Summary
Se describe un modelo de rata de trastorno de estrés postraumático (TEPT), que revela las alteraciones persistentes en la función neuroendocrina y el retraso a largo plazo, la respuesta temor exagerado, característicos de pacientes con TEPT. El modelo animal y los métodos descritos aquí son útiles para la correlación de biomarcadores en núcleos cerebrales, que son mecanicista, pero no se puede medir en los pacientes, con biomarcadores en la sangre periférica de células blancas, que pueden.
Abstract
La identificación de biomarcadores que representan la evolución de la fisiopatología del trastorno de estrés postraumático (TEPT) es de vital importancia, no sólo para el diagnóstico objetivo, sino también para la evaluación de la eficacia terapéutica y la resistencia al trauma. La investigación en curso está dirigido a la identificación de biomarcadores moleculares para el trastorno de estrés postraumático, incluyendo proteínas inducidas por estrés postraumático, transcriptomes, variaciones genómicas y moduladores genéticos, con muestras biológicas de sangre de los sujetos, la saliva, la orina y los tejidos post-mortem del cerebro. Sin embargo, la correlación de estas moléculas de biomarcadores en muestras postmortem o periféricas a las funciones del cerebro y se asocia con síntomas psiquiátricos en el TEPT sigue sin resolverse. Aquí, se presenta un modelo animal de trastorno de estrés postraumático en el que tanto en sangre periférica y los biomarcadores cerebrales centrales, así como fenotipo de comportamiento, puede ser recogido y medido, proporcionando así la necesaria correlación de los biomarcadores centrales del trastorno de estrés postraumático, que son mecánica y pathognomonic pero no se pueden recoger de las personas, con los biomarcadores periféricos y fenotipos de comportamiento, que puede.
Nuestro modelo animal de trastorno de estrés postraumático emplea moderación y choques repetidos cola durante tres días seguidos - la inevitable cola-shock modelo (ITS) en ratas. Este modelo imita ITS la fisiopatología del TEPT 17, 7, 4, 10. Nosotros y otros han comprobado que el modelo SU induce alteraciones conductuales y neurobiológicos similares a los encontrados en el TEPT temas 17, 7, 10, 9. Específicamente, estas ratas estresadas muestran (1) una respuesta de sobresalto retardada y exagerada aparecer varios días después de la cesación de estrés, que dada la escala de tiempo comprimido de la vida de la rata en comparación con un ser humano, corresponde al retardo de uno a tres meses de los síntomas en pacientes con TEPT (DSM-IV-TR TEPT Criterian D / E 13), (2) mejorar la corticosterona plasmática (CORT) durante varios días, lo que indica un compromiso del eje hypothalamopituitary (HPA), y (3) retraso body el aumento de peso después de dejar estresante, lo que indica una disfunción de la regulación metabólica.
Los paradigmas experimentales empleados para este modelo son: (1) un paradigma de desamparo aprendido en la rata ensayada por la medición de la respuesta de sobresalto acústico (ASR) y una cartografía de la masa corporal, (2) la microdisección del cerebro de rata en regiones y núcleos; ( 3) ligado a enzimas (ELISA) para los niveles sanguíneos de CORT, (4) un microarray de la expresión génica, más relacionada con herramientas de bioinformática 18. Este microarray, apodado rMNChip, se centra en los genes nucleares y mitocondriales mitocondrias vinculadas en la rata con el fin de abordar específicamente la bioenergética neuronales hipótesis de participar en el TEPT.
Protocol
1. Comportamiento Animal Modelo de TEPT
- Sujetos: albinas machos de ratas Sprague Dawley (Taconic Farms, Derwood, MD) se utilizan, la ponderación 150 a 200 g en el momento de la administración del protocolo de estrés.
- La medición de la ingesta de alimentos, agua y ganancia de peso corporal: A su llegada a las ratas de laboratorio peso de 100 ± 25 g se encuentran dos en una jaula (tamaño de la jaula: 45x24x20 cm). Sustrato Jaula relleno (astillas de madera) se cambian dos veces por semana. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz invertido de 12 horas (luces encendidas: 1800/0600 y se apaga: desde 0.600 hasta 1800) en una temperatura de (22 ± 4 ° C) - y la humedad relativa (30-70%)-ambiente controlado una semana antes de los experimentos. Agua y peletizado estándar chow (Harlan (2018) 18% de roedores dieta de proteínas, las dietas globales, Harlan Teklad) están disponibles gratuitamente en las jaulas de interior y pesos corporales se registran diariamente 3 días antes, durante 3 días y 3 días después de la cesación de estrés .
- Aclimatación: Las ratas se aclimataron durante tres días a boª de la instalación para animales y una cámara de sobresalto acústico. Para aclimatarse a la cámara de sobresalto acústico, los animales se manejan en ella durante 5 min cada día durante tres días consecutivos antes de las mediciones iniciales.
- Destacó protocolo: Los animales son igualmente asignados a cada grupo en función de su peso corporal y la respuesta de sobresalto inicial. La prueba se realiza en dos grupos de animales, cada grupo consiste de 16 animales. Grupo 1 recibe el protocolo de estrés, y el Grupo 2 es el control.
El protocolo de la exposición al estrés es una continua de 2-hr procedimiento, en el que cada sesión consta de restricción ("ineludible") y la cola choques-, repite una vez al día durante 3 días consecutivos. Destacando que se hace en la mañana (dentro de la ventana de 0800 y 1200). Animales se restringen al ser inmovilizado en un tubo de plexiglás ventilado. Cuarenta descargas eléctricas (2 mA, 3 segundos de duración, prueba de Animal Jaula Shocker suelo de rejilla, Instrumentos Coulbourn, EE.UU.) se entregan a la cola en semi-aleatorios intervalos de 150 to 210 sec (software gráfico de notación Estado, Habitest Enlace Universal, Coulbourn Instruments, EE.UU.). La estimulación a 2 mA fue elegido porque resulta repulsiva, pero no doloroso, cuando la salida de estimulación se coloca a través de los dedos del experimentador. Gel de electrodo se aplica usando Q-punta para formar una capa delgada de gel conductor entre el electrodo y la piel de la cola de la rata. Los clips para electrodos están ajustados y conectados a la cola para asegurar una buena conexión sin afectar a la circulación de la sangre de la cola. - Acústica Respuesta sorpresiva (ASR): Medición Acústica respuesta de sobresalto se llevó a cabo con un sistema de análisis de la respuesta de sobresalto acústico (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, EE.UU.) 3. Este sistema consiste en plataformas sensibles al peso en una cámara de sonido atenuado. El transductor, que es un indicador de tensión, en cada una de las plataformas de sobresalto requiere calibración antes de su uso. En primer lugar, el acoplador debe estar en el modo de acoplamiento de DC para la calibración. En este modo, el acoplador de salida de didirectamente sigue a la entrada de la plataforma, el modo de disposición de la calibración con pesos estáticos. El transductor se cambia al modo de acoplamiento de CA durante los experimentos de modo que sólo el cambio rápido de la fuerza, lo que indica una respuesta de sobresalto, es la salida. Los movimientos de los animales en respuesta a estímulos de sonido se mide así como un cambio de voltaje por un medidor de deformación en el interior de cada plataforma y se registró como la respuesta máxima ocurre dentro de 200 ms de la aparición del estímulo de sobresalto inductora.
Hay seis tipos de ensayos de estímulo: 100 dB solo, 100 dB con pre-pulso, 110 dB solo, 110 dB con pre-pulso, solo pre-pulso y sin control de estímulo. Cada tipo de prueba se presentó en ocho ocasiones. Tipos de prueba se presentan en orden aleatorio para evitar los efectos del orden y la habituación. Entre las pruebas intervalos variar aleatoriamente 15 a 25 seg. Entre los ocho ensayos sólo los valores máximos se recogen en los resultados y, finalmente, ajustar con el peso corporal del animal del mismo día. Los animales se ponen a prueba un día bntes de estrés u otro tratamiento como una lectura de referencia y 1, 7, 14 y 21 días después del último día de los 3 días consecutivos del procedimiento de estrés u otro tratamiento. - Análisis de datos:
- ASR: La amplitud de la respuesta de sobresalto acústico prueba cada vez que se representa como "% de línea de base", que se calcula utilizando la ecuación:% de línea base = (absoluta amplitud / amplitud absoluta de referencia) x 100%. Para cada día de la prueba, ANOVAs de medidas repetidas se realizan en amplitudes de sobresalto con factores de estrés y el estado de la dosis del fármaco con el programa SPSS (versión 16) software. Pruebas de Tukey, Bonferroni o Dunnett se utilizan para evaluar significativos post hoc de las diferencias entre los grupos individuales. Los datos se representan como media ± SEM
- Crecimiento: El peso corporal y el consumo de alimentos y agua se miden en el día -1 estrés anterior y en los días 14, 21 y 30 después de completar el protocolo de estrés. Análisis estadístico: Los datos de consumo de alimentos y agua se somete a unforma de medidas repetidas análisis de la varianza (ANOVA). Para analizar los cambios en la tasa de consumo de alimentos a través del tiempo, la cantidad de ingesta de alimentos se divide por el peso corporal del sujeto para minimizar la varianza en el peso corporal inducida por el protocolo de estrés y la diferencia inicial en el peso corporal entre los grupos. Todos los procedimientos se realizan bajo la aprobación de conformidad con el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión (IACUC).
2. Disección del cerebro
- Instrumentos y Materiales:
- Jar Anestesia: ". Tarro condimento" Se trata de un frasco de vidrio con tapa, de unos 6 centímetros de alto y 5 pulgadas de diámetro, como un "frasco de boticario", "jarra bola de algodón", o
- Guillotina para las ratas, como la suministrada por Kent Científico.
- Vibratome 1000:
- Cortar la hoja de afeitar en la mitad longitudinalmente, lave el aceite con alcohol, anotar en la abrazadera.
- Rellene baño con hielo picado ordinaria.
- Lugarla bandeja longitudinalmente.
- Limpie la bandeja de humedad antes de colocar una gota de cianoacrilato.
- Rongeurs (los ejemplos son un Micro Friedman pinzas gubias de Miltex, cat. No. 17-4801 o unas pinzas gubias de Pearson Ciencia Fine gato Herramientas. No 16.015-17).
- # 3 o # 5 joyeros pinzas (en punto de sacar dura).
- Pequeñas tijeras con puntas afiladas (Vantage V95-304 es un ejemplo).
- (2) Apartamento de mini espátulas de acero inoxidable, tal como se utiliza para transferir productos químicos en polvo a una balanza. El extremo ancho está inclinada hacia adelante a fin de encajar entre telencéfalo y calota.
- Cuchara para transferir bloques cerebro. (Una cuchara de sopa de plástico de la cafetería funciona bien.)
- Bisturí # 10.
- Borde doble hoja de afeitar (acero al carbono):
- La mitad de Vibratome.
- La mitad para la disección.
- Dos placas de Petri de vidrio, ~ 3,5 pulgadas y 4 pulgadas de diámetro, de manera que uno se ajuste dentro del otro. Hielo picado en el bottom plato. Dos filtros de papel en el plato superior. Mover rebanada a las posiciones requeridas desplazando el papel de filtro.
- 100 ml vaso de precipitados.
- Cuentagotas para irrigar el cerebro con hielo enfría un líquido cefalorraquídeo. (Pipeta Pasteur de vidrio con el extremo estrecho insertado en 1/2 pulgada de ancho bulbo de látex de caucho funciona bien.)
- Aplastado bandeja de hielo: Cerca de 5 centímetros de alto, 20 pulgadas de largo, 10 pulgadas de ancho. Contiene:
- Pegue todos los instrumentos en el hielo picado.
- Bajo de calcio / magnesio de alta LCRa en botella de plástico que se pueden golpeó para romper el hielo.
- Cianoacrilato.
- Calcio bajo / alto artificial magnesio líquido cefalorraquídeo (ACSF):
- En mm: 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2 2H 2 O *, 2,0 MgCl 2 * 6 H 2 0, 1,2 NaH 2 PO 4 * H 2 O, 25 NaHCO, 11 de Glucosa.
- En botella de plástico que puede ser golpeado para romper el hielo.
- Chill durante 20 minutos a -80 ° C congelador para convertirlo en un granizado.
- Hisopos de algodón.
- Filtro de papel: 42,5 mm Whatman (Cat. n º 1001 042.).
- Mini tubos de centrifugación para recoger pequeñas secciones de tejido.
- Pocillos de la placa para recoger estructuras más grandes y secciones de tejido.
- Papel toalla.
- Bolso del biohazard rojo.
- Anestesia:
- Tarro anestesia, almohadillas de gasa, fórceps isoflurano, de metal, se colocan en una campana de humos.
- Rata se coloca en el vaso de la anestesia.
- Humedezca una gasa con isoflurano y el lugar en el tarro de la anestesia.
- Esperar hasta que el pedal reflejo - la retirada de la pata cuando la banda se pellizca con fórceps - o desaparece reflejo corneal.
- Decapita: Agarrando rata con una mano alrededor de tórax por detrás, decapitar rata con guillotina, tan cerca del occipucio como sea posible. El atlas todavía suelen permanecer unido al cráneo.
- Extracción de sangre: rata Squeeze en el tórax para evitar que la sangre brotaba de las arterias carótidas.Gradualmente relajarse agarre con el fin de controlar el flujo de sangre en el contenedor de recogida.
- La eliminación del cerebro:
- Rápidamente cortó los músculos y las vértebras cualquier remanente de distancia del basiocciput con la tijera pequeña.
- Con gubia y el comienzo en el agujero magno, cortar los cóndilos occipitales y basiocciput el.
- Línea media incisión del cuero cabelludo con bisturí.
- Con las tijeras, corta una incisión sagital medio en los huesos occipital y parietal. Agarrando el margen de corte del cráneo con las gubias, lo rompe de nuevo como una cáscara de huevo de la línea media, con cuidado para reducir al mínimo el contacto con el cerebro. El corte de la línea media y la ruptura de regreso puede hacerse por etapas.
- Como el cerebro está más expuesto, es crítico para sofocar con aCSF hielo refrigerada para preservar la integridad y la vitalidad del tejido.
- Del mismo modo romper los huesos temporal y frontal.
- Con unas pinzas finas, arrancar la duramadre, el asegurarse de obtener latentorum cerebelo.
- Con espátula mini inserta bajo el lóbulo frontal elevar el cerebro de la bóveda craneal justo lo suficiente para ejercer tensión sobre los nervios craneales.
- Corte transversal de los nervios craneales con la tijera.
- Levante el cerebro por completo del cráneo y la dejó caer en el vaso con hielo bajo de calcio / magnesio LCRa alta. Deja un minuto o más para enfriar de modo que el tejido será sólido, las estructuras claramente visibles, y la salud del tejido se mantendrá.
- Con la cuchara de plástico, transferir el cerebro en el papel de filtro en la placa de Petri hielo refrigerada, lado ventral hacia arriba.
- La disección del cerebro:
- Hacer una transección coronal con hoja de afeitar en la arteria cerebral media (Figura 2A).
- Guardar lóbulo frontal temporalmente en el hielo frío baja de calcio / magnesio LCRa alta en el vaso de 100 ml.
- Voltear cerebro de manera que la superficie dorsal está arriba. Seccionar el tronco cerebral en la unión del mesencéfalo unnd diencaphalon. El bloque resultante cerebro se ve en la Figura 2B.
- Deja atrás el cerebro bloqueado en calcio helado bajo / LCRa alto contenido en magnesio.
- El uso de mini espátulas, diseccionar cerebelo de médula / Pons. Guardar en el medio adecuado para el análisis previsto.
- Devolver el cerebro comandos a la placa de Petri. El uso de dos filtros de papel, levante el cerebro mediante la colocación de un filtro de papel en la ventral. Con ello, colocar el plano posterior coronal del cerebro comandos en el borde del papel de filtro segundo. Con este lugar el papel de filtro plano de corte anterior del cerebro comandos sobre una gota de cianoacrilato en la placa de corte Vibratome, corteza frente a la cuchilla.
- Con el Vibratome, cortado justo lo suficiente del cerebro caudal de modo que los espectáculos hippcampus (Figura 2C).
- Toma una sección, 2.400 μ de espesor en una rata de 125 g, 2.700 μ de espesor en 200 g de rata. Transferencia de la sección utilizando un hisopo de algodón en los papeles de filtro en la placa de Petri(Figura 2D).
- Cortar y guardar corteza cingulada con la cuchilla de afeitar.
- Con una espátula dental, empujar en el borde distal del cuerpo calloso para cortarlo, luego retire la isocortex.
- Desde su margen ventolateral, retire el hipocampo (Figura 2E).
- Guarde el cerebro medio.
- Tome una segunda sección, a 2.400 m de espesor en 120 g de rata, 2.500 m de espesor en 200 g de rata. Coloque la sección sobre los papeles de filtro en la placa de Petri (Figura 2F). Alternativamente, cinco secciones 500 micras podrían adoptarse en este punto para electrofisiología.
- Cortar y guardar corteza cingulada con la cuchilla de afeitar.
- Hacer cortes laterales con la hoja de afeitar en el interior de la cápsula para eliminar el isocortex (Figura 2F).
- Hacer cortes oblicuos con la cuchilla de afeitar para eliminar el amygdali (Figura 2F, G).
- Hacer una caja de corte con la cuchilla de afeitar para eliminar el hipotálamo. El lateralcortes son lateralmente respecto al núcleo ventromedial del hipotálamo, que es visible. Hacemos el corte dorsal justo por encima del tercer ventrículo o el área ventral tegmental (Figura 2H).
- Empuje espátula en el cuerpo calloso y tirar el trozo pequeño de isocortex unido al hipocampo. Coloque el extremo estrecho de la espátula ventral a la comisura del hipocampo dorsal y criar a lograr el hipocampo.
- Preservación de ARN y de proteínas en muestras de tejido cerebral y sangre:
- Medios para la detección de ARN:
- Cerebro: RNAlater ARN reactivo de estabilización, # 76106 en tubos Eppendorf.
- Sangre: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
- Medios para la proteína (CORT) ensayo de la sangre: la solución de d-HBSS, w / o Ca2 + y Mg 2 +, (Calidad Biológica, Inc).
- Almacenamiento:
- Tejido recogido cerebro se almacena primero en una cesta de hielo seco durante no más de 12 horas y a continuación en un congelador a -70 º Cpara su uso dentro de los 6 meses, la duración del estudio.
- La sangre recogida se mantuvo a temperatura ambiente durante la noche para permitir que los reactivos para penetrar, después de lo cual se almacena en un congelador a -70 ° C para su uso dentro de los 6 meses, la duración del estudio.
- Medios para la detección de ARN:
3. Microarray Gene de genes nucleares y mitocondriales Las mitocondrias relacionados
Para el estudio de las funciones mitocondriales de rata en los tejidos cerebrales, recientemente se ha desarrollado la rata mitocondria neuronal centrado microarrays (rMNChip) y herramientas bioinformáticas para la identificación rápida de las vías diferenciales en 18 tejidos cerebrales. rMNChip contiene 1.500 genes implicados en las funciones mitocondriales, la respuesta de estrés, los ritmos circadianos y transducción de señal. La herramienta bioinformática incluye un algoritmo para la computación de los genes expresados diferencialmente, y una base de datos para la interpretación sencilla e intuitiva para resultados de los microarrays.
- Purificationen de RNA total de tejidos (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
- Tejidos de cerebro de rata de núcleo específico en el ARN después de ARN reactivo de estabilización (Qiagen).
- Tejido (30 mg en 600 l GPM-L / tampón B) homogeneización con Ultra-Turrax T8 en Dispergierstation (IKA Labortechnik).
- Centrifugar en 1,5-ml en tubos Sorvall 21.000 rpm durante 15 min.
- Decantar el sobrenadante en una columna de centrifugación con un tubo de recogida de 2 ml.
- Centrifugar los tubos de columna a 15.000 rpm durante 3 min, desechar el flujo a través.
- Añadir 700 l GPM-B / W tampón a cada una de las columnas de centrifugado, centrifugar los tubos de columna a 16.000 rpm durante 15 segundos, desechar el flujo a través.
- Añadir 500 l GPM-W tampón a cada una de las columnas de centrifugado, centrifugar los tubos de columna a 16.000 rpm durante 15 segundos, repetir una vez.
- Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml.
- Añadir 30 l agua tratada con DEPC a cada una de las columnas de centrifugado, se centrifuga a 16.000 rpm durante1 min, repita una vez.
- Medir la concentración de ARN, ajustar la concentración a 1 mg / l con DNasa y RNasa libre de agua, las muestras están listas para el etiquetado de microarrays.
- Microarray etiquetado y la hibridación (N º de matriz 900, Genisphere):
- 1,0 g de rata ARN total se utiliza para la síntesis de cDNA microarray y etiquetado siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Microarray hibridación se lleva a cabo en un rMNChip a 65 ° C durante 12-16 h como se ha descrito previamente. 18
- Lavado hibridizada diapositivas de microarrays (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
Solución de lavado Volumen 20 X SSC 10% SDS ddH 2 O 0,5 X SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml hasta 500 ml 0,5 X SSC 500 ml 12,5 ml hasta 500 ml 0,1 X SSC 500 ml 2,5 ml hasta 500 ml 0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml hasta 500 ml
Durante el lavado de los portaobjetos deben estar protegidos de la luz. No deje portaobjetos secos cabo en cualquier fase.- Lavar los portaobjetos en 250 ml de solución 1 en un frasco de vidrio Recipientes (Cat #: 70312-20, Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA) a temperatura ambiente, agitando el frasco en una BioShaker (Molecular Technologies Inc., St. Louis, MO ) hasta que todas las hojas de la cubierta caen de los portaobjetos de vidrio (se tarda <3 minutos).
- Lavar los portaobjetos con 250-ml Solución 2 en otro frasco agitando el frasco durante 3 min.
- Lavar los portaobjetos con 250 ml de solución 3en otro frasco girando el tarro durante 3 min, repitiendo este paso dos veces.
- Lavar los portaobjetos con 250 ml de solución 4 en otro frasco durante 10 segundos. Inmediatamente secar los portaobjetos mediante la centrifugación de los frascos colocados en las placas PN11779 y el rotor ST-H750 en un Sorvall Súper T21 centrifugar a 1.000 rpm durante 5 min.
- Colocar los portaobjetos lavados en una caja para la digitalización tan pronto como sea posible.
- Microarray análisis y análisis de imágenes usando ScanArray Express Microarray Scanner (PerkinElmer) siguiendo el manual de instrucciones y se centran en:
- Microarray exploración de la imagen: escaneado fácil vs escaneo protocolo.
- Efectos de LASER métodos de alimentación, PMT y normalización de datos sobre los resultados.
- Alineación del archivo GAL en la imagen.
- Alineación de los puntos a redes con precisión.
- Análisis de datos: Los procedimientos personalizados computacionales para el análisis de microarray de datos incluyen la evaluación de microarrays de imagen, filtrado de datos, corrección de tamaño del punto, la inclusión, normalization y la comparación como se ha descrito previamente 18. Además, los métodos para el análisis de la ontología, la vía y de la red son los mismos como se ha descrito anteriormente con el fin de asegurar la generación de resultados de microarrays reproducibles y verificables 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.
4. La sangre recogida de muestras y medición de la concentración plasmática CORT
- Muestras de la cola pre-o post-tensión de sangre de los animales anestesiados se recogen en el día-1, 14, 21 y 30 en tubos heparinizados para la determinación de los niveles circulantes de Cort.
- Muestras de troncales de sangre también se recogieron en tubos heparinizados después los animales son sacrificados. El plasma se extrajo y se almacenaron a -70 ° C hasta su análisis.
- Medios para la extracción de plasma:
- Las muestras de sangre para la extracción de RNA se recogen usando PAXgene Blood RNA tubos (PreAnalytix, Quagen)
- Las muestras de sangre para la extracción de ADN se obtuvieron utilizando PAXgene tubos de ADN de sangre (PreAnalytix, Quagen). Las muestras de sangre para análisis de proteínas se recogen usando litio heparina tubo capilar Collection (200 l) de MaketLab # ML5601.
- La concentración plasmática de CORT se prueba y se analizaron con Active Rat Cort EIA (Diagnostic Systems Labs Inc. http://www.beckmancoulter.com/ ) como sigue:
- Marcar las tiras de microtitulación a usar.
- Preparar Rat CORT solución de conjugado de enzima diluyendo Rat CORT concentrado de conjugado de enzima en el diluyente del conjugado.
- 25 de Pipeta Normas mu l, controles y muestras en los pozos.
- Añadir una solución de 100 l de conjugado de enzima en cada pocillo utilizando un dispensador semiautomático. Golpee suavemente el porta bien 5-10 segundos.
- Añadir 100 ml de antisuero de rata CORT a cada pocillo empleando un dispensador semiautomático.
- Incubar los pocillos a temperatura ambiente, 25 ° C, en un conjunto agitador a 500-700 rpm durante 60 min.
- Aspirar y lavar cada well 5 veces con solución de lavado utilizando un lavador de microplacas automático. Secar por inversión de la placa con material absorbente.
- Añadir 100 l de la solución de cromógeno TMB a cada pocillo usando un dosificador semiautomático.
- Incubar a 15-20 min a temperatura ambiente en un agitador orbital de microplacas ajustado a 500-700 rpm. Observe el cambio de color.
- Añadir 100 l solución de parada a cada pocillo empleando un dispensador semiautomático.
- Agitar la placa con la mano 5-10 segundos.
- Leer la absorbancia de la solución en el pozo dentro de 30 min.
- Filtro se establece en 450 nm. * Los juegos de la EIA también se pueden comprar en los Laboratorios Inmunobiológicos ( www.ibl-america.com ).
5. Los resultados representativos
Las ratas Figura 1. Son restringidos y expuestos a golpes de cola. Peso corporal subsiguiente, La concentración de corticosterona plasmática, y la respuesta de sobresalto acústico se miden A:. Exposición al estrés: los animales son restringidos por estar inmovilizada en un tubo de plexiglás ventilado. Cuarenta descargas eléctricas (2 mA, 3 segundos de duración ;) se entregan a la cola en semi-aleatorios intervalos de 150 a 210 seg B y C:. Estrés retarda ganancia en el peso corporal durante el crecimiento: Peso corporal y consumo de alimentos y agua se miden inmediatamente antes de estrés (día -3), en el día de los tres días de tensión y luego cada dos días después de allí hasta el día 14. La falta de aumento de peso corporal durante el estrés nunca se compensa D:.. Estrés aumenta la concentración plasmática de corticosterona E: sobresalto acústico: Los animales se probó un día antes de estrés (día-1) como una lectura de referencia y 12 días después del último día de los 3 días consecutivos de la tensión. Los datos para cada grupo - estrés y control - se expresan como porcentaje de acústicarefleja hacia el día 12 con relación al día -1. El estrés aumenta notablemente el reflejo de sobresalto acústico. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2 La disección de la amígdala, el hipocampo y el hipotálamo del cerebro rebanada A:.. Cerebro de rata, vista ventral: Las flechas apuntan a las arterias cerebrales medias B:. El bloque de cerebro, vista ventral, listo para ser transportado a la Vibratome. C: El bloque de cerebro pegados a la bandeja de vibratome, lado caudal hasta, corteza frente a la cuchilla. El cerebro caudal ya ha sido cortada la exposición del hipocampo caudal. El bloque está ahora listo para los 2.500 m rebanada contiene la mayor parte del hipocampo a tomar D:. La rebanada 2.500 micras de espesor que contiene el hipocampo caudal E:. Tél isocortex (ISO) se despega del hipocampo (HC) y el hipocampo pelado desde el cerebro medio F:.. La rebanada 2.500 micras de espesor que contiene la amígdala y el hipocampo rostral G: El isocortex se ha escindido y el resecado amígdala (Amyg) . H:. El hipotálamo (HT) se escindió y desplazados Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Niveles de expresión de ARNm del receptor de glucocorticoides (GR) y receptor minerocorticoid (MR) en la amígdala, el hipocampo, el hipotálamo, la corteza frontal y antes de (C, control) y después (Str) cola-shock estrés. Las unidades son parte del control y las barras de SEM A: Amígdala: El estrés disminuye la expresión de ARNm del receptor minerocorticoid B: Hippocampus: increa Estrés.ses minerocorticoid expresión ARNm del receptor C:. Hipotálamo:. estrés aumenta la expresión de ARNm del receptor D minerocorticoid: corteza frontal: El estrés disminuye la expresión de ARNm del receptor de glucocorticoides, así como la expresión de mRNA de receptor de minerocorticoid.
| Los cebadores (121bp) de PCR para GR rata son: | 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC |
| El (99 pb) cebadores de PCR para la rata MR son: | 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT |
Cluster Figura 4. Mapa de calor y de ARN expresados diferencialmente de 64 genes derivados de 5 tejidos de cerebro de rata, incluyendo el cerebelo (CL), cerebro (CR), corteza frontal (FC), hipotálamo (HT), y el hipocampo (HC). Mapa de color indica los cambios veces en dpropio-(verde) y hacia arriba (rojo) genes expresados. (A) Cluster y mapa de calor de las intensidades de señal normalizadas de 9 mediciones para cada uno de los 64 genes derivados de 15 experimentos de microarrays para estos tejidos cerebrales cinco. La expresión de cada gen se midió por triplicado y tresillos técnicas experimentales. (B) Cluster y mapa de calor de los niveles medios de ARN de estos 9 mediciones de cada uno de los 64 genes. Estos resultados muestran claras diferencias en la expresión génica mitocondrial y funciones relacionadas, por lo tanto, que apoyan nuestra hipótesis de que diferentes regiones del cerebro tienen diferentes demandas energéticas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Nuestra aplicación de la rMNChip y herramientas bioinformáticas condujo a la identificación de un clúster y mapa de calor de 64 genes expresados diferencialmente con ARN derivados de 5 tejidos de cerebro de rata, incluyendo el cerebelo (CL), cerebro (CR), corteza frontal (FC), hipotálamolamus (HT), y el hipocampo (HC) (Figura 4). Estos datos demuestran claras diferencias en la expresión génica mitocondrial y por lo tanto las funciones relacionadas. Los resultados demuestran que las diferentes regiones del cerebro exigir cantidad diferente de energía con el fin de llevar a cabo las funciones correspondientes del cerebro.
Discussion
El diagnóstico de trastorno de estrés postraumático se basa en la libre informado de síntomas psiquiátricos (DSM IV) por los sujetos potenciales. No biomarcador bien definida está disponible actualmente para acceder al estado fisiopatológico de los pacientes con trastorno de estrés postraumático potencial. El TEPT es un trastorno provocado por eventos traumáticos en peligro la vida y los síntomas psiquiátricos principales siguen presentes en la vida del sobreviviente durante meses e incluso años después de los acontecimientos iniciales. Los síntomas más prominentes y persistentes revelados en los pacientes con trastorno de estrés postraumático son hipervigilancia, respuestas exageradas de sobresalto retardado 14, 15, 16 y un compromiso claro del eje HPA. En los seres humanos estos síntomas permanecen, o aparecen con un retraso de tres meses, después del cese de la estresante traumático 24. Nuestro actual modelo de estudios de biomarcadores de estrés postraumático emplea moderación y choques repetidos cola durante tres días consecutivos (2-hr sesiones de 40, 2 tailshocks MA) - la inevitable cola-shock modelo (ITS) en ratas un peso de 150 gramos. Este modelo cuenta con ITSha demostrado que imitan en una medida considerable la fisiopatología de TEPT 17, 7, 4, 10. Nuestro laboratorio y otros laboratorios han verificado que la de su modelo de estrés en ratas induce alteraciones conductuales y neurobiológicos que son similares a los encontrados en el TEPT temas 17, 7, 10, 9. Específicamente, estas ratas estresadas muestran (1) una respuesta de sobresalto retardada y exagerada aparecer varios días después de la cesación de estrés, que dada la escala de tiempo comprimido de la vida de la rata en comparación con un ser humano, corresponde al retardo de uno a tres meses de los síntomas en pacientes con TEPT (DSM-IV-TR TEPT Criterian D / E 13), (2) mejorar la corticosterona plasmática (CORT) para varios (10) días, lo que indica un compromiso del eje hypothalamopituitary (HPA), y (3) la ganancia de peso corporal retrasado después de estrés cese, correspondiente a la disfunción de la regulación metabólica de estrés postraumático. No hay evidencia en la literatura que el olor del zorro, la exposición depredador, o temen la respuesta de sobresalto potenciada, exhipoco estos fenotipos conductuales persistentes y neuroendocrinologic asociada con trastorno de estrés postraumático.
Las ratas expuestas a una sola sesión de estrés (1DS) han mostrado transitoria, pero no las anormalidades persistentes mostrados por 3DS ratas 17 El presente experimento se comparó la respuesta de sobresalto de 3DS y 1DS ratas 4, 7, y 10 días después del cese estresante. De acuerdo con trabajos previos, hizo hincapié en ratas mostraron elevados niveles plasmáticos basales de CORT el estrés del día primer post 17. Estos niveles de CORT fueron sensibles a la cantidad de exposición a estresores con niveles de CORT mayor en las ratas que en 3DS 1Ds ratas. En cuanto a la respuesta de sobresalto, las ratas 1Ds exhiben una respuesta de sobresalto exagerada estresante 7 días después, mientras que la sensibilización de sobresalto sólo aparece 10 días después de la estresante en ratas 3DS. Así, la aparición de una respuesta exagerada de sobresalto después de la cesación factor estresante parece estar relacionada con el número de exposiciones sesión de estrés. El modelo 3DS estresado pareceser útil para profundizar en la expresión alterada de los biomarcadores asociados con los síntomas de trastorno de estrés postraumático y los principales fenotipos mensurables de comportamiento asociados con el calendario siguiente a la cesación de la tensión. Resultados genómicos presentados proporcionan la prueba de principio para la aplicación de herramientas rMNChip y bioinformática para identificar las vías diferenciales, y biomarcadores de genes y proteínas, lo que facilitaría en gran medida en sistemas biológicos estudio y la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a los trastornos neurológicos complejos y multifactoriales, incluyendo trastorno de estrés postraumático.
Mientras que nuestro paradigma no ahondar en los aspectos cognitivos y aspectos de comportamiento más complejas de TEPT, observamos que los patrones de sueño alterado en su modelo 1 corresponden a la dificultad para conciliar y mantener el sueño y las pesadillas de los pacientes con TEPT 11 (DSM-IV-TR trastorno de estrés postraumático Criterio D 13), y las deficiencias en el aprendizaje de escape / evitación y el aprendizaje de una tarea en la apetitiva su modelo
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el CDMRP, USUHS Becas G188LE, G188MG y G188QC (para HL), y el Centro USUHS para el Estudio del Estrés Traumático.
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