanwezig blijven in het leven van het overlevingspensioen voor maanden en zelfs jaren na de eerste gebeurtenissen. De meest prominente en aanhoudende symptomen geopenbaard bij patiënten met PTSS zijn overmatige waakzaamheid, overdreven schrikreacties vertraagd 14, 15, 16 en een schijnbare compromis van de HPA-as. Bij mensen deze symptomen blijven, of verschijnen met een vertraging van drie maanden, na de beëindiging van de traumatische stressor 24. Ons huidige model voor biomarker studies van PTSS telt terughoudendheid en staart schokken herhaald voor drie aaneengesloten dagen (2-uur sessies van 40, 2 mA tailshocks) - de onontkoombare staart-shock model (ITS) bij ratten een gewicht van 150 gram. Dit ITS model heeftaangetoond bootsen aanzienlijke mate de pathofysiologie van PTSS 17, 7, 4, 10. Ons laboratorium en andere laboratoria hebben geverifieerd dat de ITS model van stress in ratten gedrags-en neurologische veranderingen die lijken op die in PTSD onderwerpen 17, 7, 10, 9 induceert. Specifiek deze gespannen ratten vertonen (1) een vertraagde en overdreven schrikreactie verschijnen enkele dagen na stressor stoppen, waaruit het gecomprimeerde tijdschaal van het leven van de rat ten opzichte van een mens gegeven, aan de een tot drie maanden vertraging van symptomen van PTSS patiënten (DSM-IV-TR PTSS Criterian D / E 13), (2) een betere plasma corticosteron (CORT) voor meerdere (10) dagen, met vermelding van aantasting van de hypothalamopituitary as (HPA), en (3) vertraagde toename van het lichaamsgewicht na stressor stoppen, wat overeenkomt met de disfunctie van metabole regulering van PTSS. Er is geen bewijs in de literatuur dat vos geur, roofdier blootstelling of gepotentieerde schrikreactie, tentoonstel vrezenbit deze hardnekkige gedrags-en neuroendocrinologic fenotypen geassocieerd met PTSS.
Ratten blootgesteld aan een spanning sessie (1DS) hebben een voorbijgaande, maar niet de aanhoudende afwijkingen weergegeven 3DS ratten 17 De onderhavige experiment vergeleken schrikreactie van 3DS en 1DS ratten 4, 7 en 10 dagen na beëindiging stressor. In overeenstemming met eerder werk, benadrukte ratten vertoonden verhoogde basale plasma CORT niveaus van de eerste dag na de stress-17. Deze CORT niveaus gevoelig waren voor het aantal posities stressor met hogere niveaus in 3DS CORT ratten dan in 1DS ratten. Zoals voor schrikreactie, de 1DS ratten vertonen een overdreven schrikreacties 7 dagen na de stressor, terwijl schrikreacties sensibilisatie pas duidelijk 10 dagen na stressor in 3DS ratten. Dus het uiterlijk van een overdreven schrikreacties na beëindiging stressor gerelateerd lijkt te zijn aan het aantal posities spanning sessie. De 3DS gestreste model lijkt tenuttig zijn om inzicht te krijgen in de veranderde expressie van biomarkers geassocieerd met de symptomen van PTSS en de belangrijkste meetbare gedrag fenotypen geassocieerd met de timing als gevolg van de beëindiging van de stress. Genomic resultaten gepresenteerd bieden proof of principle voor de toepassing van rMNChip en bio-informatica tools om differentiële paden, en gen-en eiwit biomerkers, die sterk zal vergemakkelijken systemen-biologische studie en begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan complexe en multifactoriële neurologische aandoeningen, waaronder PTSS te identificeren.
Terwijl onze paradigma niet ingaan op de cognitieve en meer complexe gedragsmatige aspecten van PTSS, merken we op dat veranderde slaappatronen in de ITS model 1 komen overeen met de moeilijkheid vallen en in slaap blijven en de nachtmerries van PTSS-patiënten 11 (DSM-IV-TR PTSS Criteria D 13), en de tekortkomingen in ontsnapping / vermijding leren en leren van een appetitieve taak in de ITS-model
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de CDMRP, USUHS Grants G188LE, G188MG, en G188QC (HL), en de USUHS Centrum voor de Studie van Traumatic Stress.
References
- Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol. Behav. 49, 257-262 (1991).
- Bai, X., Wu, J., Zhang, Q., Alesci, S., Manoli, I., Blackman, M. R., Chrousos, G. P., Goldstein, A. L., Rennert, O. M., Su, Y. A. Third-generation human mitochondria-focused cDNA microarray and its bioinformatic tools for analysis of gene expression. Biotechniques. 42, 365-375 (2007).
- Blaszczyk, J. W. Startle response to short acoustic stimuli in rats. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). 63, 25-30 (2003).
- Braga, M. F., roniadou-Anderjaska, V., Manion, S. T., Hough, C. J., Li, H. Stress impairs alpha(1A) adrenoceptor-mediated noradrenergic facilitation of GABAergic transmission in the basolateral amygdala. Neuropsychopharmacology. 29, 45-58 (2004).
- Bremner, J. D., Vythilingam, M., Vermetten, E., Anderson, G., Newcomer, J. W., Charney, D. S. Effects of glucocorticoids on declarative memory function in major depression. Biol. Psychiatry. 55, 811-815 (2004).
- Garrick, T., Morrow, N., Eth, S., Marciano, D., Shalev, A. Psychophysiologic parameters of traumatic stress disorder in rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 821, 533-537 (1997).
- Garrick, T., Morrow, N., Shalev, A. Y., Eth, S. Stress-induced enhancement of auditory startle: an animal model of posttraumatic stress disorder. Psychiatry. 64, 346-354 (2001).
- Hsiao, Y. H., Su, Y. A., Tsai, H. D., Mason, J. T., Chou, M. C., Man, Y. G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression. Int. J. Biol. Sci. 6, 428-442 (2010).
- Jiang, X., Xing, G., Yang, C., Verma, A., Zhang, L., Li, H. Stress Impairs 5-HT(2A) Receptor-Mediated Serotonergic Facilitation of GABA Release in Juvenile Rat Basolateral Amygdala. Neuropsychopharmacology. , (2008).
- Jiang, X., Zhang, Z. J., Zhang, S., Gamble, E. H., Jia, M., Ursano, R. J., Li, H. 5-HT2A receptor antagonism by MDL 11,939 during inescapable stress prevents subsequent exaggeration of acoustic startle response and reduced body weight in rats. J. Psychopharmacol. , (2009).
- Maher, H. K. Sleep deprivation: are you a victim. AAOHN. J. 54, 548 (2006).
- Maier, S. F. Exposure to the stressor environment prevents the temporal dissipation of behavioral depression/learned helplessness. Biol. Psychiatry. 49, 763-773 (2001).
- North, C. S., Suris, A. M., Davis, M., Smith, R. P. Toward validation of the diagnosis of posttraumatic stress disorder. Am. J. Psychiatry. 166, 34-41 (2009).
- Orr, S. P., Metzger, L. J., Pitman, R. K. Psychophysiology of post-traumatic stress disorder. Psychiatr. Clin. North Am. 25, 271-293 (2002).
- Orr, S. P., Roth, W. T. Psychophysiological assessment: clinical applications for PTSD. J. Affect. Disord. 61, 225-240 (2000).
- Pitman, R. K., Orr, S. P., Shalev, A. Y., Metzger, L. J., Mellman, T. A. Psychophysiological alterations in post-traumatic stress disorder. Semin. Clin. Neuropsychiatry. 4, 234-241 (1999).
- Servatius, R. J., Ottenweller, J. E., Natelson, B. H. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biological Psychiatry. 38, 539-546 (1995).
- Su, Y. A., Zhang, Q., Su, D. M., Tang, M. X. Rat Mitochondrion-Neuron Focused Microarray (rMNChip) and Bioinformatics Tools for Rapid Identification of Differential Pathways in Brain Tissues. Int. J. Biol. Sci. 7, 308-322 (2011).
- Su, D. M., Zhang, Q., Wang, X., He, P., Zhu, Y. J., Zhao, J., Rennert, O. M., Su, Y. A. Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther. , (2009).
- Identification of stress-responsive genes, canonical pathways, molecular networks and drug targets in brain tissues of human and animals for systems-biology study of post-traumatic stress disorder. Su, Y. A., Li, H., He, P., Webster, M. J., Zhang, Q., Zhang, L., Wang, X., Su, D. M., Ursano, R. J., Rennert, O. M. The DOD Congressionally Directed Medical Research Programs, the third Military Health Research Forum (MHRF), August 31 - September 3, 2009, Hallmark Crown Center, Kansas City, Missouri, , (2009).
- Su, Y. A., Wu, J., Zhang, L., Zhang, Q., Su, D. M., He, P., Wang, B. D., Li, H., Webster, M. J., Rennert, O. M., Ursano, R. J. Dysregulated mitochondrial genes and networks with drug targets in postmortem brain of patients with posttraumatic stress disorder (PTSD) revealed by human mitochondria-focused cDNA microarrays. Int. J Biol. Sci. 4, 223-235 (2008).
- Su, Y. A., Yang, J., Tao, L., Nguyen, H., He, P. Undetectable and Decreased Expression of KIAA1949 (Phostensin) Encoded on Chromosome 6p21.33 in Human Breast Cancers Revealed by Transcriptome Analysis. J. Cancer. 1, 38-50 (2010).
- Yehuda, R., Yang, R. K., Buchsbaum, M. S., Golier, J. A. Alterations in cortisol negative feedback inhibition as examined using the ACTH response to cortisol administration in PTSD. Psychoneuroendocrinology. 31, 447-451 (2006).
- Zhang, Q., Wu, J., Nguyen, A., Wang, B. D., He, P., Laurent, G. S., Rennert, O. M., Su, A. Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6) revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays. Apoptosis. 13, 993-1004 (2008).
